引用本文： 陳寧, 貝朝涌, 蔣林彬, 粟謀, 徐威. 雙基因轉染BMSCs誘導成骨的研究進展. 中國修復重建外科雜志, 2014, 28(12): 1540-1543. doi: 10.7507/1002-1892.20140333 復制
基因工程是目前骨科研究中一種新興的技術手段，它以分子生物學為基礎，將一些細胞生長因子導入活的種子細胞，由此改變種子細胞的生物活性，并移植入宿主組織中，促進組織生長發育，加快損傷組織修復。目前已發現BMSCs可作為基因工程中的優質種子細胞，而如何使細胞因子發揮最大效率成為首要問題。近年研究發現雙基因轉染比單基因轉染具有更大優勢，因其可協同發揮兩者作用，更有效地誘導BMSCs成骨分化并促進損傷骨組織愈合。現對近年雙基因轉染BMSCs誘導成骨的研究現狀及進展作一總結。
1 BMSCs作為種子細胞的優勢
1.1 易于分離培養與擴增
骨髓腔中含有大量BMSCs，其來源廣泛。目前已有4種BMSCs分離培養技術：第1種是全骨髓貼壁培養篩選，是由Friedenstein于1974年建立，目前應用廣泛；此法雖可獲取大量細胞，但純度有所降低，必須進一步純化。第2種是密度梯度離心法，根據干細胞密度與其他細胞密度不同而設計，操作簡便。目前研究常結合以上兩種方法，提取細胞的效率和純度均較高。另外兩種方法為流式細胞儀鑒定法和免疫標記物磁珠分離法，這兩種方法費用較高且對細胞有損傷，目前已較少應用。
1.2 具有較強增殖和多向分化能力
BMSCs為貼壁增殖，在不同時期生長速度不同，為S型生長，對數生長期生長旺盛，繁殖速度快，體外培養條件下可分裂（38 ± 4）次，并能傳代至十幾代，直至細胞老化[1-2]。早期研究已發現BMSCs是來源于中胚層的細胞，它還具有一個特性，能在不同誘導條件下跨胚層向內胚層和外胚層組織分化，可向骨、軟骨、神經、肌肉、脂肪等組織分化[3-4]。
1.3 具有再生修復組織能力和低免疫應答反應
大量研究表明[5-10]，自體BMSCs移植可修復一些難愈合的皮膚傷口及潰瘍；促進大腦血管神經損傷后的再生；促進骨折修復再生；刺激受損心肌細胞增殖修復及調節宿主免疫功能。并且BMSCs很少表達CD34、CD38、CD45、CD11a、CD14等造血干細胞表面標志，也幾乎不表達能被T細胞識別攻擊的主要組織相容性復合體Ⅱ類抗原標志物以及共刺激分子CD80、CD86、CD40，所以BMSCs具有低免疫原性，能夠逃脫機體的免疫監控[11]，將其移植入宿主體內或人體內不會發生移植物抗宿主的免疫反應。
1.4 具有較高安全性
作為基因工程的種子細胞，其安全性也是一重要方面。有學者針對這方面進行了較完善研究[12]，結果表明干細胞在移植后有調控身體免疫的功能，并能抑制腫瘤細胞生長繁殖，并且在人體1 000例相關干細胞移植試驗中，未發現1例與BMSCs有關的腫瘤發生。國內相關研究提示，體外長期成骨誘導培養的人BMSCs，其染色體核型、端粒酶活性均未發生異常變化，在人體內也不具有致瘤性，符合作為組織工程種子細胞生物安全性的要求[13]。因此，BMSCs是一種理想的種子細胞和轉染載體。
2 BMSCs雙基因轉染研究進展
2.1 BMP-2與BMP-7雙基因轉染
骨組織的形成受多種細胞因子調控[14]，其中BMP的成骨作用尤其明顯。BMP是骨組織中的蛋白因子，來源于TGF-β家族，對骨組織的成骨、骨的生長發育及骨折愈合有極大促進作用；目前對BMP-2和BMP-7的研究比較深入。研究發現[15-16]，骨組織中若完全敲除內源性BMP-2基因，會使新生小鼠在2周內發生骨骼發育不全及自發性骨折，并隨年齡增長而加重，且骨膜祖細胞修復受損骨組織是由BMP-2啟動并控制，是骨修復和成骨過程中最關鍵的啟始因子。而BMP-7的成骨作用及維持軟骨細胞的增殖作用也十分明顯，BMP-7對BMSCs有誘導成骨及促進Ⅱ型膠原蛋白合成的能力[17]；有研究將BMP-7基因轉染至BMSCs，發現轉染后的BMSCs分化為成骨細胞后可顯著促進羊股骨缺損的骨修復及重建[18]。骨組織成骨一般是兩種或更多因子的復合作用，BMP-2和BMP-7雙基因的協同作用遠遠高于單基因的成骨作用。Qing等[19]將BMP-2與BMP-7雙基因聯合轉染入大鼠BMSCs中，發現轉染雙基因的細胞成骨分化程度明顯高于轉染單基因細胞。Bustos-Valenzuela等[20]應用基因芯片檢測技術發現，應用重組人BMP-2和重組人BMP-7后小鼠BMSCs分化為成骨細胞的成骨作用表達明顯增強。上述結果表明，BMP-2和BMP-7基因聯合轉染可明顯促進BMSCs誘導分化為成骨細胞，其成骨表達作用也明顯增強，效果優于單基因作用。表明BMP在成骨方面并不是單一因子的作用，而是兩種因子互相促進的結果。
2.2 VEGF與BMP-2雙基因轉染
雖然BMP的成骨作用明顯，但骨組織生成中血管生長也非常重要。在所有促血管生長因子中，VEGF是最重要的因子，它是血管內皮細胞中可與肝素相結合的特異性生長因子，可有效促進受損骨組織的血管生長，加快骨折恢復。Ishijima等[21]研究提示，基底膜聚糖通過調節VEGF濃度能夠促進骨軟骨基質重塑和軟骨內骨形成，從而加快骨組織的再生修復。Liu等[22]的研究將VEGF基因轉染入大鼠BMSCs內并移植入大鼠體內，發現其能夠提高細胞內分泌的活性ALP含量，形成具有微血管和骨突組織的軟骨細胞團，并有效促進組織工程骨血管化和異位成骨。因此有研究復合這兩種因子探討是否具有協同作用。Ramazanoglu等[23]將BMP-2和/或VEGF基因轉染入BMSCs，分為五組（分別為加入酸侵蝕的蓋面、仿生鈣蓋面、加入BMP-2的蓋面、加入VEGF的蓋面以及加入BMP-2與VEGF的蓋面），植入豬骨缺損表面，采用免疫組織化學分析及光鏡觀察發現BMP-2與VEGF雙基因組的成骨骨化程度和骨密度顯著高于單基因對照組，且骨基質蛋白的表達程度最高。Xiao等[24]將BMP-2和/或VEGF基因轉染入兔BMSCs并移植至兔骨缺損處，結果顯示轉染BMP-2與VEGF基因組的骨沉積率和骨血管化水平最高，骨缺損修復效果、骨化程度及骨愈合水平均優于任何單基因組。VEGF在骨形成過程中加快血管生成，并與BMP聯合作用促進骨的生長發育，并能增強成骨骨化，且骨基質蛋白的表達較單基因顯著增加，說明此兩種基因的協同作用優于單基因。
2.3 TGF-β與BMP-2/VEGF雙基因轉染
TGF-β是由轉化細胞分泌的一種蛋白因子，具有刺激正常細胞生長的作用。早期研究認為血小板是TGF-β最大來源，至1987年Sporn等[25]的免疫學定位研究發現，骨組織才是TGF-β的最大來源。Patil等[26]的研究發現，TGF-β有3種亞型因子（TGF-β1、β2、β3），在不同骨形成階段發揮作用。TGF-β1主要功能是合成類固醇并促進關節軟骨的血管生長，TGF-β2主要作用是促進軟骨形成，而TGF-β3的作用是合成前列腺素并促進軟骨的成熟，他們相互結合使TGF-β具有促進軟骨生長及發育成熟的功能。故有學者將TGF-β與BMP/VEGF雙基因轉染至BMSCs中，研究其是否具有成骨協同作用。Chen等[27]將TGF-β與BMP-2基因共同轉染入小鼠BMSCs內，發現這兩種基因在體內共同監管著骨形成的各個過程，促進成骨細胞分化和細胞外基質的生成。而Kuroda等[28]將TGF-β1與VEGF-A雙基因轉染入大鼠BMSCs內，發現轉染復合基因后可增加細胞的ALP活性，增強礦化結節形成并提升成骨表達作用，表明TGF-β1與VEGF-A具有協同成骨能力，促進成骨細胞分化。
2.4 IGF與BMP-2/BMP-9雙基因轉染
IGF是調節體內細胞生長發育及代謝的關鍵因子，研究者于1978年首先在血清中發現來源于肝臟的IGF，并于1980年證實人體幾乎所有組織都通過自分泌和旁分泌途徑分泌IGF-1[29]。有研究還發現IGF對BMSCs的增殖及分化也起到很大作用。Xian等[30]研究發現，缺少IGF-1基因的BMSCs不能分化為成骨細胞，而敲除IGF-1基因的小鼠其成骨細胞顯示較低的骨含量及礦物質沉積率。An等[31]將BMP-2與IGF雙基因轉染入兔BMSCs中，發現此兩種基因可誘導BMSCs分化成軟骨細胞，并且能分泌產生帶有低度間充質溶解素的Ⅱ型膠原蛋白，并在轉染部位發現軟骨結節的形成。Chen等[32]將IGF-2與BMP-9雙基因轉染入BMSCs中，發現IGF-2可顯著提高BMP-9早期成骨的ALP活性表達，促進BMSCs分化為成骨細胞，顯著增加BMP-9異位成骨的效果，也為骨缺損的治療探索了一種新思路。
2.5 FGF與BMP-2雙基因轉染
bFGF是來源于中胚層、可促進細胞有絲分裂的生長因子，其促分裂作用在眾多生長因子中是最強的；其中FGF-2亞型起到了至關重要的作用，其促進細胞有絲分裂的作用最強并能極大促進BMSCs的增殖，促進血管再生及血管內皮細胞生長，從而修復損傷的皮膚及骨組織[33]。Xiao等[34]研究表明，缺失FGF基因的大鼠骨質流失率顯著增加，骨密度也顯著下降，且FGF-2在誘導BMSCs向脂肪細胞或成骨細胞分化的過程中有著重要調控作用，并能促使損傷的成骨細胞修復。Hughes-Fulford等[35]將FGF-2與BMP-2雙基因轉染入成骨細胞中，發現在細胞生長早期FGF-2起到促進成骨細胞增殖的作用，而BMP-2則促進成骨細胞的骨化，并且雙基因轉染組的成骨效果優于單基因轉染組。國內也有研究[36]將人BMP-2與人bFGF雙基因轉染至BMSCs內，并與支架材料復合構建新型骨組織工程復合體，結果表明其成骨相關基因表達明顯高于單基因轉染組，能顯著促進BMSCs的成骨分化，表現出良好的體外成骨能力，從而驗證了這兩種因子有著協同誘導細胞成骨的作用。
2.6 PDGF與BMP-7/TGF-β雙基因轉染
PDGF是來源于血小板中的一種雙鏈多肽，屬于生長因子家族，但其獨立于多種正常組織與腫瘤組織之外，包括骨基質和骨肉瘤組織。PDGF在皮膚組織損傷修復、神經細胞發育與生長、胚胎發育、心臟血管生成及骨組織損傷修復方面具有重要作用。尤其在骨組織修復方面，PDGF可通過刺激傷口周圍BMSCs增加，誘導其向成骨分化并促進骨組織的再生與修復；其次，PDGF還有促進細胞有絲分裂的作用，激活內皮細胞分裂成毛細血管及巨噬細胞，間接促進骨組織修復；一些研究還發現PDGF通過作為細胞信號連接器促進BMSCs向成骨細胞的分化[37-38]。有研究者將PDGF與其他基因共轉染入BMSCs，觀察其是否具有誘導成骨的協同作用。Zhang等[39]將PDGF與BMP-7雙基因轉染入大鼠BMSCs中，發現細胞成骨分化增強，與支架材料復合后移植于大鼠骨質疏松部位，可顯著增強骨組織再生及修復能力，增加骨質骨化程度。Fierro等[40]將PDGF與TGF-β雙基因轉染入BMSCs內，發現轉染后的BMSCs成骨分化程度加強，能增強鈣沉積率及ALP活性。
3 問題與展望
BMSCs的雙基因轉染因能有效穩定釋放兩種具有協同作用的生長因子并作用于宿主體內，其效果明顯優于單基因轉染，在骨組織工程應用中具有較大發展前景。但由于BMSCs的成骨分化是由多種因子在不同階段共同作用的，如何選擇兩種因子或在不同成骨階段應用哪兩種或多種因子使其能最大程度發揮協同成骨作用，是目前亟待解決的問題。此外，目前轉基因技術尚存在缺陷與不足，使研究還面臨一些其他問題：如如何提高雙基因轉染效率，如何簡化轉染步驟，如何把握轉染雙基因的時機，轉染的雙基因是否與BMSCs發生相互影響等。隨著基因工程的逐漸發展，相信BMSCs的雙基因甚至多基因轉染將為骨科的臨床治療提供更廣闊思路。
基因工程是目前骨科研究中一種新興的技術手段，它以分子生物學為基礎，將一些細胞生長因子導入活的種子細胞，由此改變種子細胞的生物活性，并移植入宿主組織中，促進組織生長發育，加快損傷組織修復。目前已發現BMSCs可作為基因工程中的優質種子細胞，而如何使細胞因子發揮最大效率成為首要問題。近年研究發現雙基因轉染比單基因轉染具有更大優勢，因其可協同發揮兩者作用，更有效地誘導BMSCs成骨分化并促進損傷骨組織愈合。現對近年雙基因轉染BMSCs誘導成骨的研究現狀及進展作一總結。
1 BMSCs作為種子細胞的優勢
1.1 易于分離培養與擴增
骨髓腔中含有大量BMSCs，其來源廣泛。目前已有4種BMSCs分離培養技術：第1種是全骨髓貼壁培養篩選，是由Friedenstein于1974年建立，目前應用廣泛；此法雖可獲取大量細胞，但純度有所降低，必須進一步純化。第2種是密度梯度離心法，根據干細胞密度與其他細胞密度不同而設計，操作簡便。目前研究常結合以上兩種方法，提取細胞的效率和純度均較高。另外兩種方法為流式細胞儀鑒定法和免疫標記物磁珠分離法，這兩種方法費用較高且對細胞有損傷，目前已較少應用。
1.2 具有較強增殖和多向分化能力
BMSCs為貼壁增殖，在不同時期生長速度不同，為S型生長，對數生長期生長旺盛，繁殖速度快，體外培養條件下可分裂（38 ± 4）次，并能傳代至十幾代，直至細胞老化[1-2]。早期研究已發現BMSCs是來源于中胚層的細胞，它還具有一個特性，能在不同誘導條件下跨胚層向內胚層和外胚層組織分化，可向骨、軟骨、神經、肌肉、脂肪等組織分化[3-4]。
1.3 具有再生修復組織能力和低免疫應答反應
大量研究表明[5-10]，自體BMSCs移植可修復一些難愈合的皮膚傷口及潰瘍；促進大腦血管神經損傷后的再生；促進骨折修復再生；刺激受損心肌細胞增殖修復及調節宿主免疫功能。并且BMSCs很少表達CD34、CD38、CD45、CD11a、CD14等造血干細胞表面標志，也幾乎不表達能被T細胞識別攻擊的主要組織相容性復合體Ⅱ類抗原標志物以及共刺激分子CD80、CD86、CD40，所以BMSCs具有低免疫原性，能夠逃脫機體的免疫監控[11]，將其移植入宿主體內或人體內不會發生移植物抗宿主的免疫反應。
1.4 具有較高安全性
作為基因工程的種子細胞，其安全性也是一重要方面。有學者針對這方面進行了較完善研究[12]，結果表明干細胞在移植后有調控身體免疫的功能，并能抑制腫瘤細胞生長繁殖，并且在人體1 000例相關干細胞移植試驗中，未發現1例與BMSCs有關的腫瘤發生。國內相關研究提示，體外長期成骨誘導培養的人BMSCs，其染色體核型、端粒酶活性均未發生異常變化，在人體內也不具有致瘤性，符合作為組織工程種子細胞生物安全性的要求[13]。因此，BMSCs是一種理想的種子細胞和轉染載體。
2 BMSCs雙基因轉染研究進展
2.1 BMP-2與BMP-7雙基因轉染
骨組織的形成受多種細胞因子調控[14]，其中BMP的成骨作用尤其明顯。BMP是骨組織中的蛋白因子，來源于TGF-β家族，對骨組織的成骨、骨的生長發育及骨折愈合有極大促進作用；目前對BMP-2和BMP-7的研究比較深入。研究發現[15-16]，骨組織中若完全敲除內源性BMP-2基因，會使新生小鼠在2周內發生骨骼發育不全及自發性骨折，并隨年齡增長而加重，且骨膜祖細胞修復受損骨組織是由BMP-2啟動并控制，是骨修復和成骨過程中最關鍵的啟始因子。而BMP-7的成骨作用及維持軟骨細胞的增殖作用也十分明顯，BMP-7對BMSCs有誘導成骨及促進Ⅱ型膠原蛋白合成的能力[17]；有研究將BMP-7基因轉染至BMSCs，發現轉染后的BMSCs分化為成骨細胞后可顯著促進羊股骨缺損的骨修復及重建[18]。骨組織成骨一般是兩種或更多因子的復合作用，BMP-2和BMP-7雙基因的協同作用遠遠高于單基因的成骨作用。Qing等[19]將BMP-2與BMP-7雙基因聯合轉染入大鼠BMSCs中，發現轉染雙基因的細胞成骨分化程度明顯高于轉染單基因細胞。Bustos-Valenzuela等[20]應用基因芯片檢測技術發現，應用重組人BMP-2和重組人BMP-7后小鼠BMSCs分化為成骨細胞的成骨作用表達明顯增強。上述結果表明，BMP-2和BMP-7基因聯合轉染可明顯促進BMSCs誘導分化為成骨細胞，其成骨表達作用也明顯增強，效果優于單基因作用。表明BMP在成骨方面并不是單一因子的作用，而是兩種因子互相促進的結果。
2.2 VEGF與BMP-2雙基因轉染
雖然BMP的成骨作用明顯，但骨組織生成中血管生長也非常重要。在所有促血管生長因子中，VEGF是最重要的因子，它是血管內皮細胞中可與肝素相結合的特異性生長因子，可有效促進受損骨組織的血管生長，加快骨折恢復。Ishijima等[21]研究提示，基底膜聚糖通過調節VEGF濃度能夠促進骨軟骨基質重塑和軟骨內骨形成，從而加快骨組織的再生修復。Liu等[22]的研究將VEGF基因轉染入大鼠BMSCs內并移植入大鼠體內，發現其能夠提高細胞內分泌的活性ALP含量，形成具有微血管和骨突組織的軟骨細胞團，并有效促進組織工程骨血管化和異位成骨。因此有研究復合這兩種因子探討是否具有協同作用。Ramazanoglu等[23]將BMP-2和/或VEGF基因轉染入BMSCs，分為五組（分別為加入酸侵蝕的蓋面、仿生鈣蓋面、加入BMP-2的蓋面、加入VEGF的蓋面以及加入BMP-2與VEGF的蓋面），植入豬骨缺損表面，采用免疫組織化學分析及光鏡觀察發現BMP-2與VEGF雙基因組的成骨骨化程度和骨密度顯著高于單基因對照組，且骨基質蛋白的表達程度最高。Xiao等[24]將BMP-2和/或VEGF基因轉染入兔BMSCs并移植至兔骨缺損處，結果顯示轉染BMP-2與VEGF基因組的骨沉積率和骨血管化水平最高，骨缺損修復效果、骨化程度及骨愈合水平均優于任何單基因組。VEGF在骨形成過程中加快血管生成，并與BMP聯合作用促進骨的生長發育，并能增強成骨骨化，且骨基質蛋白的表達較單基因顯著增加，說明此兩種基因的協同作用優于單基因。
2.3 TGF-β與BMP-2/VEGF雙基因轉染
TGF-β是由轉化細胞分泌的一種蛋白因子，具有刺激正常細胞生長的作用。早期研究認為血小板是TGF-β最大來源，至1987年Sporn等[25]的免疫學定位研究發現，骨組織才是TGF-β的最大來源。Patil等[26]的研究發現，TGF-β有3種亞型因子（TGF-β1、β2、β3），在不同骨形成階段發揮作用。TGF-β1主要功能是合成類固醇并促進關節軟骨的血管生長，TGF-β2主要作用是促進軟骨形成，而TGF-β3的作用是合成前列腺素并促進軟骨的成熟，他們相互結合使TGF-β具有促進軟骨生長及發育成熟的功能。故有學者將TGF-β與BMP/VEGF雙基因轉染至BMSCs中，研究其是否具有成骨協同作用。Chen等[27]將TGF-β與BMP-2基因共同轉染入小鼠BMSCs內，發現這兩種基因在體內共同監管著骨形成的各個過程，促進成骨細胞分化和細胞外基質的生成。而Kuroda等[28]將TGF-β1與VEGF-A雙基因轉染入大鼠BMSCs內，發現轉染復合基因后可增加細胞的ALP活性，增強礦化結節形成并提升成骨表達作用，表明TGF-β1與VEGF-A具有協同成骨能力，促進成骨細胞分化。
2.4 IGF與BMP-2/BMP-9雙基因轉染
IGF是調節體內細胞生長發育及代謝的關鍵因子，研究者于1978年首先在血清中發現來源于肝臟的IGF，并于1980年證實人體幾乎所有組織都通過自分泌和旁分泌途徑分泌IGF-1[29]。有研究還發現IGF對BMSCs的增殖及分化也起到很大作用。Xian等[30]研究發現，缺少IGF-1基因的BMSCs不能分化為成骨細胞，而敲除IGF-1基因的小鼠其成骨細胞顯示較低的骨含量及礦物質沉積率。An等[31]將BMP-2與IGF雙基因轉染入兔BMSCs中，發現此兩種基因可誘導BMSCs分化成軟骨細胞，并且能分泌產生帶有低度間充質溶解素的Ⅱ型膠原蛋白，并在轉染部位發現軟骨結節的形成。Chen等[32]將IGF-2與BMP-9雙基因轉染入BMSCs中，發現IGF-2可顯著提高BMP-9早期成骨的ALP活性表達，促進BMSCs分化為成骨細胞，顯著增加BMP-9異位成骨的效果，也為骨缺損的治療探索了一種新思路。
2.5 FGF與BMP-2雙基因轉染
bFGF是來源于中胚層、可促進細胞有絲分裂的生長因子，其促分裂作用在眾多生長因子中是最強的；其中FGF-2亞型起到了至關重要的作用，其促進細胞有絲分裂的作用最強并能極大促進BMSCs的增殖，促進血管再生及血管內皮細胞生長，從而修復損傷的皮膚及骨組織[33]。Xiao等[34]研究表明，缺失FGF基因的大鼠骨質流失率顯著增加，骨密度也顯著下降，且FGF-2在誘導BMSCs向脂肪細胞或成骨細胞分化的過程中有著重要調控作用，并能促使損傷的成骨細胞修復。Hughes-Fulford等[35]將FGF-2與BMP-2雙基因轉染入成骨細胞中，發現在細胞生長早期FGF-2起到促進成骨細胞增殖的作用，而BMP-2則促進成骨細胞的骨化，并且雙基因轉染組的成骨效果優于單基因轉染組。國內也有研究[36]將人BMP-2與人bFGF雙基因轉染至BMSCs內，并與支架材料復合構建新型骨組織工程復合體，結果表明其成骨相關基因表達明顯高于單基因轉染組，能顯著促進BMSCs的成骨分化，表現出良好的體外成骨能力，從而驗證了這兩種因子有著協同誘導細胞成骨的作用。
2.6 PDGF與BMP-7/TGF-β雙基因轉染
PDGF是來源于血小板中的一種雙鏈多肽，屬于生長因子家族，但其獨立于多種正常組織與腫瘤組織之外，包括骨基質和骨肉瘤組織。PDGF在皮膚組織損傷修復、神經細胞發育與生長、胚胎發育、心臟血管生成及骨組織損傷修復方面具有重要作用。尤其在骨組織修復方面，PDGF可通過刺激傷口周圍BMSCs增加，誘導其向成骨分化并促進骨組織的再生與修復；其次，PDGF還有促進細胞有絲分裂的作用，激活內皮細胞分裂成毛細血管及巨噬細胞，間接促進骨組織修復；一些研究還發現PDGF通過作為細胞信號連接器促進BMSCs向成骨細胞的分化[37-38]。有研究者將PDGF與其他基因共轉染入BMSCs，觀察其是否具有誘導成骨的協同作用。Zhang等[39]將PDGF與BMP-7雙基因轉染入大鼠BMSCs中，發現細胞成骨分化增強，與支架材料復合后移植于大鼠骨質疏松部位，可顯著增強骨組織再生及修復能力，增加骨質骨化程度。Fierro等[40]將PDGF與TGF-β雙基因轉染入BMSCs內，發現轉染后的BMSCs成骨分化程度加強，能增強鈣沉積率及ALP活性。
3 問題與展望
BMSCs的雙基因轉染因能有效穩定釋放兩種具有協同作用的生長因子并作用于宿主體內，其效果明顯優于單基因轉染，在骨組織工程應用中具有較大發展前景。但由于BMSCs的成骨分化是由多種因子在不同階段共同作用的，如何選擇兩種因子或在不同成骨階段應用哪兩種或多種因子使其能最大程度發揮協同成骨作用，是目前亟待解決的問題。此外，目前轉基因技術尚存在缺陷與不足，使研究還面臨一些其他問題：如如何提高雙基因轉染效率，如何簡化轉染步驟，如何把握轉染雙基因的時機，轉染的雙基因是否與BMSCs發生相互影響等。隨著基因工程的逐漸發展，相信BMSCs的雙基因甚至多基因轉染將為骨科的臨床治療提供更廣闊思路。