引用本文： 周曉囡, 吳嫣爽, 雷蕾. 豬來源異種細胞移植臨床前研究進展. 中國修復重建外科雜志, 2014, 28(12): 1536-1539. doi: 10.7507/1002-1892.20140332 復制
細胞移植是將有功能的細胞植入人體內，以替代因退變、損傷、基因缺陷或自身免疫而毀損的細胞，從而達到治療疾病的目的。采用人自體或同種異體細胞移植來源有限，且存在倫理問題，豬來源的異種細胞為細胞移植提供了另一個選擇[1]。隨著新型免疫抑制劑、免疫隔離技術及轉基因豬[2]的誕生，豬來源異種細胞，包括神經細胞、胰島細胞、肝細胞和各種類型干細胞在細胞移植方面取得了顯著成果[1-5]。本文擬從普通體細胞和干細胞兩方面，對豬來源異種細胞移植臨床前研究進展作一總結。
1 普通體細胞的異種移植
1.1 異種神經細胞移植
細胞移植在治療帕金森病方面具有巨大潛力，其中采用人胎兒腦神經母細胞移植被認為是最有效方法，但受到倫理限制。豬與靈長類動物大腦體積相似，且來源豐富、易進行基因修飾，神經突長度也與人類神經元類似，被認為是最合適的異種神經細胞來源[6]。1997年Deacon等[7]對1例帕金森患者行右側紋狀體注入胎豬腦神經細胞懸液治療，患者在治療后7個月死于肺栓塞，經觀察其腦組織中發現了豬多巴胺能神經元及其他豬神經和神經膠質細胞，且豬神經元的軸突在宿主腦組織中有一定程度延伸。該研究首次用組織學方法證明了非人類多巴胺能神經元可在人腦中存在。
雖然動物學研究表明，與其他部位異種移植相比，宿主的大腦對異種移植物的排斥反應程度相對較低[8]，避免了急性排斥反應，但排斥反應仍然存在。目前隨著免疫抑制劑的應用和轉基因豬的誕生，T細胞介導的免疫排斥反應得到一定程度抑制。2007年Krystkowiak等[9]將人胎兒腦神經母細胞注入亨廷頓患者大腦后，患者出現體重下降、舞蹈癥惡化、步態不穩等癥狀，在排除其他原因后，懷疑為同種異體免疫排斥反應，在使用免疫抑制劑后，患者以上癥狀得到恢復。大腦內能發生同種異體免疫排斥反應，也可能發生異種移植免疫排斥反應，因此需要尋找可降低大腦免疫排斥反應的方法。2005年產生了一種在神經元特異烯醇化酶啟動子作用下表達hCTLA4-Ig（人細胞毒T淋巴細胞相關抗原4免疫球蛋白）免疫抑制劑蛋白的轉基因豬，抑制hCTLA4-Ig表達后，能相應抑制CD4+T細胞介導的免疫排斥反應[10]。2010年這種轉基因豬的中腦神經組織被植入帕金森猴模型的腦中，結果表明豬的中腦神經組織能在猴腦中存活，存活時間超過460 d[11]。
異種神經細胞移植已取得了很大進步，但距臨床應用還有一定距離。如果異種移植免疫排斥反應得到有效控制，將促進豬異種神經細胞在臨床的應用。
1.2 異種胰島細胞移植
糖尿病是嚴重威脅人類生命健康的疾病之一，至今尚無根治方法。1986年Ricordi發明了“半自動化胰島分離”的方法[12]；2000年Shapiro等[13]采用無糖皮質激素的免疫抑制方案對7例1型糖尿病患者經門靜脈移植人胰島細胞，移植后患者獲血糖水平穩定，并且脫離胰島素治療長達1年。但同種胰島細胞來源有限，限制了胰島細胞移植的臨床應用，因此人們將研究重點放在異種胰島細胞移植。自1893年首次報道異種胰島細胞移植開始，異種胰島細胞移植已有100多年歷史。異種胰島細胞供體來源主要有豬、牛、猴等，其中豬胰島素的氨基酸排列順序以及血糖調定點與人接近，胰島細胞來源充足，胰島細胞在含人新鮮血清的培養基中能很好地存活與增殖，因此豬胰島細胞被認為是最適合的移植供體[14]。豬胰島素已成功應用于臨床數十年，充分證明了其糾正糖尿病高血糖狀態的安全性和有效性。2006年Hering等[15]將豬胰島細胞經肝門靜脈注入糖尿病短尾獼猴體內，結果顯示猴體內可重新建立血糖控制機制逆轉糖尿病達100 d。α-1，3半乳糖轉移酶基因敲除（α-1，3-galactosyltransferase knockout，GTKO）豬和CTLA4-Ig豬出現后，從這些基因改造豬中獲得的胰島細胞抗原性明顯降低，避免了超急性免疫排斥反應和T細胞介導的免疫排斥反應發生，延長了豬胰島細胞在非人靈長類動物中存活時間[16-17]。
然而，豬來源的異種胰島細胞移植仍面臨很多問題，如進一步降低移植物的抗原性以減少免疫抑制劑用量，以及避免豬內源性逆轉錄病毒感染的可能性。為此人們采用免疫隔離方案如胰島微囊化技術來防止免疫排斥，在不使用免疫抑制劑的情況下延長移植胰島細胞的存活時間[18-21]。新型胰島細胞提取技術、免疫隔離技術和新的免疫抑制劑的出現，也加快了異種胰島細胞移植的發展速度。
1.3 異種肝細胞移植
目前肝細胞移植術已應用于臨床，是一種能有效治療終末期肝病和遺傳代謝性肝病的方法，也是等待原位肝移植的過渡性治療方法之一[22]。目前肝細胞的主要來源是不適于肝移植的肝臟[23]，以及作劈離式肝移植時，在保證劈離的2塊肝組織能滿足患者肝移植后，切取的第4肝段[24]。除人原代肝細胞外，異種肝細胞[25]也是來源之一，特別是豬來源肝細胞。2007年Nagata等[26]將豬肝細胞用1%海藻酸鈉制成細胞懸液，注入獼猴脾臟內，肝細胞最終存活了253 d。異種肝細胞移植存在的免疫排斥反應較大，除應用免疫抑制劑和轉基因豬外，也可使用微囊包被肝細胞進行輸注。微囊化的肝細胞能使細胞生長所需物質通過半透膜，而宿主的免疫細胞、免疫球蛋白及補體則不能通過，因此延長了肝細胞在宿主內存活時間，且避免了免疫排斥反應[27]。異種肝細胞移植可解決肝細胞來源短缺問題，但如何降低和避免免疫排斥反應和種間逆轉錄病毒的傳播仍需要深入研究。
2 異種干細胞移植
2.1 異種MSCs移植
目前臨床上進行的自體或同種異體MSCs移植，MSCs主要來自于人骨髓、臍帶血和脂肪等。由于移植所需MSCs數量較大，供體細胞無法滿足臨床需求[4]，故需尋找其他MSCs來源。研究表明人對GTKO豬MSCs的免疫排斥反應與對人MSCs免疫排斥反應類似[28-29]，如果將GTKO豬轉入人類的補體調節基因或免疫抑制基因，則會保護MSCs免受人類體液免疫和細胞免疫，在一定程度上避免了種間免疫排斥反應。截至2011年底共有94例關于異種MSCs移植的報道，其中88例（93.6%）移植成功[4]。這些研究結果表明MSCs是可以跨越種族屏障在異種體內存在。
2007年Nakamura等[30]將豬BMSCs在體外傳代培養至一定代次后，注入心肌梗死的非肥胖糖尿病/重癥聯合免疫缺陷（non-obese diabetic/severe combined immunodeficient，NOD/SCID）小鼠的梗死灶內，BMSCs在小鼠心肌梗死區內至少存活4周，左心室射血分數與梗死區注射生理鹽水的對照組相比有明顯改善。2008年Eguchi等[31]將豬髂骨來源的BMSCs聯合豬椎骨內骨髓細胞，共同注入經全身輻射的NOD/SCID小鼠雙側脛骨骨髓腔內，6周后小鼠骨髓異種嵌合率明顯高于僅注射骨髓細胞的對照組。說明BMSCs可在異種動物體內進行短暫移植，并改善其功能。豬來源MSCs是否能用于靈長類動物，目前尚缺乏有效的實驗數據證明，其可行性以及免疫排斥和種間病毒傳播等情況有待進一步研究。
2.2 異種造血干細胞移植
造血干細胞移植是指在患者接受超劑量化療或放療后，將各種來源的骨髓造血干細胞、外周血造血干細胞或臍帶血造血干細胞通過靜脈輸注移植入患者體內，重建被摧毀或已衰竭的造血及免疫功能。自1955年Thomas首先開展骨髓造血干細胞移植以來，該方法已廣泛用于血液病的臨床治療，已成為治療惡性血液病、重型再生障礙性貧血及部分實體瘤等疾病的最有效方法，但存在造血干細胞來源有限、數量少以及人類白細胞抗原匹配等問題。為進一步豐富造血干細胞的來源，人們進行了異種造血干細胞來源的探索。
1999年Sablinski等[32]首次嘗試將豬骨髓移植入恒河猴體內。術前所有猴均行脾切除和全身輻射，術后使用免疫抑制劑，其中1只猴同時靜脈輸注豬特異IL-3和干細胞生長因子；結果發現接受了IL-3和干細胞生長因子的猴在移植后180 d和302 d觀測到了細胞嵌合現象，而其余猴未見該現象。研究者認為細胞未能長期嵌合可能與豬造血祖細胞在猴體內成熟后表達半乳糖有關。2004年Tseng等[33]首次嘗試將GTKO豬骨髓移植入3只狒狒體內，其中1只狒狒于術后6 d因突發出血死亡，余2只狒狒分別于9～16 d和7～17 d在血液中檢測到少量豬細胞（< 1%），說明骨髓移植可能轉移；整個實驗過程中除了宿主對移植細胞的低反應性延長外，未發現長時間的移植嵌合。隨著新型免疫抑制劑的出現和轉基因豬的應用，有望使異種嵌合的效率和時間大大延長。
2.3 異種脂肪來源干細胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）移植
ADSCs易從脂肪組織中獲得，在體外具有穩定的擴增能力，并且在適當誘導條件下可分化為脂肪細胞、成骨細胞、軟骨細胞和肌細胞等。ADSCs因缺乏人類白細胞抗原-DR表達，能抑制異源活化的淋巴細胞增殖[34-35]和炎性因子產生，刺激抗炎性因子產生[36-37]等，已被證明有免疫特權。目前ADSCs被廣泛應用于再生醫學，如整形美容、心肌梗死、神經退行性疾病和骨組織缺陷等方面的研究，除了同種異體ADSCs移植外，研究者們也進行了異種移植研究[5]。因為相比人類自體或同種異體移植，異種移植脂肪來源更豐富，尤其是豬來源脂肪組織。
Lin等[5]將2012年之前有關ADSCs的異種移植研究進行了統計，發現有27例異種移植實驗是將人類ADSCs移植至非人類動物體內。其中2003年報道了首例異種ADSCs移植，研究者將人ADSCs移植入大腦缺血的大鼠腦組織內，發現大鼠神經功能有所改善[38]。2014年Ghasemi等[39]將人ADSCs移植入溶血卵磷脂所致的局部髓鞘病變大鼠脊髓內，大鼠運動功能有所改善，該研究結果表明人ADSCs能夠分化為少突膠質細胞，并促進髓鞘再生。2013年Zhu等[40]將豬ADSCs通過肝門靜脈移植入慢加急性肝衰竭模型的兔體內，結果表明ADSCs能延長兔存活時間，改善肝功能，并有分化為肝細胞的趨勢。
異種ADSCs由于易獲得、來源豐富、可重復強、免疫特權等優點得到了科學家的青睞，但是也存在很多問題需要解決[5]，如ADSCs無統一鑒別標準、ADSCs向神經系統分化還未明確等。
3 小結
異種細胞移植與同種細胞移植相比，雖然免疫排斥反應相應增加，但在來源和數量上具有較大優勢，可重復性強。尤其是豬源細胞，與其他非靈長類動物相比，豬與人類在體型、生理和解剖結構上更相似，且來源豐富，取材相對容易。隨著GTKO豬的出現，異種細胞移植取得了較快發展，目前已涉及多個器官、組織和細胞。近年來SCID豬[41]和微囊化包被細胞技術的出現，也為異種細胞移植提供了更為便利的條件。相信隨著新型免疫抑制劑的出現、組織工程技術的進步以及轉基因豬的產生，豬可能成為人類器官、組織和細胞主要來源。
細胞移植是將有功能的細胞植入人體內，以替代因退變、損傷、基因缺陷或自身免疫而毀損的細胞，從而達到治療疾病的目的。采用人自體或同種異體細胞移植來源有限，且存在倫理問題，豬來源的異種細胞為細胞移植提供了另一個選擇[1]。隨著新型免疫抑制劑、免疫隔離技術及轉基因豬[2]的誕生，豬來源異種細胞，包括神經細胞、胰島細胞、肝細胞和各種類型干細胞在細胞移植方面取得了顯著成果[1-5]。本文擬從普通體細胞和干細胞兩方面，對豬來源異種細胞移植臨床前研究進展作一總結。
1 普通體細胞的異種移植
1.1 異種神經細胞移植
細胞移植在治療帕金森病方面具有巨大潛力，其中采用人胎兒腦神經母細胞移植被認為是最有效方法，但受到倫理限制。豬與靈長類動物大腦體積相似，且來源豐富、易進行基因修飾，神經突長度也與人類神經元類似，被認為是最合適的異種神經細胞來源[6]。1997年Deacon等[7]對1例帕金森患者行右側紋狀體注入胎豬腦神經細胞懸液治療，患者在治療后7個月死于肺栓塞，經觀察其腦組織中發現了豬多巴胺能神經元及其他豬神經和神經膠質細胞，且豬神經元的軸突在宿主腦組織中有一定程度延伸。該研究首次用組織學方法證明了非人類多巴胺能神經元可在人腦中存在。
雖然動物學研究表明，與其他部位異種移植相比，宿主的大腦對異種移植物的排斥反應程度相對較低[8]，避免了急性排斥反應，但排斥反應仍然存在。目前隨著免疫抑制劑的應用和轉基因豬的誕生，T細胞介導的免疫排斥反應得到一定程度抑制。2007年Krystkowiak等[9]將人胎兒腦神經母細胞注入亨廷頓患者大腦后，患者出現體重下降、舞蹈癥惡化、步態不穩等癥狀，在排除其他原因后，懷疑為同種異體免疫排斥反應，在使用免疫抑制劑后，患者以上癥狀得到恢復。大腦內能發生同種異體免疫排斥反應，也可能發生異種移植免疫排斥反應，因此需要尋找可降低大腦免疫排斥反應的方法。2005年產生了一種在神經元特異烯醇化酶啟動子作用下表達hCTLA4-Ig（人細胞毒T淋巴細胞相關抗原4免疫球蛋白）免疫抑制劑蛋白的轉基因豬，抑制hCTLA4-Ig表達后，能相應抑制CD4+T細胞介導的免疫排斥反應[10]。2010年這種轉基因豬的中腦神經組織被植入帕金森猴模型的腦中，結果表明豬的中腦神經組織能在猴腦中存活，存活時間超過460 d[11]。
異種神經細胞移植已取得了很大進步，但距臨床應用還有一定距離。如果異種移植免疫排斥反應得到有效控制，將促進豬異種神經細胞在臨床的應用。
1.2 異種胰島細胞移植
糖尿病是嚴重威脅人類生命健康的疾病之一，至今尚無根治方法。1986年Ricordi發明了“半自動化胰島分離”的方法[12]；2000年Shapiro等[13]采用無糖皮質激素的免疫抑制方案對7例1型糖尿病患者經門靜脈移植人胰島細胞，移植后患者獲血糖水平穩定，并且脫離胰島素治療長達1年。但同種胰島細胞來源有限，限制了胰島細胞移植的臨床應用，因此人們將研究重點放在異種胰島細胞移植。自1893年首次報道異種胰島細胞移植開始，異種胰島細胞移植已有100多年歷史。異種胰島細胞供體來源主要有豬、牛、猴等，其中豬胰島素的氨基酸排列順序以及血糖調定點與人接近，胰島細胞來源充足，胰島細胞在含人新鮮血清的培養基中能很好地存活與增殖，因此豬胰島細胞被認為是最適合的移植供體[14]。豬胰島素已成功應用于臨床數十年，充分證明了其糾正糖尿病高血糖狀態的安全性和有效性。2006年Hering等[15]將豬胰島細胞經肝門靜脈注入糖尿病短尾獼猴體內，結果顯示猴體內可重新建立血糖控制機制逆轉糖尿病達100 d。α-1，3半乳糖轉移酶基因敲除（α-1，3-galactosyltransferase knockout，GTKO）豬和CTLA4-Ig豬出現后，從這些基因改造豬中獲得的胰島細胞抗原性明顯降低，避免了超急性免疫排斥反應和T細胞介導的免疫排斥反應發生，延長了豬胰島細胞在非人靈長類動物中存活時間[16-17]。
然而，豬來源的異種胰島細胞移植仍面臨很多問題，如進一步降低移植物的抗原性以減少免疫抑制劑用量，以及避免豬內源性逆轉錄病毒感染的可能性。為此人們采用免疫隔離方案如胰島微囊化技術來防止免疫排斥，在不使用免疫抑制劑的情況下延長移植胰島細胞的存活時間[18-21]。新型胰島細胞提取技術、免疫隔離技術和新的免疫抑制劑的出現，也加快了異種胰島細胞移植的發展速度。
1.3 異種肝細胞移植
目前肝細胞移植術已應用于臨床，是一種能有效治療終末期肝病和遺傳代謝性肝病的方法，也是等待原位肝移植的過渡性治療方法之一[22]。目前肝細胞的主要來源是不適于肝移植的肝臟[23]，以及作劈離式肝移植時，在保證劈離的2塊肝組織能滿足患者肝移植后，切取的第4肝段[24]。除人原代肝細胞外，異種肝細胞[25]也是來源之一，特別是豬來源肝細胞。2007年Nagata等[26]將豬肝細胞用1%海藻酸鈉制成細胞懸液，注入獼猴脾臟內，肝細胞最終存活了253 d。異種肝細胞移植存在的免疫排斥反應較大，除應用免疫抑制劑和轉基因豬外，也可使用微囊包被肝細胞進行輸注。微囊化的肝細胞能使細胞生長所需物質通過半透膜，而宿主的免疫細胞、免疫球蛋白及補體則不能通過，因此延長了肝細胞在宿主內存活時間，且避免了免疫排斥反應[27]。異種肝細胞移植可解決肝細胞來源短缺問題，但如何降低和避免免疫排斥反應和種間逆轉錄病毒的傳播仍需要深入研究。
2 異種干細胞移植
2.1 異種MSCs移植
目前臨床上進行的自體或同種異體MSCs移植，MSCs主要來自于人骨髓、臍帶血和脂肪等。由于移植所需MSCs數量較大，供體細胞無法滿足臨床需求[4]，故需尋找其他MSCs來源。研究表明人對GTKO豬MSCs的免疫排斥反應與對人MSCs免疫排斥反應類似[28-29]，如果將GTKO豬轉入人類的補體調節基因或免疫抑制基因，則會保護MSCs免受人類體液免疫和細胞免疫，在一定程度上避免了種間免疫排斥反應。截至2011年底共有94例關于異種MSCs移植的報道，其中88例（93.6%）移植成功[4]。這些研究結果表明MSCs是可以跨越種族屏障在異種體內存在。
2007年Nakamura等[30]將豬BMSCs在體外傳代培養至一定代次后，注入心肌梗死的非肥胖糖尿病/重癥聯合免疫缺陷（non-obese diabetic/severe combined immunodeficient，NOD/SCID）小鼠的梗死灶內，BMSCs在小鼠心肌梗死區內至少存活4周，左心室射血分數與梗死區注射生理鹽水的對照組相比有明顯改善。2008年Eguchi等[31]將豬髂骨來源的BMSCs聯合豬椎骨內骨髓細胞，共同注入經全身輻射的NOD/SCID小鼠雙側脛骨骨髓腔內，6周后小鼠骨髓異種嵌合率明顯高于僅注射骨髓細胞的對照組。說明BMSCs可在異種動物體內進行短暫移植，并改善其功能。豬來源MSCs是否能用于靈長類動物，目前尚缺乏有效的實驗數據證明，其可行性以及免疫排斥和種間病毒傳播等情況有待進一步研究。
2.2 異種造血干細胞移植
造血干細胞移植是指在患者接受超劑量化療或放療后，將各種來源的骨髓造血干細胞、外周血造血干細胞或臍帶血造血干細胞通過靜脈輸注移植入患者體內，重建被摧毀或已衰竭的造血及免疫功能。自1955年Thomas首先開展骨髓造血干細胞移植以來，該方法已廣泛用于血液病的臨床治療，已成為治療惡性血液病、重型再生障礙性貧血及部分實體瘤等疾病的最有效方法，但存在造血干細胞來源有限、數量少以及人類白細胞抗原匹配等問題。為進一步豐富造血干細胞的來源，人們進行了異種造血干細胞來源的探索。
1999年Sablinski等[32]首次嘗試將豬骨髓移植入恒河猴體內。術前所有猴均行脾切除和全身輻射，術后使用免疫抑制劑，其中1只猴同時靜脈輸注豬特異IL-3和干細胞生長因子；結果發現接受了IL-3和干細胞生長因子的猴在移植后180 d和302 d觀測到了細胞嵌合現象，而其余猴未見該現象。研究者認為細胞未能長期嵌合可能與豬造血祖細胞在猴體內成熟后表達半乳糖有關。2004年Tseng等[33]首次嘗試將GTKO豬骨髓移植入3只狒狒體內，其中1只狒狒于術后6 d因突發出血死亡，余2只狒狒分別于9～16 d和7～17 d在血液中檢測到少量豬細胞（< 1%），說明骨髓移植可能轉移；整個實驗過程中除了宿主對移植細胞的低反應性延長外，未發現長時間的移植嵌合。隨著新型免疫抑制劑的出現和轉基因豬的應用，有望使異種嵌合的效率和時間大大延長。
2.3 異種脂肪來源干細胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）移植
ADSCs易從脂肪組織中獲得，在體外具有穩定的擴增能力，并且在適當誘導條件下可分化為脂肪細胞、成骨細胞、軟骨細胞和肌細胞等。ADSCs因缺乏人類白細胞抗原-DR表達，能抑制異源活化的淋巴細胞增殖[34-35]和炎性因子產生，刺激抗炎性因子產生[36-37]等，已被證明有免疫特權。目前ADSCs被廣泛應用于再生醫學，如整形美容、心肌梗死、神經退行性疾病和骨組織缺陷等方面的研究，除了同種異體ADSCs移植外，研究者們也進行了異種移植研究[5]。因為相比人類自體或同種異體移植，異種移植脂肪來源更豐富，尤其是豬來源脂肪組織。
Lin等[5]將2012年之前有關ADSCs的異種移植研究進行了統計，發現有27例異種移植實驗是將人類ADSCs移植至非人類動物體內。其中2003年報道了首例異種ADSCs移植，研究者將人ADSCs移植入大腦缺血的大鼠腦組織內，發現大鼠神經功能有所改善[38]。2014年Ghasemi等[39]將人ADSCs移植入溶血卵磷脂所致的局部髓鞘病變大鼠脊髓內，大鼠運動功能有所改善，該研究結果表明人ADSCs能夠分化為少突膠質細胞，并促進髓鞘再生。2013年Zhu等[40]將豬ADSCs通過肝門靜脈移植入慢加急性肝衰竭模型的兔體內，結果表明ADSCs能延長兔存活時間，改善肝功能，并有分化為肝細胞的趨勢。
異種ADSCs由于易獲得、來源豐富、可重復強、免疫特權等優點得到了科學家的青睞，但是也存在很多問題需要解決[5]，如ADSCs無統一鑒別標準、ADSCs向神經系統分化還未明確等。
3 小結
異種細胞移植與同種細胞移植相比，雖然免疫排斥反應相應增加，但在來源和數量上具有較大優勢，可重復性強。尤其是豬源細胞，與其他非靈長類動物相比，豬與人類在體型、生理和解剖結構上更相似，且來源豐富，取材相對容易。隨著GTKO豬的出現，異種細胞移植取得了較快發展，目前已涉及多個器官、組織和細胞。近年來SCID豬[41]和微囊化包被細胞技術的出現，也為異種細胞移植提供了更為便利的條件。相信隨著新型免疫抑制劑的出現、組織工程技術的進步以及轉基因豬的產生，豬可能成為人類器官、組織和細胞主要來源。