羧甲基殼聚糖對氧化應激誘導雪旺細胞凋亡及BDNF與GDNF表達的影響_《中國修復重建外科雜志》

作者：

 賀斌 , 陶海鷹 , 劉世清

武漢大學人民醫院骨科（武漢, 430060）;

關鍵詞：

羧甲基殼聚糖雪旺細胞氧化損傷細胞凋亡腦源性神經營養因子膠質細胞源性神經營養因子大鼠

DOI：

10.7507/1002-1892.20140331

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摘要 全文 圖表 視頻 參考文獻 施引文獻 補充材料

目的研究羧甲基殼聚糖（carboxymethylated chitosan，CMCS）對氧化應激誘導大鼠雪旺細胞（Schwanncells，SCs）凋亡的保護作用及對SCs內腦源性神經營養因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）和膠質細胞源性神經營養因子（glial cell line derived neurotrophic factor，GDNF）表達的影響。方法取24只3～5日齡SD大鼠（體重25～30 g，雌雄不限）雙側坐骨神經，體外分離培養SCs，S-100免疫熒光染色鑒定。于SCs培養基中加入0.01、0.10、1.00 mmol/L H₂O₂溶液進行誘導，作用3、6、12、24 h后采用CCK-8檢測細胞增殖以及流式細胞術檢測細胞凋亡，篩選H₂O₂誘導氧化應激SCs凋亡模型的最佳作用濃度及時間。取第2代SCs，根據不同處理方法分成5組：空白對照組（PBS處理）、1.00 mmol/L H₂O₂誘導組、1.00 mmol/L H₂O₂+50 μg/mL CMCS處理組、1.00 mmol/L H₂O₂+100 μg/mL CMCS處理組、1.00 mmol/L H₂O₂+200 μg/mL CMCS處理組。培養24 h后，采用CCK-8檢測SCs增殖，流式細胞術檢測SCs早期凋亡，實時定量PCR及Western blot檢測SCs內BDNF、GDNF mRNA及蛋白表達。結果分離培養的細胞經S-100免疫熒光染色鑒定陽性率達95%以上。CCK-8及流式細胞術檢測示，H₂O₂可明顯抑制SCs增殖并誘發早期凋亡，且呈濃度依賴性，1.00 mmol/L H₂O₂溶液作用24 h效果最明顯，為模型制備最佳作用濃度及時間。當加入50～200 μg/mLCMCS后，SCs增殖活性增加、細胞凋亡率降低，且隨CMCS濃度增加上述效應增強。實時定量PCR及Western blot檢測示，與空白對照組比較，1.00 mmol/L H₂O₂誘導組BDNF、GDNF mRNA及蛋白表達明顯降低，差異有統計學意義（P<0.05）；加入50、100、200 μg/mL CMCS作用后，隨CMCS濃度增加，BDNF、GDNF mRNA及蛋白表達逐漸增加，與空白對照組及1.00 mmol/L H₂O₂誘導組比較以及各CMCS處理組間比較，差異均有統計學意義（P<0.05）。結論 CMCS對氧化應激誘導大鼠SCs凋亡具有保護作用，并促進凋亡SCs分泌BDNF與GDNF。

引用本文： 賀斌, 陶海鷹, 劉世清. 羧甲基殼聚糖對氧化應激誘導雪旺細胞凋亡及BDNF與GDNF表達的影響. 中國修復重建外科雜志, 2014, 28(12): 1530-1535. doi: 10.7507/1002-1892.20140331 復制

雪旺細胞（Schwann cells，SCs）是周圍神經系統的主要膠質細胞，生理狀態下SCs可分泌多種神經營養因子，在脊髓及周圍神經損傷修復中發揮重要作用^[1]。研究表明，炎性因子、細胞氧化損傷、纖維組織增生等可誘導SCs發生凋亡^[2]，而氧化應激誘導SCs凋亡是周圍神經退變性疾病發生的重要機制。羧甲基殼聚糖（carboxymethylated chitosan，CMCS）是殼聚糖經羧甲基化反應后得到的水溶性衍生物，具有良好降解性及生物學活性^[3-4]。我們既往研究發現CMCS對軟骨細胞退變及凋亡具有一定的保護作用，并抑制骨關節炎的發生 ^[5-6]。將CMCS應用于體外培養的SCs后，能促進SCs的增殖及分泌NGF、睫狀神經營養因子，并激活MEK/ERK、PI3K/Akt、Wnt/β-catenin及NF-κB信號通路^[7-10]。腦源性神經營養因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）和膠質細胞源性神經營養因子（glial cell line derived neurotrophic factor，GDNF）是兩種重要的神經營養因子，不僅能促進神經元再生，還能夠誘導神經干細胞向神經元分化[11- 12]。本次實驗旨在采用不同濃度H₂O₂溶液體外誘導培養SCs，構建SCs氧化應激凋亡模型，進一步研究CMCS對SCs氧化應激凋亡的保護作用及對SCs分泌BDNF、GDNF的影響。報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及主要試劑、儀器

3～5日齡SD大鼠24只，體重25～30 g，雌雄不限，由武漢大學醫學部實驗動物中心提供。

CMCS（純度99%，武漢大學資源與環境科學學院提供）；DMEM/F12培養基、FBS（GIBCO公司，美國）；胰蛋白酶、Ⅱ型膠原酶、TRIzol、PCR引物（Invitrogen公司，美國）；CCK-8細胞增殖檢測試劑盒（Dojindo公司，日本）；實時定量PCR試劑盒（大連寶生物工程有限公司）；細胞裂解液、BCA蛋白定量試劑盒（北京普利萊基因技術有限公司）；細胞凋亡檢測試劑盒（Biosciences公司，美國）；兔抗鼠BDNF、GDNF一抗（Cell Signaling Technology公司，美國）；兔抗鼠S-100一抗、β-actin一抗、辣根過氧化物酶標記羊抗兔二抗、FITC標記羊抗兔二抗（Santa Cruz公司，美國）。CKX41型倒置顯微鏡、倒置熒光顯微鏡（Olympus公司，日本）；蛋白質垂直電泳槽、穩壓穩流電泳儀、圖像分析軟件（Bio-Rad公司，美國）；Prism 7500實時定量PCR系統（ABI公司，美國）；VICTOR3酶標儀（PerkenElmer公司，美國）。

1.2 SCs分離培養及純化

取3～5日齡SD大鼠，按照Brockes等^[13]方法分離雙側坐骨神經，滅菌PBS沖洗，D-Hank’s液漂洗3次，加入5 mL混合酶（0.25%胰蛋白酶+0.03%Ⅱ型膠原酶），37℃消化30 min；以離心半徑6 cm，1 000 r/ min離心5 min，棄上清。加入含10% FBS的DMEM/F12培養基，置于37℃、5% CO₂培養箱中培養30 min，按照文獻[14]方法采用差速貼壁、阿糖胞苷及不同膠原酶純化細胞。倒置顯微鏡下觀察細胞形態。待細胞融合約80%時，加入0.25%胰蛋白酶消化，傳代培養。

1.3 SCs S-100免疫熒光染色鑒定

取生長狀態良好的第2代SCs接種于6孔板，PBS洗滌3次；加入4%多聚甲醛，冰上放置10 min；PBS洗滌；加入1% Triton-100溶液5 mL，37℃孵育20 min，PBS洗滌，加入3 mL正常羊血清37℃封閉5 min，加入滅菌常溫PBS溶液，滴加兔抗鼠S-100一抗2 mL（1∶200稀釋），4℃孵育過夜；PBS洗滌細胞，加入FITC標記羊抗兔二抗，室溫避光孵育30 min，PBS洗滌。倒置熒光顯微鏡下觀察并計數，細胞質呈綠色熒光者為陽性細胞。

1.4 氧化應激SCs凋亡模型構建

取第2代SCs接種于6孔板中，采用含10%FBS的DMEM/F12培養基，置于37℃、5%CO₂培養箱中培養。待細胞融合達80%，分別加入0.01、0.10、1.00 mmol/ L H₂O₂溶液進行誘導，作用3、6、12、24 h，采用CCK-8檢測細胞增殖活性；取作用24 h樣本采用流式細胞術檢測細胞凋亡，以確定建立氧化應激SCs凋亡模型的最佳作用濃度及時間。

1.5 實驗分組及方法

取第2代SCs根據不同處理方式分為5組：空白對照組（PBS處理）、1.00 mmol/L H₂O₂誘導組、1.00 mmol/L H₂O₂+50 μg/mL CMCS處理組、1.00 mmol/L H₂O₂+100 μg/mL CMCS處理組、1.00 mmol/L H₂O₂+200 μg/mL CMCS處理組。

1.5.1 CCK-8檢測細胞增殖

取第2代SCs，加入0.25%胰蛋白酶消化制備單細胞懸液，以離心半徑6 cm，1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入含10%FBS的DMEM/F12培養基，調整細胞濃度為1×10⁴個/mL，接種于96孔板，每孔約200 μL，置于37℃、5%CO₂培養箱中培養。待細胞貼壁后，加入無血清培養基培養24 h。根據上述方法將細胞分為5組，于37℃、5%CO₂培養箱中培養24 h。終止培養前2 h每孔加入CCK-8試劑20 μL，酶標儀于450 nm波長處檢測吸光度（A）值。按照以下公式計算細胞增殖活性，（實驗組A值-空白組A值）/（空白對照組A值-空白組A值）× 100%，其中空白組為單純培養基。每組設6 個復孔。

1.5.2 流式細胞術檢測細胞凋亡

取第2代SCs接種于6孔板中，采用含10%FBS的DMEM/F12培養基，置于37℃、5%CO₂培養箱中培養。待細胞融合達80%，根據以上方法將細胞分為5組，于37℃、5% CO₂培養箱中培養24 h。0.25%胰蛋白酶消化并收集細胞，預冷PBS洗滌細胞，加入500 μL結合緩沖液，將細胞搖勻后加入5 μL FITC-Annexin V和5 μL碘化丙啶，室溫避光孵育10 min，流式細胞儀檢測早期細胞凋亡。每組設3個復孔。

1.5.3 實時定量PCR檢測細胞BDNF及GDNF mRNA表達

取第2代SCs，根據以上方法分為5組，于37℃、5% CO₂培養箱中培養24 h后，TRIzol法提取RNA。將RNA溶于DEPC處理的無菌水中，測定RNA濃度（A₂₆₀/A₂₈₀ > 1.8）。應用逆轉錄試劑盒將提取的mRNA逆轉錄為cDNA。采用SYBR GreenⅠ染料進行標記，通過實時定量PCR系統分析BDNF、GDNF mRNA表達，引物序列見表 1。PCR反應條件：95℃變性10 s；95℃ 5 s，40個循環；60℃延伸30 s。獲得標準曲線，以目的基因與內參GAPDH的比值作為目的基因相對表達量。結果以Ct值表示，采用ΔΔCt法進行分析。每組設3個復孔。

表1 各目的基因引物序列及產物長度 Table1. Primer sequences and production size of genes

表選項

下載CSV

基因 Gene	引物序列（5′→3′） Primer sequence（5′→3′）	產物長度（bp） Production size（bp）
BDNF	上游ACTGGCTGACACTTTTGA Upstream 下游GACCCACTCGCTAATA Downstream	273
GDNF	上游TTTTATTCAAGCCACATCA Upstream 下游AGCCCAAACCCAAGTCAG Downstream	203
GAPDH	上游TGTCTCCTGCGACTTCAACAG Upstream 下游GAGGCCATGTAGGCCATGAG Downstream	256

1.5.4 Western blot檢測細胞BDNF及GDNF蛋白表達

取第2代SCs，根據以上方法分為5組，于37℃、5% CO₂培養箱中培養24 h后，加入細胞裂解液100 μL，冰上裂解5 min。4℃以離心半徑6 cm，12 000 r/min離心5 min，BCA蛋白定量試劑盒進行蛋白定量。取樣品約15 μg加入SDS-PAGE凝膠電泳儀中電泳、轉膜，加入含有5%脫脂奶粉的PBS溶液5 mL，室溫封閉1 h，加入兔抗鼠BDNF、GDNF一抗及β-actin一抗（1∶200），4℃孵育過夜。含有0.1% Tween-20的PBS溶液漂洗3次，每次10 min；加入辣根過氧化物酶標記羊抗兔二抗（1∶10 000），室溫孵育2 h，PBST漂洗3次，每次10 min；加入ECL化學發光劑反應、曝光，圖像分析軟件進行半定量分析。每組設3個復孔。

1.6 統計學方法

采用SPSS 16.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗；檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 細胞形態學觀察及鑒定

倒置顯微鏡下觀察示SCs呈梭形，體積小，有兩極，胞核明顯、呈卵圓形，細胞密度大，均伸出較長偽足；傳代后細胞多呈梭形，細胞稀疏處呈“尖對尖”排列，密集處呈簇狀或圈狀排列（圖 1a）。S-100免疫熒光染色標記細胞質呈綠色熒光的陽性細胞達95%以上（圖 1b）。

圖1 體外培養SCs觀察 ?第2代細胞培養7 d（倒置顯微鏡× 250） ?S-100免疫熒光染色鑒定（倒置熒光顯微鏡× 250） ? ?圖 2 不同濃度H₂O₂對SCs增殖活性和早期凋亡的影響 ?CCK-8檢測SCs增殖活性 ?流式細胞術檢測SCs早期凋亡（從左至右H₂O₂濃度依次為0.01、0.10、1.00 mmol/ L） ? ?圖 3 流式細胞術檢測CMCS對氧化應激誘導SCs凋亡的影響 ?空白對照組 ?1.00 mmol/L H₂O₂誘導組 ?1.00 mmol/L H₂O₂+50 μg/mL CMCS處理組 ?1.00 mmol/L H₂O₂+100 μg/mL CMCS處理組 ?1.00 mmol/L H₂O₂+200 μg/mL CMCS處理組 Figure1. SCs observations cultured in vitro ?The 2nd passage SCs after 7 days of culturing (Inverted microscope× 250) ?Immunofluorescence staining of S-100 of SCs (Inverted fluorescence microscope× 250) ? ?Fig. 2 The effect of different concentrations of H₂O₂ on SCs viability and apoptosis ?The detection of SCs viability by CCK-8 ?The detection of SCs apoptosis by flow cytometry (From left to right: the concentration of H₂O₂ was 0.01,0.10,and 1.00 mmol/ L,respectively) ? ?Fig. 3 The effect of CMCS on apoptosis in SCs ?Control group ?1.00 mmol/L H₂O₂ induced group ?1.00 mmol/L H₂O₂+50 μg/ mL CMCS treated group ?1.00 mmol/L H₂O₂+100 μg/mL CMCS treated group ?1.00 mmol/L H₂O₂+200 μg/mL CMCS treated group

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2.2 構建氧化應激SCs凋亡模型觀察

CCK-8檢測顯示，0.01、0.10、1.00 mmol/L H₂O₂均可抑制SCs增殖，其中1.00 mmol/L作用時增殖抑制效應最明顯；隨著H₂O₂作用時間延長，細胞增殖活性逐漸降低，其中作用24 h增殖抑制效應最明顯（圖 2a）。流式細胞術檢測示0.01、0.10、1.00 mmol/L H₂O₂作用24 h，均可誘導SCs發生凋亡，早期凋亡率分別為13.2% ± 1.5%、51.0% ± 4.3%、69.8% ± 5.2%，呈明顯濃度依賴性（圖 2b）。故后續實驗采用1.00 mmol/ L H₂O₂作用24 h構建氧化應激SCs凋亡模型。

2.3 CMCS對氧化應激誘導SCs增殖活性的影響

1.00 mmol/L H₂O₂誘導組細胞增殖活性是空白對照組的44.6% ± 3.2%。加入CMCS后，SCs增殖活性增加，1.00 mmol/L H₂O₂+50 μg/mL CMCS處理組、1.00 mmol/L H₂O₂+100 μg/mL CMCS處理組、1.00 mmol/L H₂O₂+200 μg/mL CMCS處理組細胞增殖活性分別為空白對照組的57.2% ± 4.1%、79.4% ± 6.3%、94.6% ± 8.5%；各CMCS處理組與1.00 mmol/ L H₂O₂誘導組比較，差異均有統計學意義（P < 0.05）；各CMCS處理組間比較，差異亦有統計學意義（P < 0.05）。

2.4 CMCS對氧化應激誘導SCs凋亡的保護作用

空白對照組、1.00 mmol/L H₂O₂誘導組、1.00 mmol/ L H₂O₂+50 μg/mL CMCS處理組、1.00 mmol/L H₂O₂+100 μg/mL CMCS處理組、1.00 mmol/L H₂O₂+200 μg/ mL CMCS處理組早期細胞凋亡率分別為2.1% ± 0.2%、69.8% ± 5.2%、55.9% ± 4.6%、10.2% ± 0.9%、6.3% ± 0.4%。與空白對照組比較，1.00 mmol/ L H₂O₂誘導組早期細胞凋亡率明顯增加，差異有統計學意義（P < 0.05）；加入50、100、200 μg/ mL CMCS作用后，隨CMCS濃度增加，早期細胞凋亡率逐漸降低，與1.00 mmol/L H₂O₂誘導組比較以及各CMCS處理組間比較，差異均有統計學意義（P < 0.05）。見圖 3。

2.5 CMCS對氧化應激誘導SCs內BDNF及GDNF mRNA表達的影響

空白對照組、1.00 mmol/L H₂O₂誘導組、1.00 mmol/ L H₂O₂+50 μg/ mL CMCS處理組、1.00 mmol/L H₂O₂+100 μg/ mL CMCS處理組、1.00 mmol/L H₂O₂+200 μg/ mL CMCS處理組BDNF mRNA相對表達量分別為0.982 ± 0.032、0.388 ± 0.024、0.582 ± 0.028、0.722 ± 0.045、0.842 ± 0.052，GDNF mRNA相對表達量分別為0.946 ± 0.041、0.213 ± 0.019、0.422 ± 0.026、0.532 ± 0.039、0.746 ± 0.044。與空白對照組比較，1.00 mmol/ L H₂O₂誘導組BDNF、GDNF mRNA相對表達量明顯降低，差異均有統計學意義（P < 0.05）；加入50、100、200 μg/mL CMCS作用后，隨CMCS濃度增加，BDNF、GDNF mRNA相對表達量逐漸增加，與空白對照組、1.00 mmol/L H₂O₂誘導組比較以及各CMCS處理組間比較，差異均有統計學意義（P < 0.05）。

2.6 CMCS對氧化應激誘導SCs內BDNF及GDNF蛋白表達的影響

空白對照組、1.00 mmol/L H₂O₂誘導組、1.00 mmol/ L H₂O₂+50 μg/ mL CMCS處理組、1.00 mmol/L H₂O₂+100 μg/ mL CMCS處理組、1.00 mmol/L H₂O₂+200 μg/ mL CMCS處理組BDNF蛋白表達量分別為0.682 ± 0.045、0.148 ± 0.022、0.252 ± 0.031、0.572 ± 0.051、0.732 ± 0.066，GDNF蛋白表達量分別為0.836 ± 0.057、0.231 ± 0.025、0.453 ± 0.037、0.697 ± 0.062、0.766 ± 0.059。與空白對照組比較，1.00 mmol/ L H₂O₂誘導組BDNF、GDNF蛋白表達明顯降低，差異均有統計學意義（P < 0.05）；加入50、100、200 μg/mL CMCS作用后，隨CMCS濃度增加，BDNF、GDNF蛋白表達量逐漸增加，與空白對照組、1.00 mmol/L H₂O₂誘導組比較以及各CMCS處理組間比較，差異均有統計學意義（P < 0.05）。見圖 4。

圖2 Western blot檢測SCs內BDNF和GDNF蛋白表達Mr：相對分子質量 1：空白對照組 2：1.00 mmol/L H₂O₂誘導組 3：1.00 mmol/ L H₂O₂+50 μg/mL CMCS處理組 4：1.00 mmol/L H₂O₂+100 μg/mL CMCS處理組 5：1.00 mmol/L H₂O₂+200 μg/mL CMCS處理組 Figure2. The expressions of BDNF and GDNF proteins in SCs by Western blot Mr: Relative molecular mass 1: Control group 2: 1.00 mmol/ L H₂O₂ induced group 3: 1.00 mmol/L H₂O₂+50 μg/mL CMCS treated group 4: 1.00 mmol/L H₂O₂+100 μg/mL CMCS treated group 5: 1.00 mmol/L H₂O₂+200 μg/mL CMCS treated group

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3 討論

近年來，大量研究者通過組織工程技術將SCs用于損傷脊髓與周圍神經修復，并取得了一定效果^[15-16]。SCs凋亡在周圍神經退變中起重要作用，尤其在脫髓鞘疾病及變態神經炎等疾病中，抑制SCs凋亡對周圍神經損傷修復具有重要意義^[17-18]。

CMCS是殼聚糖經羧甲基化反應后的水溶性衍生物，具有良好的生物相容性及活性。基于抑制SCs凋亡在神經再生中的重要作用，本實驗中我們通過氧化應激誘導SCs凋亡模型，研究CMCS對凋亡SCs的保護作用，并探討CMCS對氧化應激誘導的SCs凋亡細胞內BDNF及GDNF表達的影響，結果表明CMCS對氧化應激誘導SCs凋亡具有保護作用，并促進凋亡SCs分泌BDNF及GDNF。

H₂O₂是一種強氧化劑，在紫外線或體液中金屬離子作用下可產生O₂^-和OH^-等多種自由基，并由此引發連鎖反應產生更多自由基^[19]。活性氧（reactive oxygen species，ROS）能引起細胞膜的脂質過氧化，引發多種生化反應，如改變細胞膜的物理特性、使膜上結合的調節細胞膜通透性的酶失活。研究表明，細胞膜的脂質過氧化能促進細胞凋亡，而某些脂質過氧化物還能引起繼發性的細胞內鈣失衡，從而加速細胞凋亡^[20]。細胞內ROS的堆積可以誘發線粒體釋放細胞色素C，而細胞色素C可以激活凋亡激酶Caspase-3與Caspase-9，從而引發細胞凋亡。在周圍神經損傷的早期有一部分SCs被體內產生的氧化劑殺死，從而導致細胞過度丟失，加速了周圍神經損傷。本實驗中我們通過H₂O₂構建SCs凋亡模型，并采用CCK-8檢測細胞增殖及流式細胞術檢測細胞凋亡情況。結果表明，H₂O₂在0.01、0.10、1.00 mmol/L濃度范圍內均可抑制SCs增殖活性，且隨著H₂O₂濃度增加，抑制作用明顯增強，其抑制細胞增殖活性的最佳作用時間為24 h；另外流式細胞術檢測結果提示，H₂O₂在0.01、0.10、1.00 mmol/L濃度范圍內均可增加SCs的早期凋亡率，且隨濃度增加早期凋亡率增加，1.00 mmol/L H₂O₂作用24 h后SCs早期凋亡率平均達69.8%。上述結果表明經H₂O₂誘導可成功構建SCs凋亡模型，且最佳作用濃度為1.0 mmol/L，最佳作用時間為24 h。

BDNF是神經營養因子家族的重要成員之一^[21]，廣泛存在于腦組織，參與中樞神經系統特異性神經元的存活、分化及功能維持，可以影響軸突生長及神經塑形 ^[22]。GDNF是一種糖化的二硫鍵鏈接的同型二聚體，是TGF-β超家族中的重要成員^[23]，可以促進多種神經元細胞的存活與分化，包括小腦浦肯野細胞、中樞去甲腎上腺素能神經元、感覺和交感神經元亞群[24- 25]。本實驗中，我們通過實時定量PCR及Western blot檢測氧化應激誘導凋亡SCs內BDNF、GDNF mRNA及蛋白的表達，以及CMCS對氧化應激誘導SCs中BDNF、GDNF表達的影響，結果發現1.00 mmol/L H₂O₂作用24 h可以明顯抑制BDNF、GDNF mRNA及蛋白表達，加入終濃度為50、100、200 μg/mL CMCS后BNDF、GDNF mRNA與蛋白表達水平逐漸增加。表明氧化應激可以明顯抑制BDNF、GDNF的表達，但CMCS可以促進氧化應激損傷SCs內BDNF及GDNF的表達，表明CMCS對損傷SCs分泌神經營養因子具有一定保護作用。

綜上述，利用H₂O₂可以成功誘導體外培養SCs發生凋亡，并抑制細胞增殖活性，降低神經營養因子BDNF、GDNF的表達；而CMCS可以降低H₂O₂誘導的SCs凋亡，恢復其增殖活性，并促進SCs分泌BDNF、GDNF，具有神經保護作用。