引用本文： 馮婷婷, 劉艷軍, 許慶, 李曉明, 羅祥林, 陳元維. 聚乳酸降解終產物對成骨樣細胞增殖和成骨表型影響的體外實驗研究. 中國修復重建外科雜志, 2014, 28(12): 1525-1529. doi: 10.7507/1002-1892.20140330 復制
組織工程與再生醫學為人體組織器官修復重建提供了新途徑。聚乳酸（polylactic acid，PLA）因具有良好生物降解性被廣泛用作骨組織工程支架材料，但長期植入人體后會引發骨溶解和骨吸收等不良組織反應[1-5]。有學者已從生物安全性角度研究了其降解產物的細胞相容性，初步探索了降解產物體外生物學評價的方法；但這些研究僅涉及了降解產物的細胞毒性，且受試細胞多為成纖維細胞[6-8]。對組織工程而言，構建不同組織需要不同種子細胞，種子細胞不僅能在支架材料提供的微生態環境下存活，還應能生長、分化并發揮正常功能，以構建新的有生物活性的目標組織。成骨細胞是構建組織工程骨常用的種子細胞，將成骨細胞接種于PLA支架后，PLA的降解尤其是酸性降解產物累積是否會影響成骨細胞正常功能發揮尚不明確。國外有學者以鹽酸調節細胞培養液的pH值來模擬PLA降解產物累積造成的酸性環境，初步研究了酸性環境對種子細胞成骨表型的影響[9-10]，但鹽酸并非PLA降解的最終產物。本研究直接以PLA降解的最終產物——乳酸來調節細胞培養液的pH值，以進一步模擬PLA降解產物累積對細胞生長微環境的影響，并比較兩種不同的乳酸單體——右旋乳酸（L-lactic acid，L-LA）和外消旋乳酸（D，L-lactic acid，D，L-LA）對成骨樣細胞影響的差異，以期更深入了解PLA降解產物的組成以及累積對骨組織工程種子細胞增殖和成骨表型的影響，進而為PLA骨組織工程支架材料設計和降解的精確調控提供參考。
1 材料與方法
1.1 實驗材料及主要試劑、儀器
實驗選用大鼠源Ros17/2.8成骨樣細胞[11]，可表達成骨細胞標志物Ⅰ型膠原和ALP，由四川大學華西醫院移植工程與移植免疫重點實驗室提供。細胞培養采用含10% FBS、100 U/L青霉素、100 μg/L鏈霉素的H-DMEM培養基，于37℃、5%CO2及飽和濕度培養箱中培養。每2天傳代1次，選用復蘇后第2～4代細胞進行實驗。
濃度為98% 的L-LA水溶液、濃度為80%～85%的D，L-LA水溶液（Alfa Aesar公司，美國）；硝酸銀、硫代硫酸鈉（分析純；成都科龍化工試劑廠）；醫用級青霉素和鏈霉素、MTT（北京索萊寶科技有限公司）；FBS（蘭州民海生物工程有限公司）；胰蛋白酶、H-DMEM培養基（GIBCO公司，美國）；ALP試劑盒[柏定生物工程（北京）有限公司]。MCO-18AIC型CO2培養箱（SANYO公司，日本）；SZ-HS3型正置相差顯微鏡（重慶光電儀器有限公司）；PHS-3C型pH計（上海儀電科學儀器股份有限公司）；酶聯免疫檢測儀（DNM9602型，北京普朗新技術有限公司）。
1.2 含乳酸培養液的制備
配制濃度均為100 mg/mL的L-LA溶液和D，L-LA溶液，用0.22 μm濾膜過濾除菌后，分別加入H-DMEM培養液（pH7.4）中，制備含4、8、16、22、27 mmol/L的L-LA及D，L-LA培養液，并檢測其pH值。最后加入10%FBS，配制后立即使用。
1.3 觀測指標
1.3.1 細胞增殖活性檢測與細胞毒性評級
采用MTT法進行細胞增殖活性檢測[12]。0.25%胰蛋白酶消化單層細胞，用含10%FBS的H-DMEM培養液制備單個細胞懸液，以4×104個/mL濃度接種于96孔培養板中，每孔200 μL。于37℃、5%CO2及飽和濕度培養箱中培養24 h后，取出培養板，吸棄培養液。A、B組分別加入含4、8、16、22、27 mmol/L的L-LA和D，L-LA培養液，每一濃度樣品每一時間點各設5個副孔，以不含乳酸的普通培養液（pH7.4）培養細胞作為空白對照組（C組）。
培養1、3、5 d后取出培養板，于正置相差顯微鏡下觀察細胞形態，并于每孔加入5 mg/mL MTT溶液20 μL，37℃繼續孵育4 h，終止培養，吸棄孔內上清。每孔加入150 μL DMSO，振蕩10 min，酶聯免疫檢測儀于490 nm波長處測定各孔吸光度（A）值。按以下公式計算相對增殖率（relative growth ratio，RGR），RGR=實驗組（A組或B組）A值/空白對照組（C組）A值×100%。依據國家標準GB/T16175-2008[13]評定細胞毒性等級，0、Ⅰ級為毒性評級合格，Ⅱ級需結合細胞形態評定，Ⅲ～Ⅴ級為毒性評級不合格。
1.3.2 ALP活性檢測
按1.3.1方法分組，細胞接種密度為4×104個/mL，分別取含4 mmol/L L-LA及D，L-LA的培養液培養細胞。培養1、5 d取出培養板，吸棄培養液，每孔加入細胞裂解液0.1% Triton X-100 200 μL，4℃過夜；次日取出培養板，用移液槍反復吹打后超聲破碎細胞；于25℃以5 000 × g離心5 min，取4 μL上清，按ALP試劑盒說明書方法，酶標儀于405 nm波長處檢測A值并計算ALP活性。
由于各組樣品的細胞數量受培養液中乳酸組成影響而不同，為排除細胞數量的影響，以總ALP活性值與MTT法測得的反映細胞數量的A值比值來衡量單位細胞數的ALP活性；再根據以下公式計算單位細胞數的相對ALP活性（relative ALP ratio，RAR）：實驗組（A組或B組）ALP活性/空白對照組（C組）ALP活性× 100%。
1.3.3 von Kossa染色
按1.3.1方法分組，細胞接種密度為1×105個/mL，取含4 mmol/L L-LA及D，L-LA的培養液培養細胞，培養至約90%融合時，分別采用含礦化誘導成分β-甘油磷酸鈉（10 mmol/L）和L-抗壞血酸（50 mg/L）的乳酸培養液和新鮮培養液培養21 d，每3天換液1次；最后取出培養板，吸棄培養液，PBS清洗2遍后用95%乙醇固定10 min，蒸餾水沖洗數次，von Kossa法染色[14]，封片，正置相差顯微鏡下觀察。應用Image Pro Plus 6.0軟件行鈣結節定量分析，并按以下公式計算鈣結節平均染色密度（%）：黑色團塊狀鈣結節面積/培養板總面積× 100%[15]。
1.4 統計學方法
采用SPSS17.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Bonferroni檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 細胞增殖活性檢測與細胞毒性評級
用乳酸配制的細胞培養液pH值隨著乳酸濃度增加而降低（表 1）。
當乳酸濃度為4 mmol/L時，培養5 d內A、B組細胞RGR均值均在80%以上，細胞毒性評級均為Ⅰ級或0級，無明顯細胞毒性。當乳酸濃度增大至8 mmol/ L和16 mmol/L時，兩組乳酸培養液均存在細胞毒性，但出現毒性作用的時間不同，A組培養5 d后RGR均值降至50%以下，毒性評級達Ⅲ級，表現明顯細胞毒性；B組培養3 d時，RGR均值降至約50%，顯著抑制細胞增殖，5 d時RGR進一步下降，毒性評級增至Ⅳ級。當乳酸濃度增至22 mmol/L以上，兩組乳酸培養液在培養1 d時即對細胞增殖產生明顯抑制。此外，相同濃度下各時間點A組RGR均高于B組，且除4 mmol/L濃度培養1 d和3 d外，組間比較差異均有統計學意義（P < 0.05）。見表 1。
表1
A、B組細胞增殖活性RGR及細胞毒性評級
Table1.
The RGR and the cytotoxic grades of groups A and B
2.2 ALP活性檢測
培養1 d，A、B組RAR分別為144.1% ± 3.2%和115.2% ± 9.8%，5 d時分別為129.6% ± 9.8%和78.2% ± 6.9%。兩時間點A組均顯著高于B組，差異有統計學意義（F=38.989，P=0.000；F=91.096，P=0.000）。
2.3 von Kossa染色
Von Kossa染色示，培養21 d，A組黑色團狀物明顯多于B、C組（圖 1）。A、B、C組定量分析結果示，A、B、C組鈣結節平均染色密度為91.2% ± 8.2%、50.3% ± 7.9%和54.2% ± 8.6%，A組顯著高于B、C組，比較差異有統計學意義（P < 0.05）；B、C組間差異無統計學意義（P > 0.05）。
圖1
培養21 d各組von Kossa染色觀察（正置相差顯微鏡×40） ?A組 ?B組 ?C組
Figure1.
von Kossa staining of each group after 21 days of culture (Phase contrast microscope× 40) ?Group A ?Group B ?Group C
3 討論
支架材料是骨組織工程的核心要素之一[2]。人工合成的PLA材料雖有良好的降解性和可加工性，但酸性降解產物的累積不利于骨組織重建。為探究酸性降解產物對骨組織工程種子細胞的影響，Brandao-Burch等[9]通過鹽酸調節細胞培養基酸性來模擬PLA降解對體內微環境的改變，研究不同pH值的培養基對Ros17/2.8成骨樣細胞增殖活性和成骨表型影響。結果表明，培養微環境pH值從7.4降至6.87，對細胞增殖無明顯影響。他們研究還發現，用鹽酸調節培養液酸性，pH值降至7.15即會抑制細胞ALP表達和鈣結節形成。Kohn等[10]同樣使用鹽酸調節培養基酸性，也發現微小pH值改變，即pH值從7.2～7.4降至6.9～7.1，會顯著降低BMSCs的ALP活性[10]。
本研究直接以含乳酸的培養液模擬PLA降解引起的局部酸性環境。結果表明，乳酸濃度對細胞增殖有顯著影響，且隨濃度升高，對細胞增殖抑制作用逐漸增強，毒性逐漸增大，這可能與乳酸濃度升高導致培養液pH值下降有關。但低濃度的乳酸（4 mmol/ L）沒有明顯細胞毒性，此時pH值為7.0～7.2。該結果與前述報道結果基本一致。此外，本研究還比較了不同構型的乳酸對細胞增殖的影響。結果發現，在較高濃度（≥8 mmol/ L）下培養相同時間后，L-LA較D，L-LA的毒性作用更小。D，L-LA是在L-LA中加入等量的D-LA，為外消旋乳酸。但人體中存在的乳酸為L-LA，人體正常代謝不產生D-LA。這可能是造成D，L-LA較L-LA毒性大的一個原因。低濃度乳酸（4 mmol/ L）對細胞無明顯細胞毒性，因此我們選用該濃度下的含乳酸培養液培養細胞，研究乳酸組成對細胞ALP活性及鈣結節形成的影響。總體而言，兩種乳酸培養液在培養5 d后，對細胞的ALP活性均沒有強烈的抑制作用，甚至存在促進作用，且L-LA較D，L-LA的促進作用更強。鈣結節是成骨細胞在體外培養時形成的礦化細胞外基質，是成骨細胞分化的最后階段，它的形成標志成骨細胞分化成熟，進入成骨細胞階段，是成骨功能的形態表現。結果表明，乳酸的加入不僅未抑制鈣結節形成，而且L-LA還有促進鈣結節形成的作用。
比較乳酸模擬和鹽酸模擬[9-10]兩種情況，我們發現在相似的pH值條件下，乳酸對細胞增殖有顯著影響，但對ALP活性無明顯抑制，對鈣結節的形成能力也無明顯降低。由此可見，雖然乳酸和鹽酸均可降低培養液pH值，從而模擬PLA降解后造成的局部酸性環境，但兩者對細胞增殖和成骨表型的影響不同，這可能是由于兩種酸的酸性不同所致。體外培養細胞的培養液中有多種營養成分和pH緩沖的酸堿對[16]，由于酸性強弱的不同，對整個培養液緩沖體系的影響也不同，進而對細胞的生長產生不同影響。
乳酸是機體在缺氧環境下糖酵解的產物。既往對乳酸生理作用的研究，主要關注劇烈運動時體內乳酸濃度急劇增加，或外傷、感染引起的乳酸濃度增加對機體的影響 [17-19]。但乳酸對于骨代謝的影響，以及乳酸組成對骨相關生物學效應的影響罕見報道。本研究初步探討了乳酸對Ros17/2.8成骨樣細胞生長和成骨表型的影響，結果提示濃度和組成是重要的影響因素，且相近pH值條件下的乳酸作用效果與鹽酸不同。雖然相關機制尚不清楚，但卻提示PLA降解產生乳酸并非絕對不利，重要的是需要控制降解產物的濃度；PLA制備在單體選擇上，既要兼顧力學性能也需考慮不同的乳酸單體不同的生物學效應。
組織工程與再生醫學為人體組織器官修復重建提供了新途徑。聚乳酸（polylactic acid，PLA）因具有良好生物降解性被廣泛用作骨組織工程支架材料，但長期植入人體后會引發骨溶解和骨吸收等不良組織反應[1-5]。有學者已從生物安全性角度研究了其降解產物的細胞相容性，初步探索了降解產物體外生物學評價的方法；但這些研究僅涉及了降解產物的細胞毒性，且受試細胞多為成纖維細胞[6-8]。對組織工程而言，構建不同組織需要不同種子細胞，種子細胞不僅能在支架材料提供的微生態環境下存活，還應能生長、分化并發揮正常功能，以構建新的有生物活性的目標組織。成骨細胞是構建組織工程骨常用的種子細胞，將成骨細胞接種于PLA支架后，PLA的降解尤其是酸性降解產物累積是否會影響成骨細胞正常功能發揮尚不明確。國外有學者以鹽酸調節細胞培養液的pH值來模擬PLA降解產物累積造成的酸性環境，初步研究了酸性環境對種子細胞成骨表型的影響[9-10]，但鹽酸并非PLA降解的最終產物。本研究直接以PLA降解的最終產物——乳酸來調節細胞培養液的pH值，以進一步模擬PLA降解產物累積對細胞生長微環境的影響，并比較兩種不同的乳酸單體——右旋乳酸（L-lactic acid，L-LA）和外消旋乳酸（D，L-lactic acid，D，L-LA）對成骨樣細胞影響的差異，以期更深入了解PLA降解產物的組成以及累積對骨組織工程種子細胞增殖和成骨表型的影響，進而為PLA骨組織工程支架材料設計和降解的精確調控提供參考。
1 材料與方法
1.1 實驗材料及主要試劑、儀器
實驗選用大鼠源Ros17/2.8成骨樣細胞[11]，可表達成骨細胞標志物Ⅰ型膠原和ALP，由四川大學華西醫院移植工程與移植免疫重點實驗室提供。細胞培養采用含10% FBS、100 U/L青霉素、100 μg/L鏈霉素的H-DMEM培養基，于37℃、5%CO2及飽和濕度培養箱中培養。每2天傳代1次，選用復蘇后第2～4代細胞進行實驗。
濃度為98% 的L-LA水溶液、濃度為80%～85%的D，L-LA水溶液（Alfa Aesar公司，美國）；硝酸銀、硫代硫酸鈉（分析純；成都科龍化工試劑廠）；醫用級青霉素和鏈霉素、MTT（北京索萊寶科技有限公司）；FBS（蘭州民海生物工程有限公司）；胰蛋白酶、H-DMEM培養基（GIBCO公司，美國）；ALP試劑盒[柏定生物工程（北京）有限公司]。MCO-18AIC型CO2培養箱（SANYO公司，日本）；SZ-HS3型正置相差顯微鏡（重慶光電儀器有限公司）；PHS-3C型pH計（上海儀電科學儀器股份有限公司）；酶聯免疫檢測儀（DNM9602型，北京普朗新技術有限公司）。
1.2 含乳酸培養液的制備
配制濃度均為100 mg/mL的L-LA溶液和D，L-LA溶液，用0.22 μm濾膜過濾除菌后，分別加入H-DMEM培養液（pH7.4）中，制備含4、8、16、22、27 mmol/L的L-LA及D，L-LA培養液，并檢測其pH值。最后加入10%FBS，配制后立即使用。
1.3 觀測指標
1.3.1 細胞增殖活性檢測與細胞毒性評級
采用MTT法進行細胞增殖活性檢測[12]。0.25%胰蛋白酶消化單層細胞，用含10%FBS的H-DMEM培養液制備單個細胞懸液，以4×104個/mL濃度接種于96孔培養板中，每孔200 μL。于37℃、5%CO2及飽和濕度培養箱中培養24 h后，取出培養板，吸棄培養液。A、B組分別加入含4、8、16、22、27 mmol/L的L-LA和D，L-LA培養液，每一濃度樣品每一時間點各設5個副孔，以不含乳酸的普通培養液（pH7.4）培養細胞作為空白對照組（C組）。
培養1、3、5 d后取出培養板，于正置相差顯微鏡下觀察細胞形態，并于每孔加入5 mg/mL MTT溶液20 μL，37℃繼續孵育4 h，終止培養，吸棄孔內上清。每孔加入150 μL DMSO，振蕩10 min，酶聯免疫檢測儀于490 nm波長處測定各孔吸光度（A）值。按以下公式計算相對增殖率（relative growth ratio，RGR），RGR=實驗組（A組或B組）A值/空白對照組（C組）A值×100%。依據國家標準GB/T16175-2008[13]評定細胞毒性等級，0、Ⅰ級為毒性評級合格，Ⅱ級需結合細胞形態評定，Ⅲ～Ⅴ級為毒性評級不合格。
1.3.2 ALP活性檢測
按1.3.1方法分組，細胞接種密度為4×104個/mL，分別取含4 mmol/L L-LA及D，L-LA的培養液培養細胞。培養1、5 d取出培養板，吸棄培養液，每孔加入細胞裂解液0.1% Triton X-100 200 μL，4℃過夜；次日取出培養板，用移液槍反復吹打后超聲破碎細胞；于25℃以5 000 × g離心5 min，取4 μL上清，按ALP試劑盒說明書方法，酶標儀于405 nm波長處檢測A值并計算ALP活性。
由于各組樣品的細胞數量受培養液中乳酸組成影響而不同，為排除細胞數量的影響，以總ALP活性值與MTT法測得的反映細胞數量的A值比值來衡量單位細胞數的ALP活性；再根據以下公式計算單位細胞數的相對ALP活性（relative ALP ratio，RAR）：實驗組（A組或B組）ALP活性/空白對照組（C組）ALP活性× 100%。
1.3.3 von Kossa染色
按1.3.1方法分組，細胞接種密度為1×105個/mL，取含4 mmol/L L-LA及D，L-LA的培養液培養細胞，培養至約90%融合時，分別采用含礦化誘導成分β-甘油磷酸鈉（10 mmol/L）和L-抗壞血酸（50 mg/L）的乳酸培養液和新鮮培養液培養21 d，每3天換液1次；最后取出培養板，吸棄培養液，PBS清洗2遍后用95%乙醇固定10 min，蒸餾水沖洗數次，von Kossa法染色[14]，封片，正置相差顯微鏡下觀察。應用Image Pro Plus 6.0軟件行鈣結節定量分析，并按以下公式計算鈣結節平均染色密度（%）：黑色團塊狀鈣結節面積/培養板總面積× 100%[15]。
1.4 統計學方法
采用SPSS17.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Bonferroni檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 細胞增殖活性檢測與細胞毒性評級
用乳酸配制的細胞培養液pH值隨著乳酸濃度增加而降低（表 1）。
當乳酸濃度為4 mmol/L時，培養5 d內A、B組細胞RGR均值均在80%以上，細胞毒性評級均為Ⅰ級或0級，無明顯細胞毒性。當乳酸濃度增大至8 mmol/ L和16 mmol/L時，兩組乳酸培養液均存在細胞毒性，但出現毒性作用的時間不同，A組培養5 d后RGR均值降至50%以下，毒性評級達Ⅲ級，表現明顯細胞毒性；B組培養3 d時，RGR均值降至約50%，顯著抑制細胞增殖，5 d時RGR進一步下降，毒性評級增至Ⅳ級。當乳酸濃度增至22 mmol/L以上，兩組乳酸培養液在培養1 d時即對細胞增殖產生明顯抑制。此外，相同濃度下各時間點A組RGR均高于B組，且除4 mmol/L濃度培養1 d和3 d外，組間比較差異均有統計學意義（P < 0.05）。見表 1。
表1
A、B組細胞增殖活性RGR及細胞毒性評級
Table1.
The RGR and the cytotoxic grades of groups A and B
2.2 ALP活性檢測
培養1 d，A、B組RAR分別為144.1% ± 3.2%和115.2% ± 9.8%，5 d時分別為129.6% ± 9.8%和78.2% ± 6.9%。兩時間點A組均顯著高于B組，差異有統計學意義（F=38.989，P=0.000；F=91.096，P=0.000）。
2.3 von Kossa染色
Von Kossa染色示，培養21 d，A組黑色團狀物明顯多于B、C組（圖 1）。A、B、C組定量分析結果示，A、B、C組鈣結節平均染色密度為91.2% ± 8.2%、50.3% ± 7.9%和54.2% ± 8.6%，A組顯著高于B、C組，比較差異有統計學意義（P < 0.05）；B、C組間差異無統計學意義（P > 0.05）。
圖1
培養21 d各組von Kossa染色觀察（正置相差顯微鏡×40） ?A組 ?B組 ?C組
Figure1.
von Kossa staining of each group after 21 days of culture (Phase contrast microscope× 40) ?Group A ?Group B ?Group C
3 討論
支架材料是骨組織工程的核心要素之一[2]。人工合成的PLA材料雖有良好的降解性和可加工性，但酸性降解產物的累積不利于骨組織重建。為探究酸性降解產物對骨組織工程種子細胞的影響，Brandao-Burch等[9]通過鹽酸調節細胞培養基酸性來模擬PLA降解對體內微環境的改變，研究不同pH值的培養基對Ros17/2.8成骨樣細胞增殖活性和成骨表型影響。結果表明，培養微環境pH值從7.4降至6.87，對細胞增殖無明顯影響。他們研究還發現，用鹽酸調節培養液酸性，pH值降至7.15即會抑制細胞ALP表達和鈣結節形成。Kohn等[10]同樣使用鹽酸調節培養基酸性，也發現微小pH值改變，即pH值從7.2～7.4降至6.9～7.1，會顯著降低BMSCs的ALP活性[10]。
本研究直接以含乳酸的培養液模擬PLA降解引起的局部酸性環境。結果表明，乳酸濃度對細胞增殖有顯著影響，且隨濃度升高，對細胞增殖抑制作用逐漸增強，毒性逐漸增大，這可能與乳酸濃度升高導致培養液pH值下降有關。但低濃度的乳酸（4 mmol/ L）沒有明顯細胞毒性，此時pH值為7.0～7.2。該結果與前述報道結果基本一致。此外，本研究還比較了不同構型的乳酸對細胞增殖的影響。結果發現，在較高濃度（≥8 mmol/ L）下培養相同時間后，L-LA較D，L-LA的毒性作用更小。D，L-LA是在L-LA中加入等量的D-LA，為外消旋乳酸。但人體中存在的乳酸為L-LA，人體正常代謝不產生D-LA。這可能是造成D，L-LA較L-LA毒性大的一個原因。低濃度乳酸（4 mmol/ L）對細胞無明顯細胞毒性，因此我們選用該濃度下的含乳酸培養液培養細胞，研究乳酸組成對細胞ALP活性及鈣結節形成的影響。總體而言，兩種乳酸培養液在培養5 d后，對細胞的ALP活性均沒有強烈的抑制作用，甚至存在促進作用，且L-LA較D，L-LA的促進作用更強。鈣結節是成骨細胞在體外培養時形成的礦化細胞外基質，是成骨細胞分化的最后階段，它的形成標志成骨細胞分化成熟，進入成骨細胞階段，是成骨功能的形態表現。結果表明，乳酸的加入不僅未抑制鈣結節形成，而且L-LA還有促進鈣結節形成的作用。
比較乳酸模擬和鹽酸模擬[9-10]兩種情況，我們發現在相似的pH值條件下，乳酸對細胞增殖有顯著影響，但對ALP活性無明顯抑制，對鈣結節的形成能力也無明顯降低。由此可見，雖然乳酸和鹽酸均可降低培養液pH值，從而模擬PLA降解后造成的局部酸性環境，但兩者對細胞增殖和成骨表型的影響不同，這可能是由于兩種酸的酸性不同所致。體外培養細胞的培養液中有多種營養成分和pH緩沖的酸堿對[16]，由于酸性強弱的不同，對整個培養液緩沖體系的影響也不同，進而對細胞的生長產生不同影響。
乳酸是機體在缺氧環境下糖酵解的產物。既往對乳酸生理作用的研究，主要關注劇烈運動時體內乳酸濃度急劇增加，或外傷、感染引起的乳酸濃度增加對機體的影響 [17-19]。但乳酸對于骨代謝的影響，以及乳酸組成對骨相關生物學效應的影響罕見報道。本研究初步探討了乳酸對Ros17/2.8成骨樣細胞生長和成骨表型的影響，結果提示濃度和組成是重要的影響因素，且相近pH值條件下的乳酸作用效果與鹽酸不同。雖然相關機制尚不清楚，但卻提示PLA降解產生乳酸并非絕對不利，重要的是需要控制降解產物的濃度；PLA制備在單體選擇上，既要兼顧力學性能也需考慮不同的乳酸單體不同的生物學效應。
