引用本文： 豐干鈞, 劉立岷, 龔全, 李濤, 劉浩, 宋躍明. 聚乙烯亞胺為載體的體內核酸轉染研究進展. 中國修復重建外科雜志, 2014, 28(12): 1544-1550. doi: 10.7507/1002-1892.20140334 復制
隨著分子生物學技術的進步，以核酸轉染為手段的基因治療為許多疾病提供了潛在的治療方法。一些傳統方法無法徹底治愈的疾病，如β地中海貧血，已有基因治療的早期臨床報道[1]。同時，核酸轉染及聯合干細胞移植，不僅能用于腫瘤治療，也為組織工程及再生醫學研究提供了新的方向。通過核酸轉染進行基因治療包括兩部分：一部分是治療性核酸（如質粒DNA）、治療性蛋白（如血管生成抑制劑、凋亡前蛋白、藥物前體激活劑或免疫反應調節劑）、小分子RNA（如沉默腺嘌呤核苷酸轉運蛋白），另一部分為核酸載體。既往研究基因治療常使用病毒載體，包括腺病毒、慢病毒等。如2003年國內開始將攜帶p53基因的腺病毒載體用于臨床治療頭頸部鱗狀細胞癌[2]。盡管病毒轉染效率高，但具有較高的副反應及風險（如致癌性），限制了臨床使用。因此，學者們努力尋求使用非病毒載體，如高分子聚合物，達到通過核酸轉染進行基因治療的目的。
高分子聚合物是生物醫用材料中發展最早、應用最廣泛的材料，其首先用于制備手術縫合線，距今已有40多年歷史；作為組織工程支架用于心血管系統、軟組織及硬組織修復方面，已進行了大量基礎及臨床研究。將其作為核酸轉染的載體也是當前研究熱點之一。大多數高分子聚合物因帶陽離子（正電荷），能與帶陰離子（負電荷）的質粒DNA結合，具有攜帶質粒DNA的能力。在各種高分子聚合物中，聚乙烯亞胺 [poly（ethylenimine），PEI]因成本較低及轉染效率較高，成為了研究熱點。現回顧近年PEI介導的核酸轉染研究現狀，總結并分析發展方向，為其進一步應用于腫瘤治療或組織工程提供參考。
1 PEI及其衍生物的結構和特性
PEI是乙烯亞胺的聚合物，在pH < 7.4的水溶液中形成聚陽離子。研究表明，粘結蛋白聚糖所介導的細胞黏附是非病毒載體（如PEI）內部化的重要步驟[3]。在轉染過程中，粘結蛋白分子側向擴散，聚集形成富含膽固醇的團塊，使細胞膜與PEI載體間形成靜電結合。粘結蛋白聚糖分子的成簇反應同樣可以激發蛋白激酶活性，從而誘導肌動蛋白與粘結蛋白聚糖的胞質尾區結合。因此，PEI易與細胞膜結合的特性有助于細胞對PEI復合物的吞噬。
PEI具有分支狀（初級、次級或三級胺結構）或線性（僅有次級胺結構）的同分異構體結構。分支狀PEI（branched PEI，bPEI）相對分子質量為25×103[4]，因其合成方便且價格低廉，已作為核酸載體用于動物實驗。bPEI及其衍生物可用于轉染多種核酸，包括寡核苷酸、質粒及核糖酶。bPEI的轉染效率很大程度依賴于自身的理化特性（如相對分子質量、分支程度及陽離子電荷密度）、核酸形成復合物的特性（如顆粒大小、界面電位）、具體實驗條件（如孵化時間、聚合物濃度）[5-8]。體內實驗表明，bPEI的毒性通常與誘導紅細胞聚集形成的微血栓相關[9]。除bPEI外，還有通過陽離子開環反應合成的線性PEI（linear PEI，lPEI）。與bPEI比較，lPEI難以大量合成，相關研究相對較少。
bPEI與lPEI在DNA壓縮程度、核酸攝取程度及生物學表現方面均不同[10-11]。bPEI形成的聚合物顆粒較小，通常為納米級，而lPEI在含鹽溶液中聚集形成微米級聚合物。lPEI形成的復合物具有較低的表面電位，毒性比bPEI小，轉染效率更高[12-13]。但體內實驗結果與體外結果存在差異[14]。有文獻報道，對小鼠模型通過氣霧劑吸入的方法進行轉染，lPEI轉染效率低于bPEI；但通過小鼠鼻部滴注給藥的方法，lPEI熒光強度達bPEI 10倍以上 [14]。這些差異可能與給藥方法、復合物制備方法以及轉染情況不同有關。因此，通過動物模型研究PEI結構對轉染效率的影響非常重要。
有研究采用不具有任何衍生物結構的PEI作為核酸轉染載體，探索實驗條件對PEI介導的轉染的影響。Min等[15]研究表明，在添加多肽修飾情況下，bPEI/DNA復合物轉染效率較傳統bPEI/DNA復合物和脂質體/DNA復合物高2.5～3.5倍。Jeudy等[16]發現lPEI/DNA復合物在添加腎上腺素（1 mg/L）情況下，轉染效率增強而毒副作用無明顯改變。此外，受體的生理狀況也會影響轉染效率。Tada等[17]研究表明在局部肝切除術后小鼠的肝臟中，標記轉染核酸的熒光信號強度比未進行肝切除術的對照小鼠增加了70倍。這表明細胞狀況與PEI介導的核酸轉染效率密切相關。
PEI可有效濃縮核酸材料，在體外引起非特異性細胞內吞作用，從而具有較高的轉染效率，但體內實驗轉染效率明顯降低。這可能與體內給藥系統的復雜組成有關：因為未修飾的PEI/DNA復合體可與體內白蛋白、纖維蛋白原、免疫球蛋白D（IgD）、IgM、甲狀腺素運載蛋白、載脂蛋白、紅細胞等結合，導致其被體內的網狀內皮系統或核酸酶清除，致使轉染效率下降。這嚴重限制了PEI攜帶的核酸到達治療部位的數量。為避免以上問題的發生，學者們提出了各種提高PEI體內轉染效率的方法。其中，聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）修飾是最常用方法。PEG可增加PEI/核酸復合物的溶解度，并減輕PEI/核酸復合物在體內聚集。因為PEG的疏水特性，PEG修飾可延長PEI/核酸復合物在血循環中的停留時間，減少巨噬細胞對PEI/核酸復合物的吞噬作用，所以適用于系統給藥。除此之外，因為PEG修飾可增強PEI/核酸復合物對血管的滲透性，PEG修飾后的PEI/核酸復合物在腫瘤部位的停留時間和作用時間均可延長。
關于PEG修飾PEI的研究，大部分是在PEI與DNA結合形成復合物之前將PEG與PEI結合，少數是在PEI/DNA復合物形成后通過共價交聯與PEG結合。這兩種方法均可減少PEI/DNA復合物與血漿蛋白結合及紅細胞聚集，從而提高轉染效率[18-19]。PEG修飾的特定效果是由PEG的相對分子質量、密度、結構以及彈性決定。事實上，盡管PEG修飾能延長PEI/DNA復合物在循環系統的停留時間，但也可能影響PEI對DNA復合物的裝載效果，阻礙細胞通過內吞作用攝入PEI/DNA復合物，最終影響PEI/DNA復合物的轉染效率。研究報道，經PEG修飾的PEI/DNA復合物因在血液中過早解離而導致對肝臟的轉染效率下降。Mishra等[20]研究表明，盡管PEG修飾增強了PEI顆粒對鹽溶液的穩定性，但降低了細胞內的熒光信號強度。目前優化PEG修飾的程度和大小是發展PEG修飾載體的關鍵步驟。
克服PEG修飾不利影響的方法之一是在PEI/核酸復合物和PEG修飾之間通過酸性不穩定連接（如腙、乙縮醛、乙烯醚）結合，形成環境響應性PEI/核酸復合物。在細胞內酸性環境下，PEG與PEI/核酸復合物之間的連接可水解，從而釋放PEI/核酸復合物，促進其通過內吞作用進入細胞內。除此之外，在PEG上連接靶向配體可減少PEI/核酸復合物與血漿成分的非特異性反應，從而減少非特異性細胞攝取 [21-22]。因此，使用酸性不穩定連接以及靶向配體是優化及提高PEG修飾載體轉染效率的有效方法。
除PEG外，常用來修飾PEI衍生物的是聚乳酸乙醇酸[poly（lactic-co-glycolic acid），PLGA]。研究表明，將PLGA加入PEI不僅能提高體內轉染效率，也是一種有效的DNA疫苗接種方法，如小鼠肺部吸入載有Rv1733c DNA的PLGA-bPEI納米顆粒，可刺激T細胞增殖以及IFN-γ產生[23-24]。
2 體內轉染途徑
關于體內轉染途徑的研究，以大鼠尾靜脈注射為主。與其他核酸轉染途徑相比，系統靜脈內給藥對腫瘤及遠處器官，特別是代謝性結節具有優勢。有研究觀察了系統給藥后受體的生理狀況以及轉染效率，Sasaki等[24]通過皮下注射四氯化碳制造小鼠肝炎模型，研究了在疾病狀態下PEI介導的質粒轉染效果。結果顯示與肝再生階段（注射后48 h）相比，在嚴重肝炎階段（注射后18 h），PEI介導的轉基因表達明顯降低，提示嚴格管理轉基因治療時間的重要性。
對PEI/DNA復合物添加功能性配體可實現系統靶向給藥，已通過使用轉鐵蛋白證實。早期研究表明，將轉鐵蛋白加入PEI顆粒可提高細胞內吞作用，并指向特定的腫瘤組織；在較高的修飾密度基礎上，轉鐵蛋白可引出有效的電荷屏蔽，并對PEI/DNA復合物提供有效保護[6]。最近，Liu等[25]研究表明，轉鐵蛋白受體可作為靶向治療惡性黑色素瘤的表面標志物。同時，使用PEI/轉鐵蛋白試劑盒，系統性轉入HIF-1α-短鏈RNA能有效抑制腫瘤生長。他們的結果提示了使用核酸轉染治療的有效性。
除系統給藥外，肺部給藥也是常用給藥方式。肺部是核酸轉染較困難的部位，不僅因為杯狀細胞分泌的黏膜層具有屏障作用，還因為肺泡巨噬細胞的清除以及緊密連接的上皮細胞滲透性低限制了胞內轉運。PEI被認為相比陽離子脂質，對肺部上皮細胞具有更高的轉染效率。氣管內滴注是肺部核酸轉染常用的給藥方式。通過這種給藥方式，Chen等[21]將DNA與半乳糖-PEG-bPEI混合物使用到小鼠的肺部，結果顯示轉染效率比單純使用bPEI高11.6倍。Di Gioia等[26]將鋁/bPEI混合物靜脈注射至小鼠體內，結果顯示可產生長時間的熒光轉染表達。目前，氣管內滴注是動物模型上最常用的方法之一，盡管實驗均取得了較好結果，但該方式在人體難以應用，限制了進一步的臨床使用。一些研究將霧化作為氣管內滴注的改進方法。與氣管內滴注可能導致實驗動物明顯的毒性反應（如體重明顯下降、滴注后恢復時間較長）相比較，霧化吸入bPEI/DNA復合物后毒性反應明顯減輕。此外，鼻部給藥可直接沿嗅神經進入腦部，具有治療神經系統病變的潛能。微絨毛覆蓋的上皮表面和高度血管化的鼻腔上皮下層提供了藥物吸收所需要的足夠表面積，霧化吸入為下一步臨床治療提供了一種可行的給藥途徑。
第3種常見的治療途徑為局部注射。文獻報道，將lPEI/核酸復合物（含有治療性質粒）直接注射至小鼠腫瘤局部，可顯著抑制腫瘤生長[27]。局部注射是針對惡性腫瘤最直接有效的方法[27]，然而如果腫瘤發生全身多處轉移，該方法應用則受限。
3 核酸轉染的生物學參數
PEI介導的核酸轉染受轉染條件、載體結構及給藥方式影響。除上述因素外，體內轉染受到的影響因素更為復雜。該技術的實用性也受其他參數，如細胞毒性、系統副反應等影響，這在PEI（相對分子質量25×103）尤為明顯。盡管PEI作為核酸轉染載體被廣泛用于基因治療研究中，但因毒性較大，用于臨床仍有較大困難。研究表明，通過氣管內滴入bPEI/鋁 （N/P比例為30）復合物后，40%小鼠在術后1 d死亡，鼻腔滴入bPEI （相對分子質量25×103）后24 h內8.6%小鼠發生死亡[26, 28]。目前大多數研究仍未測量PEI介導的體內核酸轉染毒性。
轉基因表達的持續時間是另一個需要詳細測量的參數。大多數PEI載體無法形成長期的轉基因表達，文獻報道最短的半衰期跨度是數分鐘，將摻有DNA的支架埋入大鼠皮下也僅能維持數周[18]。轉染時間較短可能與免疫系統對載體的清除以及轉基因細胞的丟失有關。為了延長轉染時間，常需要重復給藥。
最后，在核酸轉染中也應注意PEI/核酸復合物的生物分布。研究表明，靜脈給藥后PEI/核酸復合物分布于肝臟、脾臟、腎臟、肺以及血液系統[18]。通過與配體（如轉鐵蛋白）的共價結合或與腫瘤特異性的肽段（如CNGRC）結合，可在腫瘤組織出現更高水平的表達[29]。
4 PEI在組織工程的應用
PEI介導的核酸轉染在組織工程中多用于成骨修復（顱骨缺損模型）、軟骨修復（關節腔內注射）、角膜修復（局部注射）。與腫瘤治療多通過靜脈注射系統給藥不同，其在組織工程中多用于局部。原因主要為：腫瘤全身多處轉移需要系統給藥靶向作用，而組織工程修復多集中在某個缺損或退變部位；腫瘤部位血管非正常生長，血管壁上存在較大間隙有利于基因轉染藥物滲出并在腫瘤部位積聚，而組織工程修復處無此特點。相反，軟骨或角膜本身為血管生長較為緩慢部位，系統給藥不利于藥物到達或釋放。
Huang等[30]將含有bPEI濃縮的質粒DNA通過PLGA支架釋放，能有效修復小鼠顱骨缺損，而空白支架修復效果較差。Kawazu等[31]將PEI與鏈霉素輸入蛋白復合形成混合載體，可有效轉染骨保護素至骨膜周圍組織，促進大鼠骨愈合。Liu等[32]研究表明，將PEG修飾后的PEI介導核酸轉染可有效提高活體轉染效率，促進小鼠顱骨缺損修復。d’Ayala等[33]將PEI與聚己內酯形成混合物轉染小鼠成骨細胞，可提高成骨細胞相關成骨基因活性，增強轉染效率。Orsi等[34]將PEI/DNA復合物在三維膠原支架上釋放，可有效增強細胞成骨活性，該體系可促進小鼠顱骨缺損修復。
Mountziaris等[35]將具有沉默免疫球蛋白IgG受體（CD16）siRNA與PEI結合形成anti-FcγRⅢ-siRNA-PEI 復合物，并通過PLGA微球注射入大鼠膝關節，可減輕關節疼痛并維持關節間隙高度。Pi等[36]將具有靶向作用的多肽修飾PEI，并用修飾后的PEI介導核酸轉染。該PEI/核酸復合物在兔膝關節腔內注射具有良好的靶向作用及修復效果，為進一步基因治療膝關節退變奠定基礎。
Kuo等[37]研究表明，含有FGF質粒的bPEI復合物能有效促進大鼠角膜邊緣血管生長，而對照組（不含有治療性質粒）無明顯新生血管。Yuan等[38]將IL-1受體拮抗基因通過PEI轉染至大鼠角膜，可有效原位轉染，減輕炎性反應。
盡管PEI及其衍生物在組織工程修復中顯示出良好的前景，但仍具有局限性。例如活體轉染效率較低，增加轉染效率需要提高其濃度，但會導致細胞毒性增加。此外，體內轉染易被體內的核酸酶或網狀內皮系統捕獲失去其活性，喪失治療效果。近年來，許多研究小組通過減小PEI相對分子質量，增加PEG修飾等辦法降低細胞毒性，提高轉染效率，其體內轉染效果有待進一步實驗驗證。
5 展望
PEI介導的核酸轉染可用于腫瘤、肺部疾病的治療，核酸疫苗，生理缺損的修復（顱骨缺損以及角膜上皮缺損）。相關文獻報道的體內實驗總結見表 1。
表1
PEI及其衍生物的治療性應用
Table1.
Therapeutic appeal of PEI and its derivatives
隨著核酸轉染治療的進步，一些PEI為基礎的載體逐漸進入臨床試驗階段。未來的研究方向不僅包括核酸轉染應用于軀體組織，也包括核酸轉染于干細胞。以干細胞為基礎的基因治療受到越來越多的關注。臨床上，Gaspar等[48]對馬法蘭給藥后的嚴重免疫缺陷患者使用基因修飾的造血干細胞治療，不僅可以產生造血作用，而且達到腺苷酸脫氨基酶代謝物的解毒作用，同時可促進白細胞數目增加。盡管如此，這些治療的有效性在很大程度上仍依賴于干細胞釋放治療性蛋白的能力。
盡管病毒可將基因高效轉染入干細胞，但毒性大、成本高。其潛在的安全隱患促使科學家不斷研發非病毒載體[49]。然而，目前的非病毒載體轉染效率遠遠不能讓人滿意。bPEI介導的干細胞轉染效率低于5%。早期研究表明細胞因素（如細胞周期）可能影響陽離子脂質體的轉染效率，但這些因素是否影響PEI介導的干細胞轉染效率仍待進一步研究。
與核酸轉染至干細胞不同，另一個未來的研究領域是聚合物的RNA轉染。隨著RNA干擾技術的出現，越來越多的研究探索RNA干擾的臨床應用。為了實現有效的RNA干擾，RNA應首先轉運到其作用部位。因為PEI復合體是一種可行的RNA分子轉運方式并保護其不被溶核反應降解，因此許多研究嘗試使用PEI為載體的RNA干擾技術。然而，大多數這類研究仍限于細胞水平，缺乏體內實驗。
因為質粒DNA與治療性RNA分子（如siRNA和反義RNA寡核苷酸）作用機制不同，這些復合物被轉運至細胞內發揮作用的部位也不同。質粒DNA應被送入細胞核，而RNA分子應在細胞質內釋放。高分子聚合物介導的RNA干擾已有體內實驗的文獻報道[50]。一種高分子聚合物和siRNA的復合物已進入一期臨床實驗治療腫瘤。盡管該分子并不是PEI的衍生物，但該研究說明通過高分子聚合物復合siRNA靶向治療的臨床可行性。隨著對RNA載體的優化，有望出現大量RNA為基礎的治療。
隨著分子生物學技術的進步，以核酸轉染為手段的基因治療為許多疾病提供了潛在的治療方法。一些傳統方法無法徹底治愈的疾病，如β地中海貧血，已有基因治療的早期臨床報道[1]。同時，核酸轉染及聯合干細胞移植，不僅能用于腫瘤治療，也為組織工程及再生醫學研究提供了新的方向。通過核酸轉染進行基因治療包括兩部分：一部分是治療性核酸（如質粒DNA）、治療性蛋白（如血管生成抑制劑、凋亡前蛋白、藥物前體激活劑或免疫反應調節劑）、小分子RNA（如沉默腺嘌呤核苷酸轉運蛋白），另一部分為核酸載體。既往研究基因治療常使用病毒載體，包括腺病毒、慢病毒等。如2003年國內開始將攜帶p53基因的腺病毒載體用于臨床治療頭頸部鱗狀細胞癌[2]。盡管病毒轉染效率高，但具有較高的副反應及風險（如致癌性），限制了臨床使用。因此，學者們努力尋求使用非病毒載體，如高分子聚合物，達到通過核酸轉染進行基因治療的目的。
高分子聚合物是生物醫用材料中發展最早、應用最廣泛的材料，其首先用于制備手術縫合線，距今已有40多年歷史；作為組織工程支架用于心血管系統、軟組織及硬組織修復方面，已進行了大量基礎及臨床研究。將其作為核酸轉染的載體也是當前研究熱點之一。大多數高分子聚合物因帶陽離子（正電荷），能與帶陰離子（負電荷）的質粒DNA結合，具有攜帶質粒DNA的能力。在各種高分子聚合物中，聚乙烯亞胺 [poly（ethylenimine），PEI]因成本較低及轉染效率較高，成為了研究熱點。現回顧近年PEI介導的核酸轉染研究現狀，總結并分析發展方向，為其進一步應用于腫瘤治療或組織工程提供參考。
1 PEI及其衍生物的結構和特性
PEI是乙烯亞胺的聚合物，在pH < 7.4的水溶液中形成聚陽離子。研究表明，粘結蛋白聚糖所介導的細胞黏附是非病毒載體（如PEI）內部化的重要步驟[3]。在轉染過程中，粘結蛋白分子側向擴散，聚集形成富含膽固醇的團塊，使細胞膜與PEI載體間形成靜電結合。粘結蛋白聚糖分子的成簇反應同樣可以激發蛋白激酶活性，從而誘導肌動蛋白與粘結蛋白聚糖的胞質尾區結合。因此，PEI易與細胞膜結合的特性有助于細胞對PEI復合物的吞噬。
PEI具有分支狀（初級、次級或三級胺結構）或線性（僅有次級胺結構）的同分異構體結構。分支狀PEI（branched PEI，bPEI）相對分子質量為25×103[4]，因其合成方便且價格低廉，已作為核酸載體用于動物實驗。bPEI及其衍生物可用于轉染多種核酸，包括寡核苷酸、質粒及核糖酶。bPEI的轉染效率很大程度依賴于自身的理化特性（如相對分子質量、分支程度及陽離子電荷密度）、核酸形成復合物的特性（如顆粒大小、界面電位）、具體實驗條件（如孵化時間、聚合物濃度）[5-8]。體內實驗表明，bPEI的毒性通常與誘導紅細胞聚集形成的微血栓相關[9]。除bPEI外，還有通過陽離子開環反應合成的線性PEI（linear PEI，lPEI）。與bPEI比較，lPEI難以大量合成，相關研究相對較少。
bPEI與lPEI在DNA壓縮程度、核酸攝取程度及生物學表現方面均不同[10-11]。bPEI形成的聚合物顆粒較小，通常為納米級，而lPEI在含鹽溶液中聚集形成微米級聚合物。lPEI形成的復合物具有較低的表面電位，毒性比bPEI小，轉染效率更高[12-13]。但體內實驗結果與體外結果存在差異[14]。有文獻報道，對小鼠模型通過氣霧劑吸入的方法進行轉染，lPEI轉染效率低于bPEI；但通過小鼠鼻部滴注給藥的方法，lPEI熒光強度達bPEI 10倍以上 [14]。這些差異可能與給藥方法、復合物制備方法以及轉染情況不同有關。因此，通過動物模型研究PEI結構對轉染效率的影響非常重要。
有研究采用不具有任何衍生物結構的PEI作為核酸轉染載體，探索實驗條件對PEI介導的轉染的影響。Min等[15]研究表明，在添加多肽修飾情況下，bPEI/DNA復合物轉染效率較傳統bPEI/DNA復合物和脂質體/DNA復合物高2.5～3.5倍。Jeudy等[16]發現lPEI/DNA復合物在添加腎上腺素（1 mg/L）情況下，轉染效率增強而毒副作用無明顯改變。此外，受體的生理狀況也會影響轉染效率。Tada等[17]研究表明在局部肝切除術后小鼠的肝臟中，標記轉染核酸的熒光信號強度比未進行肝切除術的對照小鼠增加了70倍。這表明細胞狀況與PEI介導的核酸轉染效率密切相關。
PEI可有效濃縮核酸材料，在體外引起非特異性細胞內吞作用，從而具有較高的轉染效率，但體內實驗轉染效率明顯降低。這可能與體內給藥系統的復雜組成有關：因為未修飾的PEI/DNA復合體可與體內白蛋白、纖維蛋白原、免疫球蛋白D（IgD）、IgM、甲狀腺素運載蛋白、載脂蛋白、紅細胞等結合，導致其被體內的網狀內皮系統或核酸酶清除，致使轉染效率下降。這嚴重限制了PEI攜帶的核酸到達治療部位的數量。為避免以上問題的發生，學者們提出了各種提高PEI體內轉染效率的方法。其中，聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）修飾是最常用方法。PEG可增加PEI/核酸復合物的溶解度，并減輕PEI/核酸復合物在體內聚集。因為PEG的疏水特性，PEG修飾可延長PEI/核酸復合物在血循環中的停留時間，減少巨噬細胞對PEI/核酸復合物的吞噬作用，所以適用于系統給藥。除此之外，因為PEG修飾可增強PEI/核酸復合物對血管的滲透性，PEG修飾后的PEI/核酸復合物在腫瘤部位的停留時間和作用時間均可延長。
關于PEG修飾PEI的研究，大部分是在PEI與DNA結合形成復合物之前將PEG與PEI結合，少數是在PEI/DNA復合物形成后通過共價交聯與PEG結合。這兩種方法均可減少PEI/DNA復合物與血漿蛋白結合及紅細胞聚集，從而提高轉染效率[18-19]。PEG修飾的特定效果是由PEG的相對分子質量、密度、結構以及彈性決定。事實上，盡管PEG修飾能延長PEI/DNA復合物在循環系統的停留時間，但也可能影響PEI對DNA復合物的裝載效果，阻礙細胞通過內吞作用攝入PEI/DNA復合物，最終影響PEI/DNA復合物的轉染效率。研究報道，經PEG修飾的PEI/DNA復合物因在血液中過早解離而導致對肝臟的轉染效率下降。Mishra等[20]研究表明，盡管PEG修飾增強了PEI顆粒對鹽溶液的穩定性，但降低了細胞內的熒光信號強度。目前優化PEG修飾的程度和大小是發展PEG修飾載體的關鍵步驟。
克服PEG修飾不利影響的方法之一是在PEI/核酸復合物和PEG修飾之間通過酸性不穩定連接（如腙、乙縮醛、乙烯醚）結合，形成環境響應性PEI/核酸復合物。在細胞內酸性環境下，PEG與PEI/核酸復合物之間的連接可水解，從而釋放PEI/核酸復合物，促進其通過內吞作用進入細胞內。除此之外，在PEG上連接靶向配體可減少PEI/核酸復合物與血漿成分的非特異性反應，從而減少非特異性細胞攝取 [21-22]。因此，使用酸性不穩定連接以及靶向配體是優化及提高PEG修飾載體轉染效率的有效方法。
除PEG外，常用來修飾PEI衍生物的是聚乳酸乙醇酸[poly（lactic-co-glycolic acid），PLGA]。研究表明，將PLGA加入PEI不僅能提高體內轉染效率，也是一種有效的DNA疫苗接種方法，如小鼠肺部吸入載有Rv1733c DNA的PLGA-bPEI納米顆粒，可刺激T細胞增殖以及IFN-γ產生[23-24]。
2 體內轉染途徑
關于體內轉染途徑的研究，以大鼠尾靜脈注射為主。與其他核酸轉染途徑相比，系統靜脈內給藥對腫瘤及遠處器官，特別是代謝性結節具有優勢。有研究觀察了系統給藥后受體的生理狀況以及轉染效率，Sasaki等[24]通過皮下注射四氯化碳制造小鼠肝炎模型，研究了在疾病狀態下PEI介導的質粒轉染效果。結果顯示與肝再生階段（注射后48 h）相比，在嚴重肝炎階段（注射后18 h），PEI介導的轉基因表達明顯降低，提示嚴格管理轉基因治療時間的重要性。
對PEI/DNA復合物添加功能性配體可實現系統靶向給藥，已通過使用轉鐵蛋白證實。早期研究表明，將轉鐵蛋白加入PEI顆粒可提高細胞內吞作用，并指向特定的腫瘤組織；在較高的修飾密度基礎上，轉鐵蛋白可引出有效的電荷屏蔽，并對PEI/DNA復合物提供有效保護[6]。最近，Liu等[25]研究表明，轉鐵蛋白受體可作為靶向治療惡性黑色素瘤的表面標志物。同時，使用PEI/轉鐵蛋白試劑盒，系統性轉入HIF-1α-短鏈RNA能有效抑制腫瘤生長。他們的結果提示了使用核酸轉染治療的有效性。
除系統給藥外，肺部給藥也是常用給藥方式。肺部是核酸轉染較困難的部位，不僅因為杯狀細胞分泌的黏膜層具有屏障作用，還因為肺泡巨噬細胞的清除以及緊密連接的上皮細胞滲透性低限制了胞內轉運。PEI被認為相比陽離子脂質，對肺部上皮細胞具有更高的轉染效率。氣管內滴注是肺部核酸轉染常用的給藥方式。通過這種給藥方式，Chen等[21]將DNA與半乳糖-PEG-bPEI混合物使用到小鼠的肺部，結果顯示轉染效率比單純使用bPEI高11.6倍。Di Gioia等[26]將鋁/bPEI混合物靜脈注射至小鼠體內，結果顯示可產生長時間的熒光轉染表達。目前，氣管內滴注是動物模型上最常用的方法之一，盡管實驗均取得了較好結果，但該方式在人體難以應用，限制了進一步的臨床使用。一些研究將霧化作為氣管內滴注的改進方法。與氣管內滴注可能導致實驗動物明顯的毒性反應（如體重明顯下降、滴注后恢復時間較長）相比較，霧化吸入bPEI/DNA復合物后毒性反應明顯減輕。此外，鼻部給藥可直接沿嗅神經進入腦部，具有治療神經系統病變的潛能。微絨毛覆蓋的上皮表面和高度血管化的鼻腔上皮下層提供了藥物吸收所需要的足夠表面積，霧化吸入為下一步臨床治療提供了一種可行的給藥途徑。
第3種常見的治療途徑為局部注射。文獻報道，將lPEI/核酸復合物（含有治療性質粒）直接注射至小鼠腫瘤局部，可顯著抑制腫瘤生長[27]。局部注射是針對惡性腫瘤最直接有效的方法[27]，然而如果腫瘤發生全身多處轉移，該方法應用則受限。
3 核酸轉染的生物學參數
PEI介導的核酸轉染受轉染條件、載體結構及給藥方式影響。除上述因素外，體內轉染受到的影響因素更為復雜。該技術的實用性也受其他參數，如細胞毒性、系統副反應等影響，這在PEI（相對分子質量25×103）尤為明顯。盡管PEI作為核酸轉染載體被廣泛用于基因治療研究中，但因毒性較大，用于臨床仍有較大困難。研究表明，通過氣管內滴入bPEI/鋁 （N/P比例為30）復合物后，40%小鼠在術后1 d死亡，鼻腔滴入bPEI （相對分子質量25×103）后24 h內8.6%小鼠發生死亡[26, 28]。目前大多數研究仍未測量PEI介導的體內核酸轉染毒性。
轉基因表達的持續時間是另一個需要詳細測量的參數。大多數PEI載體無法形成長期的轉基因表達，文獻報道最短的半衰期跨度是數分鐘，將摻有DNA的支架埋入大鼠皮下也僅能維持數周[18]。轉染時間較短可能與免疫系統對載體的清除以及轉基因細胞的丟失有關。為了延長轉染時間，常需要重復給藥。
最后，在核酸轉染中也應注意PEI/核酸復合物的生物分布。研究表明，靜脈給藥后PEI/核酸復合物分布于肝臟、脾臟、腎臟、肺以及血液系統[18]。通過與配體（如轉鐵蛋白）的共價結合或與腫瘤特異性的肽段（如CNGRC）結合，可在腫瘤組織出現更高水平的表達[29]。
4 PEI在組織工程的應用
PEI介導的核酸轉染在組織工程中多用于成骨修復（顱骨缺損模型）、軟骨修復（關節腔內注射）、角膜修復（局部注射）。與腫瘤治療多通過靜脈注射系統給藥不同，其在組織工程中多用于局部。原因主要為：腫瘤全身多處轉移需要系統給藥靶向作用，而組織工程修復多集中在某個缺損或退變部位；腫瘤部位血管非正常生長，血管壁上存在較大間隙有利于基因轉染藥物滲出并在腫瘤部位積聚，而組織工程修復處無此特點。相反，軟骨或角膜本身為血管生長較為緩慢部位，系統給藥不利于藥物到達或釋放。
Huang等[30]將含有bPEI濃縮的質粒DNA通過PLGA支架釋放，能有效修復小鼠顱骨缺損，而空白支架修復效果較差。Kawazu等[31]將PEI與鏈霉素輸入蛋白復合形成混合載體，可有效轉染骨保護素至骨膜周圍組織，促進大鼠骨愈合。Liu等[32]研究表明，將PEG修飾后的PEI介導核酸轉染可有效提高活體轉染效率，促進小鼠顱骨缺損修復。d’Ayala等[33]將PEI與聚己內酯形成混合物轉染小鼠成骨細胞，可提高成骨細胞相關成骨基因活性，增強轉染效率。Orsi等[34]將PEI/DNA復合物在三維膠原支架上釋放，可有效增強細胞成骨活性，該體系可促進小鼠顱骨缺損修復。
Mountziaris等[35]將具有沉默免疫球蛋白IgG受體（CD16）siRNA與PEI結合形成anti-FcγRⅢ-siRNA-PEI 復合物，并通過PLGA微球注射入大鼠膝關節，可減輕關節疼痛并維持關節間隙高度。Pi等[36]將具有靶向作用的多肽修飾PEI，并用修飾后的PEI介導核酸轉染。該PEI/核酸復合物在兔膝關節腔內注射具有良好的靶向作用及修復效果，為進一步基因治療膝關節退變奠定基礎。
Kuo等[37]研究表明，含有FGF質粒的bPEI復合物能有效促進大鼠角膜邊緣血管生長，而對照組（不含有治療性質粒）無明顯新生血管。Yuan等[38]將IL-1受體拮抗基因通過PEI轉染至大鼠角膜，可有效原位轉染，減輕炎性反應。
盡管PEI及其衍生物在組織工程修復中顯示出良好的前景，但仍具有局限性。例如活體轉染效率較低，增加轉染效率需要提高其濃度，但會導致細胞毒性增加。此外，體內轉染易被體內的核酸酶或網狀內皮系統捕獲失去其活性，喪失治療效果。近年來，許多研究小組通過減小PEI相對分子質量，增加PEG修飾等辦法降低細胞毒性，提高轉染效率，其體內轉染效果有待進一步實驗驗證。
5 展望
PEI介導的核酸轉染可用于腫瘤、肺部疾病的治療，核酸疫苗，生理缺損的修復（顱骨缺損以及角膜上皮缺損）。相關文獻報道的體內實驗總結見表 1。
表1
PEI及其衍生物的治療性應用
Table1.
Therapeutic appeal of PEI and its derivatives
隨著核酸轉染治療的進步，一些PEI為基礎的載體逐漸進入臨床試驗階段。未來的研究方向不僅包括核酸轉染應用于軀體組織，也包括核酸轉染于干細胞。以干細胞為基礎的基因治療受到越來越多的關注。臨床上，Gaspar等[48]對馬法蘭給藥后的嚴重免疫缺陷患者使用基因修飾的造血干細胞治療，不僅可以產生造血作用，而且達到腺苷酸脫氨基酶代謝物的解毒作用，同時可促進白細胞數目增加。盡管如此，這些治療的有效性在很大程度上仍依賴于干細胞釋放治療性蛋白的能力。
盡管病毒可將基因高效轉染入干細胞，但毒性大、成本高。其潛在的安全隱患促使科學家不斷研發非病毒載體[49]。然而，目前的非病毒載體轉染效率遠遠不能讓人滿意。bPEI介導的干細胞轉染效率低于5%。早期研究表明細胞因素（如細胞周期）可能影響陽離子脂質體的轉染效率，但這些因素是否影響PEI介導的干細胞轉染效率仍待進一步研究。
與核酸轉染至干細胞不同，另一個未來的研究領域是聚合物的RNA轉染。隨著RNA干擾技術的出現，越來越多的研究探索RNA干擾的臨床應用。為了實現有效的RNA干擾，RNA應首先轉運到其作用部位。因為PEI復合體是一種可行的RNA分子轉運方式并保護其不被溶核反應降解，因此許多研究嘗試使用PEI為載體的RNA干擾技術。然而，大多數這類研究仍限于細胞水平，缺乏體內實驗。
因為質粒DNA與治療性RNA分子（如siRNA和反義RNA寡核苷酸）作用機制不同，這些復合物被轉運至細胞內發揮作用的部位也不同。質粒DNA應被送入細胞核，而RNA分子應在細胞質內釋放。高分子聚合物介導的RNA干擾已有體內實驗的文獻報道[50]。一種高分子聚合物和siRNA的復合物已進入一期臨床實驗治療腫瘤。盡管該分子并不是PEI的衍生物，但該研究說明通過高分子聚合物復合siRNA靶向治療的臨床可行性。隨著對RNA載體的優化，有望出現大量RNA為基礎的治療。
