引用本文： 王運濤, 吳小濤, 王鋒, 朱厚毅, 王小虎, 時睿. 髓核中p16INK4a的表達及其對椎間盤退變的影響. 中國修復重建外科雜志, 2014, 28(12): 1514-1518. doi: 10.7507/1002-1892.20140328 復制
椎間盤退變是一個多因素參與的慢性過程，退變的椎間盤共同表現為髓核細胞（nucleus pulposus cells，NPCs）數量減少和功能降低，Ⅱ型膠原、蛋白聚糖等基質大分子降解[1-5]。遺傳傾向、炎性因子、細胞凋亡、營養障礙等因素均與椎間盤退變相關，而細胞的衰老在此過程中起著重要作用[6-9]。在人類很多衰老體細胞中均可見p16INK4a表達累積現象，它是衰老的重要調控基因[6- 8，10]。Le Maitre等[7]發現隨著患者年齡和椎間盤退變分級的增加，衰老NPCs比例增加，而p16INK4a在這一過程中起重要作用；但Kim等[6]對p16INK4a參與這一過程的調控持否定觀點，認為是端粒依賴的p53/p21途徑起主導作用。鑒于此，本研究擬對同一年齡段、不同程度腰椎間盤退變患者髓核中p16INK4a的表達進行探討。由于椎間盤組織中含血小板凝血酶敏感蛋白的解聚素與金屬蛋白酶5（A disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs 5，ADAMTS 5），是降解細胞外基質成分聚集蛋白聚糖（Aggrecan）的主要金屬蛋白酶，同時Sry相關的HMG盒轉錄因子9（Sry-related HMG box transcription factor 9，Sox-9）作為一種特異的轉錄因子參與了椎間盤從發育到成熟的過程[11-12]，因此本研究選取Aggrecan、ADAMTS 5、Sox-9作為椎間盤退變的評價指標，擬探討p16INK4a的表達與椎間盤退變的關系，為退變椎間盤的生物學修復提供依據。報告如下。
1 材料與方法
1.1 主要試劑與儀器
聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜（Millipore公司，美國）；彩色預染蛋白分子量標準（Fermentas公司，加拿大）；兔抗人Aggrecan多克隆抗體、兔抗人ADAMTS 5多克隆抗體、兔抗人Sox-9多克隆抗體、鼠抗人p16INK4a多克隆抗體、兔抗人GAPDH多克隆抗體（Abcam公司，英國）；辣根過氧化物酶標記的羊抗兔、羊抗鼠IgG抗體（Bioworld公司，美國）；羊抗兔、羊抗鼠SP免疫組織化學染色試劑盒（福州邁新生物技術有限公司）；衰老相關-β-半乳糖苷酶（senescence-associatedβ-galactosidase，SA-β-gal）檢測試劑盒、Western blot檢測試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）。切片機（Leica公司，德國）；BH2型光學顯微鏡（Olympus公司，日本）；酶標儀（Molecular Devices公司，美國）；電泳系統、凝膠成像分析儀（Bio-Rad公司，美國）。
1.2 退變髓核標本收集
經患者知情同意，取2012年11月－2013年2月于東南大學附屬中大醫院骨科因腰椎間盤退變接受手術治療的17例患者退變髓核標本。其中男11例，女6例；年齡40～50歲，平均45.4歲。其中L3、4 1 例、L4、5 11例，L5、S1 5例。退變按Pfirrmann分級為Ⅲ級10例，Ⅳ級7例；Ⅲ、Ⅳ級患者年齡分別為（45.6 ± 3.3）歲和（45.1 ± 4.4）歲，差異無統計學意義（t=0.244，P=0.811）。
1.3 檢測指標
1.3.1 SA-β-gal活性檢測
取髓核標本制備15 μm厚切片，加入1 mL SA-β-gal染色固定液室溫固定15 min；棄固定液，PBS洗3遍，加入1 mL染色工作液（配制方法：SA-β-gal染色液A 10 μL，SA-β-gal染色液B 10 μL，SA-β-gal染色液C 930 μL，X-gal溶液50 μL），37℃染色過夜。光鏡下觀察細胞染色情況，綠染細胞為SA-β-gal陽性細胞。隨機取5個高倍視野（×250倍）計數細胞，計算陽性細胞百分比。
1.3.2 免疫組織化學染色觀察
取髓核標本制備4 μm厚切片，二甲苯脫蠟、梯度乙醇復水；阻斷、滅活內源性過氧化物酶，抗原修復，正常羊血清工作液封閉；滴加兔抗人Aggrecan多克隆抗體、兔抗人ADAMTS 5多克隆抗體、兔抗人Sox-9多克隆抗體、鼠抗人p16INK4a多克隆抗體一抗，4℃孵育過夜，PBS洗3遍，滴加羊抗兔或羊抗鼠二抗37℃孵育15 min，PBS洗3遍，滴加鏈霉菌抗生物素-過氧化物酶，37℃孵育15 min，PBS洗3遍；DAB反應染色，蘇木素復染，封片。光鏡下觀察目的抗原表達情況，陽性表達呈棕黃色或棕褐色。隨機取5個高倍視野（×250倍），計算陽性細胞百分比。
1.3.3 Western blot檢測
取髓核組織塊置于勻漿器中，加裂解液（含苯甲基磺酰氟）充分勻漿，提取總蛋白。常規方法行SDS-PAGE，轉膜。取出已封閉的PVDF膜，洗滌后置于含有兔抗人Aggrecan多克隆抗體、兔抗人ADAMTS 5多克隆抗體、兔抗人Sox-9多克隆抗體、鼠抗人p16INK4a多克隆抗體、兔抗人GAPDH多克隆抗體一抗的小袋中，室溫孵育2 h；洗膜，將PVDF膜置于辣根過氧化物酶標記的羊抗兔或羊抗鼠二抗中室溫孵育1 h。取Western blot檢測試劑盒ECL進行化學發光顯色，采用凝膠成像分析儀進行吸光度（A）值掃描并進行半定量檢測。
1.4 統計學方法
采用SPSS16.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗；ADAMTS 5和p16INK4a蛋白表達相關性分析采用Bivariate過程。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 SA-β-gal活性檢測
Ⅲ、Ⅳ級髓核組織內均可見呈綠染的SA-β-gal陽性NPCs，多呈簇狀分布；Ⅲ級髓核組織內也可見到少量單個分布的綠染NPCs，細胞呈圓形，其外周由多層細胞外基質包裹；Ⅳ級髓核組織內難以見到單個分布的綠染NPCs。見圖 1。Ⅲ、Ⅳ級髓核組織陽性細胞百分比分別為22.7% ± 5.4%和37.1% ± 7.6%，差異有統計學意義（t=—9.666，P=0.000）。
圖1
Ⅲ、Ⅳ級髓核組織SA-β-gal染色觀察（×400） ?Ⅲ級髓核組織 ?Ⅳ級髓核組織 ? ?圖 2 Ⅲ、Ⅳ級髓核組織免疫組織化學染色觀察（×250） ?Ⅲ級髓核組織p16INK4a ?Ⅳ級髓核組織p16INK4a ?Ⅲ級髓核組織ADAMTS 5 ?Ⅳ級髓核組織ADAMTS 5 ?Ⅲ級髓核組織Aggrecan ?Ⅳ級髓核組織Aggrecan ?Ⅲ級髓核組織Sox-9 ?Ⅳ級髓核組織Sox-9
Figure1.
SA-β-gal staining of NP with grade III or IV degeneration (×400) ?Grade III ?Grade IV ? ?Fig. 2 Immunohistochemistry staining of NP with grade III or IV degeneration (×250) ?p16INK4a of NP with grade III degeneration ?p16INK4a of NP with grade IV degeneration ?ADAMTS 5 of NP with grade III degeneration ?ADAMTS 5 of NP with grade IV degeneration ?Aggrecan of NP with grade III degeneration ?Aggrecan of NP with grade IV degeneration ?Sox-9 of NP with grade III degeneration ?Sox-9 of NP with grade IV degeneration
2.2 免疫組織化學染色觀察
Ⅲ、Ⅳ級髓核組織內均可見到p16INK4a、ADAMTS 5、Aggrecan、Sox-9陽性的NPCs，顆粒呈棕褐色，分布于細胞質和細胞核內。其中Ⅲ級髓核組織中p16INK4a、ADAMTS 5陽性細胞內顆粒淡染，Aggrecan、Sox-9陽性細胞內顆粒濃聚；而Ⅳ級髓核組織中p16INK4a、ADAMTS 5陽性細胞內顆粒濃聚，Aggrecan、Sox-9陽性細胞內顆粒淡染。見圖 2。
Ⅲ級髓核組織中p16INK4a、ADAMTS 5、Aggrecan、Sox-9染色陽性細胞百分比分別為26.5% ± 9.0%、24.7% ± 8.3%、42.2% ± 7.9%和38.6% ± 10.7%，Ⅳ級髓核組織中分別為39.3% ± 9.6%、40.4% ± 10.0%、22.3% ± 5.9%、25.3% ± 6.4%，兩級間比較差異均有統計學意義（t=—6.272，P=0.000；t=—7.854，P=0.000；t=12.753，P=0.000；t=7.144，P=0.000）。
2.3 Western blot檢測
Ⅲ、Ⅳ級髓核組織中均可見p16INK4a、ADAMTS 5、Aggrecan、Sox-9蛋白表達（圖 3）。Ⅳ級髓核組織中p16INK4a、ADAMTS 5蛋白相對表達量明顯多于Ⅲ級，而Aggrecan、Sox-9蛋白相對表達量明顯少于Ⅲ級，差異均有統計學意義（t=—2.762，P=0.008；t=—2.581，P=0.013；t=5.826，P=0.000；t=3.611，P=0.001）。見圖 4。兩級髓核組織中ADAMTS 5與p16INK4a的蛋白相對表達量間成線性相關（r=0.908，P=0.000），見圖 5。
圖2
Western blot檢測Ⅲ、Ⅳ級髓核組織中各目的蛋白表達Mr：相對分子質量 1：Ⅲ級髓核組織 2：Ⅳ級髓核組織 ? ?圖 4 Western blot檢測Ⅲ、Ⅳ級髓核組織中各目的蛋白相對表達量 ? ?圖 5 退變髓核組織中p16INK4a與ADAMTS 5蛋白相對表達量的相關性
Figure2.
Protein expressions of NP with grade III or IV degeneration by Western blot Mr: Relative molecular mass 1: Grade III 2: Grade IV ? ?Fig. 4 Relative protein levels of Aggrecan,ADAMTS 5,Sox-9,and p16INK4a in NP with grade III or IV degeneration by Western blot ? ?Fig. 5 Correlation of p16INK4a and ADAMTS 5 protein expression in NP
3 討論
下腰痛是脊柱外科常見疾患，發病率高，椎間盤退變是導致下腰痛最常見的原因[13-14]。椎間盤退變起源于髓核，多數研究認為髓核退變主要起因于NPCs和細胞外基質的改變[1, 15]。與多次分裂后端粒縮短引起的復制性衰老不同，應激誘導的過早衰老是由生長因子匱乏、營養障礙、異常細胞接觸等應激因素誘發的分裂停滯[16-17]。椎間盤是人體最大的無血管組織，其含氧量低，任何可以引起髓核中氧自由基增加的因素均可導致NPCs過早衰老，如椎間盤長期承受不當應力、髓核周緣組織血管化等，繼而導致有功能的NPCs數量減少、大量炎性因子和基質降解酶表達，從而惡化鄰近正常細胞賴以生存的微環境，加速椎間盤退變[7, 13]。因此，需要探討退變椎間盤中NPCs過早衰老的機制，為下一步選擇合適的窗口期進行有效生物學干預提供依據。
Pfirrmann分級系統是在Thompson的大體形態學分類基礎之上，利用MRI成像技術對退變椎間盤進行分級的一種方法[18]，目前已被廣泛用于臨床，我們依據該分級系統對收集的髓核組織進行分組。為排除增齡所致的復制性衰老影響，我們僅選取了腰椎間盤退變好發年齡段中40～50歲患者的髓核組織。該年齡段人群中PfirrmannⅠ級幾乎不存在，Ⅱ級多無需手術治療，Ⅴ級中已不存在髓核組織，因此我們僅對該年齡段中PfirrmannⅢ、Ⅳ級的髓核組織進行探討。結果發現，Ⅲ、Ⅳ級髓核組織內均可見到SA-β-gal陽性NPCs，且Ⅳ級髓核組織中陽性細胞數明顯增加。另外，在Ⅲ級髓核組織中陽性NPCs除少量呈單個分布外，多呈簇狀分布，而Ⅳ級髓核組織中陽性NPCs呈簇狀分布，考慮可能原因是：在退變中后期，NPCs通過代償性增殖已不足以彌補其數量減少或功能降低[19]；而隨著一部分衰老NPCs聚集，其釋放的小分子物質導致了低水平炎癥的發生，繼而進一步引發鄰近NPCs的衰老和組織衰退[10]。
研究表明，在人類很多衰老體細胞中均可見到p16INK4a表達累積現象；一些細胞中p16INK4a的激活會促進衰老相關異染色質灶的形成；生存環境壓力脅迫、DNA損傷或染色體端粒受損等不僅是衰老的誘因，同時也是誘導p16INK4a表達的主要因素[6-8, 20]。因此，越來越多學者認可p16INK4a是細胞衰老的關鍵效應基因，它不僅能在一定程度上反映衰老進程，還可能對衰老細胞再生修復產生影響[10, 21]。p16INK4a通過抑制CDK4和CDK6激酶的活性，使磷酸化Rb蛋白維持在低磷酸化，從而使細胞處于生長抑制狀態。我們檢測發現，Ⅲ、Ⅳ級髓核組織內均可見p16INK4a陽性NPCs，且Ⅳ級中p16INK4a表達明顯增強。NPCs為類軟骨細胞，其表達Aggrecan等的表型特征與軟骨細胞之間存在相似之處；相關研究[11- 12，15]也發現轉錄因子Sox-9在椎間盤組織中存在特定的表達及調控，且這種調控從胚胎時期就已開始并不斷發揮作用，向退變的人椎間盤細胞中轉染Sox-9基因，證實其可促進椎間盤細胞增殖、Ⅱ型膠原及Aggrecan的合成。我們檢測發現Ⅳ級髓核組織內特異的轉錄因子Sox-9和Aggrecan的表達較Ⅲ級髓核組織中明顯減少。說明p16INK4a參與的NPCs過早衰老與椎間盤退變的進程之間存在聯系。
ADAMTS 5是降解Aggrecan的主要金屬蛋白酶，我們進一步檢測發現其表達在Ⅳ級髓核組織中明顯增強，且與p16INK4a的表達成線性相關，說明p16INK4a參與的NPCs過早衰老對椎間盤退變的進程起著主導作用。但這與Kim等[6]的研究結果相反，他們認為是端粒介導的p53/p21途徑在NPCs衰老過程中起主導作用，而非p16INK4a/磷酸化Rb途徑，這一差異可能與所收集的髓核組織年齡段不同有關。
盡管由于標本來源的限制，本研究只對Ⅲ、Ⅳ級退變髓核組織進行了觀測，但仍在一定程度上反映了p16INK4a參與的NPCs過早衰老在椎間盤退變進程中發揮的作用，為下一步通過生物學干預適時逆轉NPCs過早衰老或清除衰老的NPCs，從而有效延緩椎間盤退變提供了新思路。另外，p16INK4a參與的NPCs過早衰老的啟動有待進一步探討。
椎間盤退變是一個多因素參與的慢性過程，退變的椎間盤共同表現為髓核細胞（nucleus pulposus cells，NPCs）數量減少和功能降低，Ⅱ型膠原、蛋白聚糖等基質大分子降解[1-5]。遺傳傾向、炎性因子、細胞凋亡、營養障礙等因素均與椎間盤退變相關，而細胞的衰老在此過程中起著重要作用[6-9]。在人類很多衰老體細胞中均可見p16INK4a表達累積現象，它是衰老的重要調控基因[6- 8，10]。Le Maitre等[7]發現隨著患者年齡和椎間盤退變分級的增加，衰老NPCs比例增加，而p16INK4a在這一過程中起重要作用；但Kim等[6]對p16INK4a參與這一過程的調控持否定觀點，認為是端粒依賴的p53/p21途徑起主導作用。鑒于此，本研究擬對同一年齡段、不同程度腰椎間盤退變患者髓核中p16INK4a的表達進行探討。由于椎間盤組織中含血小板凝血酶敏感蛋白的解聚素與金屬蛋白酶5（A disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs 5，ADAMTS 5），是降解細胞外基質成分聚集蛋白聚糖（Aggrecan）的主要金屬蛋白酶，同時Sry相關的HMG盒轉錄因子9（Sry-related HMG box transcription factor 9，Sox-9）作為一種特異的轉錄因子參與了椎間盤從發育到成熟的過程[11-12]，因此本研究選取Aggrecan、ADAMTS 5、Sox-9作為椎間盤退變的評價指標，擬探討p16INK4a的表達與椎間盤退變的關系，為退變椎間盤的生物學修復提供依據。報告如下。
1 材料與方法
1.1 主要試劑與儀器
聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜（Millipore公司，美國）；彩色預染蛋白分子量標準（Fermentas公司，加拿大）；兔抗人Aggrecan多克隆抗體、兔抗人ADAMTS 5多克隆抗體、兔抗人Sox-9多克隆抗體、鼠抗人p16INK4a多克隆抗體、兔抗人GAPDH多克隆抗體（Abcam公司，英國）；辣根過氧化物酶標記的羊抗兔、羊抗鼠IgG抗體（Bioworld公司，美國）；羊抗兔、羊抗鼠SP免疫組織化學染色試劑盒（福州邁新生物技術有限公司）；衰老相關-β-半乳糖苷酶（senescence-associatedβ-galactosidase，SA-β-gal）檢測試劑盒、Western blot檢測試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）。切片機（Leica公司，德國）；BH2型光學顯微鏡（Olympus公司，日本）；酶標儀（Molecular Devices公司，美國）；電泳系統、凝膠成像分析儀（Bio-Rad公司，美國）。
1.2 退變髓核標本收集
經患者知情同意，取2012年11月－2013年2月于東南大學附屬中大醫院骨科因腰椎間盤退變接受手術治療的17例患者退變髓核標本。其中男11例，女6例；年齡40～50歲，平均45.4歲。其中L3、4 1 例、L4、5 11例，L5、S1 5例。退變按Pfirrmann分級為Ⅲ級10例，Ⅳ級7例；Ⅲ、Ⅳ級患者年齡分別為（45.6 ± 3.3）歲和（45.1 ± 4.4）歲，差異無統計學意義（t=0.244，P=0.811）。
1.3 檢測指標
1.3.1 SA-β-gal活性檢測
取髓核標本制備15 μm厚切片，加入1 mL SA-β-gal染色固定液室溫固定15 min；棄固定液，PBS洗3遍，加入1 mL染色工作液（配制方法：SA-β-gal染色液A 10 μL，SA-β-gal染色液B 10 μL，SA-β-gal染色液C 930 μL，X-gal溶液50 μL），37℃染色過夜。光鏡下觀察細胞染色情況，綠染細胞為SA-β-gal陽性細胞。隨機取5個高倍視野（×250倍）計數細胞，計算陽性細胞百分比。
1.3.2 免疫組織化學染色觀察
取髓核標本制備4 μm厚切片，二甲苯脫蠟、梯度乙醇復水；阻斷、滅活內源性過氧化物酶，抗原修復，正常羊血清工作液封閉；滴加兔抗人Aggrecan多克隆抗體、兔抗人ADAMTS 5多克隆抗體、兔抗人Sox-9多克隆抗體、鼠抗人p16INK4a多克隆抗體一抗，4℃孵育過夜，PBS洗3遍，滴加羊抗兔或羊抗鼠二抗37℃孵育15 min，PBS洗3遍，滴加鏈霉菌抗生物素-過氧化物酶，37℃孵育15 min，PBS洗3遍；DAB反應染色，蘇木素復染，封片。光鏡下觀察目的抗原表達情況，陽性表達呈棕黃色或棕褐色。隨機取5個高倍視野（×250倍），計算陽性細胞百分比。
1.3.3 Western blot檢測
取髓核組織塊置于勻漿器中，加裂解液（含苯甲基磺酰氟）充分勻漿，提取總蛋白。常規方法行SDS-PAGE，轉膜。取出已封閉的PVDF膜，洗滌后置于含有兔抗人Aggrecan多克隆抗體、兔抗人ADAMTS 5多克隆抗體、兔抗人Sox-9多克隆抗體、鼠抗人p16INK4a多克隆抗體、兔抗人GAPDH多克隆抗體一抗的小袋中，室溫孵育2 h；洗膜，將PVDF膜置于辣根過氧化物酶標記的羊抗兔或羊抗鼠二抗中室溫孵育1 h。取Western blot檢測試劑盒ECL進行化學發光顯色，采用凝膠成像分析儀進行吸光度（A）值掃描并進行半定量檢測。
1.4 統計學方法
采用SPSS16.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗；ADAMTS 5和p16INK4a蛋白表達相關性分析采用Bivariate過程。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 SA-β-gal活性檢測
Ⅲ、Ⅳ級髓核組織內均可見呈綠染的SA-β-gal陽性NPCs，多呈簇狀分布；Ⅲ級髓核組織內也可見到少量單個分布的綠染NPCs，細胞呈圓形，其外周由多層細胞外基質包裹；Ⅳ級髓核組織內難以見到單個分布的綠染NPCs。見圖 1。Ⅲ、Ⅳ級髓核組織陽性細胞百分比分別為22.7% ± 5.4%和37.1% ± 7.6%，差異有統計學意義（t=—9.666，P=0.000）。
圖1
Ⅲ、Ⅳ級髓核組織SA-β-gal染色觀察（×400） ?Ⅲ級髓核組織 ?Ⅳ級髓核組織 ? ?圖 2 Ⅲ、Ⅳ級髓核組織免疫組織化學染色觀察（×250） ?Ⅲ級髓核組織p16INK4a ?Ⅳ級髓核組織p16INK4a ?Ⅲ級髓核組織ADAMTS 5 ?Ⅳ級髓核組織ADAMTS 5 ?Ⅲ級髓核組織Aggrecan ?Ⅳ級髓核組織Aggrecan ?Ⅲ級髓核組織Sox-9 ?Ⅳ級髓核組織Sox-9
Figure1.
SA-β-gal staining of NP with grade III or IV degeneration (×400) ?Grade III ?Grade IV ? ?Fig. 2 Immunohistochemistry staining of NP with grade III or IV degeneration (×250) ?p16INK4a of NP with grade III degeneration ?p16INK4a of NP with grade IV degeneration ?ADAMTS 5 of NP with grade III degeneration ?ADAMTS 5 of NP with grade IV degeneration ?Aggrecan of NP with grade III degeneration ?Aggrecan of NP with grade IV degeneration ?Sox-9 of NP with grade III degeneration ?Sox-9 of NP with grade IV degeneration
2.2 免疫組織化學染色觀察
Ⅲ、Ⅳ級髓核組織內均可見到p16INK4a、ADAMTS 5、Aggrecan、Sox-9陽性的NPCs，顆粒呈棕褐色，分布于細胞質和細胞核內。其中Ⅲ級髓核組織中p16INK4a、ADAMTS 5陽性細胞內顆粒淡染，Aggrecan、Sox-9陽性細胞內顆粒濃聚；而Ⅳ級髓核組織中p16INK4a、ADAMTS 5陽性細胞內顆粒濃聚，Aggrecan、Sox-9陽性細胞內顆粒淡染。見圖 2。
Ⅲ級髓核組織中p16INK4a、ADAMTS 5、Aggrecan、Sox-9染色陽性細胞百分比分別為26.5% ± 9.0%、24.7% ± 8.3%、42.2% ± 7.9%和38.6% ± 10.7%，Ⅳ級髓核組織中分別為39.3% ± 9.6%、40.4% ± 10.0%、22.3% ± 5.9%、25.3% ± 6.4%，兩級間比較差異均有統計學意義（t=—6.272，P=0.000；t=—7.854，P=0.000；t=12.753，P=0.000；t=7.144，P=0.000）。
2.3 Western blot檢測
Ⅲ、Ⅳ級髓核組織中均可見p16INK4a、ADAMTS 5、Aggrecan、Sox-9蛋白表達（圖 3）。Ⅳ級髓核組織中p16INK4a、ADAMTS 5蛋白相對表達量明顯多于Ⅲ級，而Aggrecan、Sox-9蛋白相對表達量明顯少于Ⅲ級，差異均有統計學意義（t=—2.762，P=0.008；t=—2.581，P=0.013；t=5.826，P=0.000；t=3.611，P=0.001）。見圖 4。兩級髓核組織中ADAMTS 5與p16INK4a的蛋白相對表達量間成線性相關（r=0.908，P=0.000），見圖 5。
圖2
Western blot檢測Ⅲ、Ⅳ級髓核組織中各目的蛋白表達Mr：相對分子質量 1：Ⅲ級髓核組織 2：Ⅳ級髓核組織 ? ?圖 4 Western blot檢測Ⅲ、Ⅳ級髓核組織中各目的蛋白相對表達量 ? ?圖 5 退變髓核組織中p16INK4a與ADAMTS 5蛋白相對表達量的相關性
Figure2.
Protein expressions of NP with grade III or IV degeneration by Western blot Mr: Relative molecular mass 1: Grade III 2: Grade IV ? ?Fig. 4 Relative protein levels of Aggrecan,ADAMTS 5,Sox-9,and p16INK4a in NP with grade III or IV degeneration by Western blot ? ?Fig. 5 Correlation of p16INK4a and ADAMTS 5 protein expression in NP
3 討論
下腰痛是脊柱外科常見疾患，發病率高，椎間盤退變是導致下腰痛最常見的原因[13-14]。椎間盤退變起源于髓核，多數研究認為髓核退變主要起因于NPCs和細胞外基質的改變[1, 15]。與多次分裂后端粒縮短引起的復制性衰老不同，應激誘導的過早衰老是由生長因子匱乏、營養障礙、異常細胞接觸等應激因素誘發的分裂停滯[16-17]。椎間盤是人體最大的無血管組織，其含氧量低，任何可以引起髓核中氧自由基增加的因素均可導致NPCs過早衰老，如椎間盤長期承受不當應力、髓核周緣組織血管化等，繼而導致有功能的NPCs數量減少、大量炎性因子和基質降解酶表達，從而惡化鄰近正常細胞賴以生存的微環境，加速椎間盤退變[7, 13]。因此，需要探討退變椎間盤中NPCs過早衰老的機制，為下一步選擇合適的窗口期進行有效生物學干預提供依據。
Pfirrmann分級系統是在Thompson的大體形態學分類基礎之上，利用MRI成像技術對退變椎間盤進行分級的一種方法[18]，目前已被廣泛用于臨床，我們依據該分級系統對收集的髓核組織進行分組。為排除增齡所致的復制性衰老影響，我們僅選取了腰椎間盤退變好發年齡段中40～50歲患者的髓核組織。該年齡段人群中PfirrmannⅠ級幾乎不存在，Ⅱ級多無需手術治療，Ⅴ級中已不存在髓核組織，因此我們僅對該年齡段中PfirrmannⅢ、Ⅳ級的髓核組織進行探討。結果發現，Ⅲ、Ⅳ級髓核組織內均可見到SA-β-gal陽性NPCs，且Ⅳ級髓核組織中陽性細胞數明顯增加。另外，在Ⅲ級髓核組織中陽性NPCs除少量呈單個分布外，多呈簇狀分布，而Ⅳ級髓核組織中陽性NPCs呈簇狀分布，考慮可能原因是：在退變中后期，NPCs通過代償性增殖已不足以彌補其數量減少或功能降低[19]；而隨著一部分衰老NPCs聚集，其釋放的小分子物質導致了低水平炎癥的發生，繼而進一步引發鄰近NPCs的衰老和組織衰退[10]。
研究表明，在人類很多衰老體細胞中均可見到p16INK4a表達累積現象；一些細胞中p16INK4a的激活會促進衰老相關異染色質灶的形成；生存環境壓力脅迫、DNA損傷或染色體端粒受損等不僅是衰老的誘因，同時也是誘導p16INK4a表達的主要因素[6-8, 20]。因此，越來越多學者認可p16INK4a是細胞衰老的關鍵效應基因，它不僅能在一定程度上反映衰老進程，還可能對衰老細胞再生修復產生影響[10, 21]。p16INK4a通過抑制CDK4和CDK6激酶的活性，使磷酸化Rb蛋白維持在低磷酸化，從而使細胞處于生長抑制狀態。我們檢測發現，Ⅲ、Ⅳ級髓核組織內均可見p16INK4a陽性NPCs，且Ⅳ級中p16INK4a表達明顯增強。NPCs為類軟骨細胞，其表達Aggrecan等的表型特征與軟骨細胞之間存在相似之處；相關研究[11- 12，15]也發現轉錄因子Sox-9在椎間盤組織中存在特定的表達及調控，且這種調控從胚胎時期就已開始并不斷發揮作用，向退變的人椎間盤細胞中轉染Sox-9基因，證實其可促進椎間盤細胞增殖、Ⅱ型膠原及Aggrecan的合成。我們檢測發現Ⅳ級髓核組織內特異的轉錄因子Sox-9和Aggrecan的表達較Ⅲ級髓核組織中明顯減少。說明p16INK4a參與的NPCs過早衰老與椎間盤退變的進程之間存在聯系。
ADAMTS 5是降解Aggrecan的主要金屬蛋白酶，我們進一步檢測發現其表達在Ⅳ級髓核組織中明顯增強，且與p16INK4a的表達成線性相關，說明p16INK4a參與的NPCs過早衰老對椎間盤退變的進程起著主導作用。但這與Kim等[6]的研究結果相反，他們認為是端粒介導的p53/p21途徑在NPCs衰老過程中起主導作用，而非p16INK4a/磷酸化Rb途徑，這一差異可能與所收集的髓核組織年齡段不同有關。
盡管由于標本來源的限制，本研究只對Ⅲ、Ⅳ級退變髓核組織進行了觀測，但仍在一定程度上反映了p16INK4a參與的NPCs過早衰老在椎間盤退變進程中發揮的作用，為下一步通過生物學干預適時逆轉NPCs過早衰老或清除衰老的NPCs，從而有效延緩椎間盤退變提供了新思路。另外，p16INK4a參與的NPCs過早衰老的啟動有待進一步探討。
