引用本文： 顏艷, 林欣, 代曉華, 王冠華, 張林樸, 鄒慧儒. 破骨細胞形成和功能調節的研究進展. 中國修復重建外科雜志, 2014, 28(11): 1435-1440. doi: 10.7507/1002-1892.20140309 復制
破骨細胞（osteoclast，OC）是由骨髓中的造血干細胞前體融合形成的多核細胞。破骨細胞前體細胞（OC precursor，OCP）在趨化因子作用下進入血循環，當到達處于吸收狀態的骨組織部位，即骨重建單位（bone remodeling unit，BRU）時，便在一系列趨化因子和細胞因子作用下進入骨組織并分化成OC。巨噬細胞集落刺激因子（macrophage colony stimulating factor，M-CSF）和NF-κB受體活化因子配基（receptor activator of NF-κB ligand，RANKL）是由BRU及其周圍細胞表達的兩種重要因子，它們通過調節OCP的形成和分化來促進正常或病理性骨重建過程中整體或局部的骨吸收[1]。OC一直被認為是骨吸收細胞，除了參與骨吸收過程，幾乎無其他功能，但近年對小鼠的遺傳學研究發現，OC及OCP還具有其他作用，包括調節成骨細胞（osteoblast，OB）的形成和參與免疫應答；在一些病理條件（如腫瘤）下，OC還存在于除骨組織外的其他組織中[2]。幾個主要細胞功能調節途徑，如NF-κB、Wnt/β-catenin和Notch，均對OC和OB的形成及功能起著重要作用。現對OC形成和功能調節的分子機制研究進展作一綜述。
1 OCP向骨表面的募集
在正常生理條件下，OCP在趨化因子如基質衍生因子1（stroma-derived factor 1，SDF-1）作用下被維持在骨髓中。當處于炎性條件時，高水平的TNF通過抑制骨髓細胞中SDF-1的表達將OCP動員至血液中[1]；此外，血液中紅細胞和血小板分泌的一種具有生物活性的鞘脂類化合物——鞘氨醇-1磷酸（sphingosine-1 phosphate，S1P），也能吸引OCP進入血液。OCP表達的兩種S1P受體S1PR-1和S1PR-2分別具有趨化吸引和趨化排斥功能，后者能將其送回BRU部位的骨髓中[3]。OC本身也能表達S1P，從而吸引OCP與之融合。Lotinun等[4]發現OC中S1P的表達受到組織蛋白酶K——一種主要的膠原基質降解酶的抑制，而S1P能促進OB前體細胞分化，提示組織蛋白酶K抑制劑可能會刺激骨生成。
在類風濕性關節炎（rheumatoid arthritis，RA）患者的滑液中，S1P表達水平明顯升高，提示其可能引起OCP向關節侵襲。炎癥性關節炎小鼠經過FTY720（一種S1PR-1激活劑）治療后，其關節的破壞和炎癥程度均明顯減輕，這可能與該激活劑能將OCP及其他免疫細胞維持在血液中有關[3]。Aarthi等[5]研究還表明S1P能增加牙周炎中炎性因子的表達，但有關其在牙周病患者齦溝液中的表達水平目前尚罕見報道。血液中的OCP還可能在牙髓和牙周膜表達的RANKL和M-CSF作用下，被募集至處于吸收活躍狀態的乳牙表面，但對恒牙則無相應現象[6]。
2 OC形成的調節
骨髓前體細胞在多種轉錄因子（如PU.1和MITF/Tfe3復合物）的誘導下分化成OCP。Mellis等[7]研究表明PU.1和MITF能激活M-CSF受體的表達，缺失其中任一蛋白編碼基因的小鼠，均會因骨髓腔中骨小梁吸收過程受阻而發生軟骨內成骨，從而導致骨硬化癥。M-CSF在OC形成早期的作用主要是促進骨髓前體細胞中NF-κB受體活化因子（receptor activator of NF-κB，RANK）的表達，并與TNF協同作用，使細胞對RANKL作出響應[1]。M-CSF與其受體結合后，吸引由DAP12和非受體型酪氨酸激酶Syk組成的信號復合物，從而激活ERK/Grb-2和Akt/PI3K信號通路，調節OC及其前體細胞的各種生物學行為，包括增殖、凋亡和存活。
RANKL為TNF配體家族成員，是一種Ⅱ型跨膜蛋白，在多種細胞中均有表達，包括OB、軟骨細胞、T細胞和B細胞。在軟骨內成骨過程中，參與骨小梁吸收的RANKL主要來源于肥大軟骨細胞，而在成年小鼠的骨改建和對應力刺激的響應過程中，RANKL的主要來源則是骨小梁中的骨細胞[8]。RANK為TNF受體家族成員，屬于Ⅰ型跨膜蛋白。與其他TNF受體家族成員一樣，RANK本身無激酶活性，只能通過結合銜接蛋白TNF受體激活劑（TNF receptor-activating factor，TRAF），磷酸化和激活下游信號分子。在OCP中，TRAF-1、2、3、5、6都能與RANK結合，但可能只有RANK/TRAF-6對OC的形成和功能具有重要作用[1]。在TRAF家族基因敲除小鼠模型研究中，只有TRAF-6基因敲除小鼠成功存活并形成骨，但卻出現OC缺乏和OC功能障礙兩種表型[9]。該研究結果或許可以解釋為何RANK/TRAF-6信號能激活NF-κB、c-Jun氨基末端激酶/激活蛋白1（包括c-Fos）、c-myc以及鈣神經素/活化T細胞核因子c1（nuclear factor of activated T cell c1，NFATc1）信號通路，從而誘導OC的形成；同時激活Src和MKK-6/p38/MITF信號通路以介導OC的骨吸收功能，或激活Src和ERK信號通路以介導OC的存活[1, 8]。
骨誘裂發生過程依賴NF-κB信號的參與，NF-κB p50/p52雙基因敲除小鼠由于OC形成受阻會導致骨硬化癥[9]。這種雙基因敲除小鼠以及RANKL和RANK敲除小鼠均會出現B細胞和淋巴結發育受阻及T細胞成熟過程缺陷，提示采用藥物如地諾單抗（一種RANKL單克隆抗體）等抑制RANK信號通路可能對免疫應答產生副作用。值得注意的是，盡管地諾單抗和雙磷酸鹽類藥物的作用機制不同，但和雙磷酸鹽類藥物相似，少數服用地諾單抗治療轉移性骨疾病的患者可出現下頜骨壞死，說明這兩種藥物可能干擾相似細胞的功能，包括OC或其他免疫細胞系[10]。
NF-κB轉錄因子家族主要有5種蛋白，包括RelA、RelB、p50、p52和c-Rel，其中任意兩種蛋白二聚化后均會形成有活性的NF-κB。NF-κB通常指的是典型NF-κB途徑中的RelA/p50異二聚體，而RelB/p52異二聚體則出現在非典型NF-κB途徑中，RANKL對這兩種途徑均有激活作用，而TNF則主要激活典型的NF-κB途徑[11]。OCP對RANKL的早期響應之一就是招募RelA/p50復合物和NFATc2至NFATc1編碼基因的啟動子區域，該過程被稱為骨誘裂發生的宿主調控，其結果是引起NFATc1短期內快速自我表達，并伴隨RANK信號組成性活性抑制物表達的下調，從而使骨誘裂發生過程得以進行[12]。NFATc1最終被c-Fos經由TRAF-6/NF-κB途徑和CCAAT/增強子結合蛋白α途徑激活，繼而完成OCP的分化和隨后的OC活化過程[13]。
RANKL調節的非典型NF-κB途徑使TRAF-3降解，使NF-κB p100經蛋白酶體加工形成p52，并使RelB/p52復合物轉移至細胞核[14]。NIK、RelB和p100基因敲除小鼠的OC數量正常且未發生骨硬化癥，說明RANKL調節的非典型NF-κB途徑并不是OC正常形成過程所必需的。但在病理狀態下，該途徑可能參與局部溶骨作用[9]，且TNF轉基因小鼠敲除p100基因后，其關節炎癥和受侵蝕程度與未敲除p100基因的對照組相比更嚴重，提示p100能限制TNF誘導的OC形成及炎性反應[14]。Jimi等[15]的小鼠模型研究顯示，NF-κB的多肽抑制劑NEMO能有效緩解炎癥性關節炎，但對人類目前尚缺乏研究。許多因子如1，25（OH）2維生素D3、TGF-β、IL-6等已被證明能刺激OC的形成，特別是在病理條件下，但并不依賴于RANKL途徑[16]。
3 OC功能的調節
骨吸收過程開始于OC通過整合素玻連蛋白受體αVβ3與骨表面接觸，引起細胞外的Src酪氨酸激酶向細胞內募集，從而導致多條依賴Src的信號通路被激活。例如，Src磷酸化Syk和Slp-76，使二者形成一種銜接蛋白復合物，從而激活小型Rho蛋白家族成員Rac參與的信號通路。αVβ3與M-CFSR結合后，能通過由內而外的信號傳遞使整合素活化。與αVβ3/Src相互作用相似，RANK在Src作用下也能與αVβ3形成復合物，從而激活Syk、Slp-76、Vav3和Rac信號。這些交互作用導致溶酶體分泌小泡與胞質膜融合形成褶皺緣[17]。細胞內的H+穿過褶皺緣被泵出細胞外，與Cl-形成HCl使骨組織脫礦；同時，組織蛋白酶K分泌水平增加，使骨基質被降解。目前，組織蛋白酶K抑制劑作為新型的抗吸收藥物已進入臨床試驗階段[18-20]。最新研究顯示，OC表達的組織蛋白酶K能下調OB中RANKL的表達[4]。Src的表達是OC吸收作用所必需的，其在腫瘤中的過表達加強了腫瘤細胞的增殖、侵襲和轉移。因此，在轉移性骨疾病中，Src靶向藥物能同時抑制OC和腫瘤細胞的作用。質子泵抑制劑也已開發作為藥物，但尚未進入臨床試驗。
在骨形成過程中，大量蛋白隨著膠原一起被裝配，包括TGF-β、BMP、FGF和IGF；在骨吸收過程中，這些蛋白會被OC釋放出來并被活化，參與正常或病理狀態下的骨吸收過程。例如直接或通過調節RANKL或骨保護素（osteoprotegerin，OPG）的表達間接誘導OC的形成[16]。TGF-β還能吸引OB至骨吸收部位，使其充當偶聯因子的角色[21]。
在溶骨條件下，如佩吉特病（變形性骨炎）、巨細胞腫瘤和修復性骨肉芽腫中，OC起著巨型多核細胞的作用，其形成無需貼附于骨基質表面。例如，在修復性肉芽腫或巨細胞腫瘤中大部分OC均遠離骨組織，只有小部分OC處于骨表面，在原發性乳腺癌、胰腺癌和其他癌癥中偶見OC，但OC在這些腫瘤中的作用和形成機制尚不明確。許多蛋白，如樹突狀細胞特異性跨膜蛋白（dendritic-cell-specific transmembrane protein，DC-STAMP）、OC-STAMP及CD9等，均與細胞融合過程有關，它們的表達受到PU.1、MITF、c-Fos和NFATc1的調控[7]。Fujita等[22]發現維生素E能激活撕裂原活化蛋白激酶14和MITF的活性，從而誘導DC-STAMP的表達和OCP的融合。該研究還發現，維生素E能促進大鼠OC的形成并使大鼠骨容量下降，提示過量服用維生素E有可能導致骨質疏松癥。
4 骨免疫學與協同刺激信號
NF-κB和NFATc1信號調節OC形成，連同它們在淋巴結形成、免疫應答及炎癥性關節炎中不可或缺的作用，成為了骨免疫學的新領域，該領域主要研究骨骼系統與免疫系統細胞之間的相互作用[23]。協同刺激信號是免疫應答中的組成成分，基于T細胞活化雙信號模型提出的。在骨免疫學中，協同刺激信號通過使配體結合于免疫球蛋白樣受體，如TREM-2（一種由骨髓樣細胞表達的觸發受體）和OC聯合受體使NFATc1被激活，從而促進OC的形成和活化。盡管OCP上大部分受體的配體還未確定，但OC聯合受體可被膠原的一些特殊部位激活，這些部位在骨吸收過程中會暴露出來[24]。這些受體招募與之適配的分子（如FcRγ和DAP12），引起適配分子中免疫受體酪氨酸激活基序（immunoreceptor tyrosine-based activation motif，ITAM）的磷酸化和下游信號分子的活化。RANK和協同刺激信號均能激活磷脂酶Cγ和鈣-鈣調蛋白信號，引起細胞質中儲備鈣的釋放，并通過鈣依賴性磷酸酶——鈣神經素使NFATc1去磷酸化并轉移至細胞核。因此，協同刺激信號和RANK信號可能都是通過激活NFATc1促進OC的形成和活化，NFATc1可能是炎癥性骨疾病中一個重要的治療靶標。
NFATc1的激活過程可被環孢素A阻斷，它是一種鈣神經素/NFATc1復合物抑制劑，在臨床上作為免疫抑制藥物。Koga等[25]研究表明環孢素A能阻止RA小鼠的骨流失。NFATc1還能促進轉錄因子Osterix的表達，該轉錄因子是OB分化中處于Runx2下游的重要調節因子。正常小鼠攝入環孢素A后，因NFATc1誘導的OB形成過程受到抑制而引起骨質疏松癥，提示在正常骨重建過程中，NFATc1對OB分化的作用比對OC分化的作用更重要[25]。在炎癥性骨疾病中，骨形成過程的抑制通常有多種機制，包括TNF介導的OB功能抑制[1]，而在這些疾病中，NFATc1抑制物的主要作用應是減少骨的吸收。
T細胞和B細胞出現在RA患者關節和牙周炎患者牙齦組織中，并表達RANKL促進骨誘裂發生，但其作用機制較復雜。例如，CD3陽性T輔助（Th）細胞表達RANKL，Th17細胞通過IL-17誘導RANKL的表達，而T調節細胞則通過IL-4和IL-10的表達抑制OC的形成；Th1細胞表達INF-γ，該分子在OCP分化的不同階段對OC的形成具有抑制和促進雙重作用[12]。Berthelot等[26]發現RA患者的齦溝液中出現T調節細胞，但IL-4和IL-10的水平卻很低，且重度牙周炎患者齦溝液中的水平更低。在炎癥性骨疾病中，T細胞的作用可能是中立的[23]。在牙周炎患者的牙周軟組織中，B細胞比T細胞更多，但其表達RANKL的研究同樣存在爭議[27]。T細胞和B細胞在炎癥性骨流失中的具體作用有待更深入的研究。
5 OC形成和功能的負調控
OC的形成和功能受到多種機制的負調控，如甲狀腺C細胞分泌的降鈣素等，但這些機制在RANKL被發現之前幾乎均未被確定。RANKL的發現使研究者能夠獲得足夠數量的高純度OCP進行基因表達譜研究。OPG是整個骨吸收過程中最主要的負調節物，它通過與RANKL結合來競爭性抑制RANK與RANKL的相互作用。大多數青少年佩吉特病都是因OCP的編碼基因發生功能缺失突變引起的，患者體內過量的RANKL表達引起骨質疏松，這與OPG基因敲除小鼠的表型相似。
5.1 OB介導的負調控
OB能通過多種信號通路參與OC形成的負調控，并能調節OPG的表達。例如，典型的Wnt/β-catenin信號通路不僅是OB形成過程所必需，還能促進OB中OPG的表達[28]。相反，Wnt-5a介導的非典型信號通路則通過OCP中的孤兒受體蛋白（類似于酪氨酸激酶受體）促進OC的形成[29]。此外，Jagged-1/Notch-1信號通路也能促進OB的分化，并提高間質細胞中OPG/RANKL的表達比值，從而抑制OC的形成[1]。
信號素家族（Semas）也能調節OC和OB之間的相互作用，它們以分泌蛋白和膜蛋白的形式被這兩種細胞廣泛表達。Sema3A由OB和OC分泌，能通過抑制ITAM和RhoA信號來抑制RANKL誘導的OC形成；Sema4D由OC表達，能通過激活IGF-1信號抑制因子RhoA-ROCK來抑制OB的分化及其功能。相反，Sema6D則能通過TREM-2/DAP12/PLCγ途徑誘導NFATc1的活化，從而促進OC的形成，并能通過OC中Rac-GTP的生成來誘導偽足小體的形成，從而促進OC的活化[30]。Semas通過神經叢素和跨膜蛋白傳遞信號，缺少這些蛋白的基因敲除小鼠存在骨硬化癥或骨質疏松癥，說明它們在骨細胞功能中起著非常重要的作用。
RANKL還能通過某些調控機制限制OC的形成。例如，c-Fos能調節NFATc1誘導的OC形成過程，還能促進干擾素-β的分泌，干擾素-β反過來能結合于OCP上的c-Fos受體，從而導致c-Fos蛋白水平的下降。c-Fos/NFATc1信號還能促進OCP表面膜附著型配體B2的表達。膜附著型配體在胚胎發育過程中能直接與鄰近細胞的Eph受體結合并雙向傳遞信號，從而調節軸突細胞、內皮細胞及免疫細胞的功能。膜附著型配體B2結合于OB上的Eph4受體后，經反向信號傳遞下調c-Fos和NFATc1的表達，從而限制OC的形成，而正向信號則通過抑制小型GTP酶RhoA來促進OB前體細胞的分化[31]。
以上這些不同的交互作用在BRU具體是如何發生、在何處發生、哪些是發生在OC和OB之間或它們的前體細胞之間，目前均未明確。可能機制為在BRU骨吸收部位，OB前體細胞正向調節OC的形成和融合；在相反一側即新骨形成部位，OCP促進OB前體細胞的分化，OB則促進OC的凋亡。此外，成熟的OB中OPG的分泌和其他OC形成負調節蛋白的表達也使OC遠離新骨形成部位。
5.2 RANK信號的組成性轉錄抑制
一些組成性調節機制也能抑制OC的形成。例如，在RANKL缺乏時，Bcl-6會被募集至NFATc1、組織蛋白酶K和DC-STAMP的啟動子部位，從而抑制骨誘裂發生。RANKL能促使Bcl-6從這些蛋白基因的啟動子上移除并被NFATc1替代，從而介導骨誘裂發生[32]。其他一些組成性轉錄抑制物，如干擾素調節因子8、Eos和v-maf肌腱膜纖維肉瘤基因家族蛋白B等，它們的表達受到RANK信號的下調[12]。同時，這些組成性轉錄抑制物也是B淋巴細胞誘導的成熟蛋白1的直接靶點，該蛋白在OC中的缺失會導致因Bcl-6表達上調和骨誘裂發生過程受損而引起的骨硬化癥。相反，Bcl-6基因敲除小鼠OC形成增加，并引發嚴重的骨質疏松癥[32]。因此在OCP中，RANKL/RANK信號通路對NFATc1的活化不僅能直接促進骨誘裂發生，還能通過抑制這些負調節蛋白的表達來間接促進骨誘裂發生。
5.3 促炎性細胞因子
在許多疾病如RA和牙周炎中，細胞因子是發生骨吸收和炎性反應的重要誘導物，但同時也會通過一些途徑來限制這些破壞過程。例如，大多數誘導RANKL表達的因子同時也能誘導OPG的表達，盡管在一定程度上，其絕對效應還是促進骨吸收[33]。與之類似，雖然TNF能誘導骨吸收且不依賴于RANKL途徑，但它同時也能通過某些途徑限制OC的形成，包括阻止非典型NF-κB信號抑制蛋白的降解[14]和誘導OCP中干擾素調節因子8和RBP-Jκ（一種Notch誘導的DNA結合蛋白）的表達[12]。TNF還能促進OC及OCP中TNF刺激基因6的分泌，該基因與OPG協同作用，通過自分泌機制限制OC的活化[34]。具有消炎功能的抗炎性細胞因子IL-10，能通過抑制OCP中c-Fos、c-Jun、TREM-2和NFATc1的表達來限制OC的形成。IL-4則通過在OC形成過程中促進OPG的表達和抑制RANKL、RANK、NF-κB、c-Fos、NFATc1和MAPK的表達及鈣信號來限制骨吸收過程[12]。
6 OC的凋亡與存活
在BRU中新骨形成部位，OC發生凋亡，新骨由OB生成。Nakamura等[35]研究表明，雌激素一方面通過促進TGF-β介導的OC凋亡和OC中Fas配體的表達來維持骨量，另一方面還抑制OC活化調節基因的表達，但并不影響OCP的增殖和融合。Rogers等[36]研究表明，部分雙磷酸鹽類藥物能通過抑制甲羥戊酸途徑中酶的活性和促進半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶（Caspase）的裂解來誘導OC的凋亡，但有些氨基雙磷酸鹽類盡管也能抑制骨吸收，但不誘導OC的凋亡。此外，地諾單抗和雷洛昔芬也能誘導OC的凋亡，但降鈣素和組織蛋白酶K抑制劑卻不能[37-38]。
OC的存活受到多種細胞因子影響，包括M-CSF、RANKL、TNF、IL-1和VEGF-A等。這些因子通過上調Ras/Rac-1/Erk和PI3K/mTOR/S6K信號來促進OC的存活，阻斷這些細胞因子的表達會導致抗凋亡蛋白Bcl-2表達的下降，并加速OC的凋亡[39]。RANKL信號的早期效應之一就是NF-κB p65阻斷Bid和Caspase-3誘導的OCP凋亡。M-CSF則能通過多種途徑阻斷OC的凋亡，包括激活MITF使Bcl-2的表達增加；通過泛素連接酶c-Cbl促進Bim的降解；上調Bcl-XL的表達使Caspase-9前體蛋白的裂解受到抑制；以及抑制Caspase-3、9，使凋亡無法啟動。Bim是一個促凋亡的Bcl-2家族成員，其表達能被IL-3經Raf/Erk和PI3K/mTOR途徑下調。Bim基因敲除小鼠OC的存活增加，但活性卻降低[39]。但OC存活的加強總體有利于增加骨吸收。
7 小結與展望
近年來OC形成和功能活化調節機制的研究已取得了顯著進展。骨髓來源的OCP在一系列趨化因子和細胞因子的作用下經血循環進入骨組織并分化成OC，發揮骨吸收功能。M-CSF和RANKL是OC形成和活化過程中最重要的調節因子，其調節作用可通過多種信號通路實現。活化的OC除了介導骨吸收，還具有參與免疫應答、調節OB形成等功能，因此骨免疫學的概念被提出，調節T細胞活化的協同刺激信號被證明也能促進OC的形成和活化。NFATc1是骨免疫學研究的重點，并有可能成為炎癥性骨疾病的治療靶點。OC的形成和功能還受到多種機制的負調控，包括OB介導的負調控、RANKL信號的組成性轉錄抑制和一些促炎性細胞因子。OPG是骨吸收過程中最重要的負調節物，多種負調節機制均與該蛋白的表達相關。此外，對OC凋亡和存活的調節也會影響骨吸收的進程。所有這些研究都有助于了解各種骨性疾病對骨組織的破壞機制，尋找更合理的生物學治療靶標，從而開發更有效的治療藥物。
破骨細胞（osteoclast，OC）是由骨髓中的造血干細胞前體融合形成的多核細胞。破骨細胞前體細胞（OC precursor，OCP）在趨化因子作用下進入血循環，當到達處于吸收狀態的骨組織部位，即骨重建單位（bone remodeling unit，BRU）時，便在一系列趨化因子和細胞因子作用下進入骨組織并分化成OC。巨噬細胞集落刺激因子（macrophage colony stimulating factor，M-CSF）和NF-κB受體活化因子配基（receptor activator of NF-κB ligand，RANKL）是由BRU及其周圍細胞表達的兩種重要因子，它們通過調節OCP的形成和分化來促進正常或病理性骨重建過程中整體或局部的骨吸收[1]。OC一直被認為是骨吸收細胞，除了參與骨吸收過程，幾乎無其他功能，但近年對小鼠的遺傳學研究發現，OC及OCP還具有其他作用，包括調節成骨細胞（osteoblast，OB）的形成和參與免疫應答；在一些病理條件（如腫瘤）下，OC還存在于除骨組織外的其他組織中[2]。幾個主要細胞功能調節途徑，如NF-κB、Wnt/β-catenin和Notch，均對OC和OB的形成及功能起著重要作用。現對OC形成和功能調節的分子機制研究進展作一綜述。
1 OCP向骨表面的募集
在正常生理條件下，OCP在趨化因子如基質衍生因子1（stroma-derived factor 1，SDF-1）作用下被維持在骨髓中。當處于炎性條件時，高水平的TNF通過抑制骨髓細胞中SDF-1的表達將OCP動員至血液中[1]；此外，血液中紅細胞和血小板分泌的一種具有生物活性的鞘脂類化合物——鞘氨醇-1磷酸（sphingosine-1 phosphate，S1P），也能吸引OCP進入血液。OCP表達的兩種S1P受體S1PR-1和S1PR-2分別具有趨化吸引和趨化排斥功能，后者能將其送回BRU部位的骨髓中[3]。OC本身也能表達S1P，從而吸引OCP與之融合。Lotinun等[4]發現OC中S1P的表達受到組織蛋白酶K——一種主要的膠原基質降解酶的抑制，而S1P能促進OB前體細胞分化，提示組織蛋白酶K抑制劑可能會刺激骨生成。
在類風濕性關節炎（rheumatoid arthritis，RA）患者的滑液中，S1P表達水平明顯升高，提示其可能引起OCP向關節侵襲。炎癥性關節炎小鼠經過FTY720（一種S1PR-1激活劑）治療后，其關節的破壞和炎癥程度均明顯減輕，這可能與該激活劑能將OCP及其他免疫細胞維持在血液中有關[3]。Aarthi等[5]研究還表明S1P能增加牙周炎中炎性因子的表達，但有關其在牙周病患者齦溝液中的表達水平目前尚罕見報道。血液中的OCP還可能在牙髓和牙周膜表達的RANKL和M-CSF作用下，被募集至處于吸收活躍狀態的乳牙表面，但對恒牙則無相應現象[6]。
2 OC形成的調節
骨髓前體細胞在多種轉錄因子（如PU.1和MITF/Tfe3復合物）的誘導下分化成OCP。Mellis等[7]研究表明PU.1和MITF能激活M-CSF受體的表達，缺失其中任一蛋白編碼基因的小鼠，均會因骨髓腔中骨小梁吸收過程受阻而發生軟骨內成骨，從而導致骨硬化癥。M-CSF在OC形成早期的作用主要是促進骨髓前體細胞中NF-κB受體活化因子（receptor activator of NF-κB，RANK）的表達，并與TNF協同作用，使細胞對RANKL作出響應[1]。M-CSF與其受體結合后，吸引由DAP12和非受體型酪氨酸激酶Syk組成的信號復合物，從而激活ERK/Grb-2和Akt/PI3K信號通路，調節OC及其前體細胞的各種生物學行為，包括增殖、凋亡和存活。
RANKL為TNF配體家族成員，是一種Ⅱ型跨膜蛋白，在多種細胞中均有表達，包括OB、軟骨細胞、T細胞和B細胞。在軟骨內成骨過程中，參與骨小梁吸收的RANKL主要來源于肥大軟骨細胞，而在成年小鼠的骨改建和對應力刺激的響應過程中，RANKL的主要來源則是骨小梁中的骨細胞[8]。RANK為TNF受體家族成員，屬于Ⅰ型跨膜蛋白。與其他TNF受體家族成員一樣，RANK本身無激酶活性，只能通過結合銜接蛋白TNF受體激活劑（TNF receptor-activating factor，TRAF），磷酸化和激活下游信號分子。在OCP中，TRAF-1、2、3、5、6都能與RANK結合，但可能只有RANK/TRAF-6對OC的形成和功能具有重要作用[1]。在TRAF家族基因敲除小鼠模型研究中，只有TRAF-6基因敲除小鼠成功存活并形成骨，但卻出現OC缺乏和OC功能障礙兩種表型[9]。該研究結果或許可以解釋為何RANK/TRAF-6信號能激活NF-κB、c-Jun氨基末端激酶/激活蛋白1（包括c-Fos）、c-myc以及鈣神經素/活化T細胞核因子c1（nuclear factor of activated T cell c1，NFATc1）信號通路，從而誘導OC的形成；同時激活Src和MKK-6/p38/MITF信號通路以介導OC的骨吸收功能，或激活Src和ERK信號通路以介導OC的存活[1, 8]。
骨誘裂發生過程依賴NF-κB信號的參與，NF-κB p50/p52雙基因敲除小鼠由于OC形成受阻會導致骨硬化癥[9]。這種雙基因敲除小鼠以及RANKL和RANK敲除小鼠均會出現B細胞和淋巴結發育受阻及T細胞成熟過程缺陷，提示采用藥物如地諾單抗（一種RANKL單克隆抗體）等抑制RANK信號通路可能對免疫應答產生副作用。值得注意的是，盡管地諾單抗和雙磷酸鹽類藥物的作用機制不同，但和雙磷酸鹽類藥物相似，少數服用地諾單抗治療轉移性骨疾病的患者可出現下頜骨壞死，說明這兩種藥物可能干擾相似細胞的功能，包括OC或其他免疫細胞系[10]。
NF-κB轉錄因子家族主要有5種蛋白，包括RelA、RelB、p50、p52和c-Rel，其中任意兩種蛋白二聚化后均會形成有活性的NF-κB。NF-κB通常指的是典型NF-κB途徑中的RelA/p50異二聚體，而RelB/p52異二聚體則出現在非典型NF-κB途徑中，RANKL對這兩種途徑均有激活作用，而TNF則主要激活典型的NF-κB途徑[11]。OCP對RANKL的早期響應之一就是招募RelA/p50復合物和NFATc2至NFATc1編碼基因的啟動子區域，該過程被稱為骨誘裂發生的宿主調控，其結果是引起NFATc1短期內快速自我表達，并伴隨RANK信號組成性活性抑制物表達的下調，從而使骨誘裂發生過程得以進行[12]。NFATc1最終被c-Fos經由TRAF-6/NF-κB途徑和CCAAT/增強子結合蛋白α途徑激活，繼而完成OCP的分化和隨后的OC活化過程[13]。
RANKL調節的非典型NF-κB途徑使TRAF-3降解，使NF-κB p100經蛋白酶體加工形成p52，并使RelB/p52復合物轉移至細胞核[14]。NIK、RelB和p100基因敲除小鼠的OC數量正常且未發生骨硬化癥，說明RANKL調節的非典型NF-κB途徑并不是OC正常形成過程所必需的。但在病理狀態下，該途徑可能參與局部溶骨作用[9]，且TNF轉基因小鼠敲除p100基因后，其關節炎癥和受侵蝕程度與未敲除p100基因的對照組相比更嚴重，提示p100能限制TNF誘導的OC形成及炎性反應[14]。Jimi等[15]的小鼠模型研究顯示，NF-κB的多肽抑制劑NEMO能有效緩解炎癥性關節炎，但對人類目前尚缺乏研究。許多因子如1，25（OH）2維生素D3、TGF-β、IL-6等已被證明能刺激OC的形成，特別是在病理條件下，但并不依賴于RANKL途徑[16]。
3 OC功能的調節
骨吸收過程開始于OC通過整合素玻連蛋白受體αVβ3與骨表面接觸，引起細胞外的Src酪氨酸激酶向細胞內募集，從而導致多條依賴Src的信號通路被激活。例如，Src磷酸化Syk和Slp-76，使二者形成一種銜接蛋白復合物，從而激活小型Rho蛋白家族成員Rac參與的信號通路。αVβ3與M-CFSR結合后，能通過由內而外的信號傳遞使整合素活化。與αVβ3/Src相互作用相似，RANK在Src作用下也能與αVβ3形成復合物，從而激活Syk、Slp-76、Vav3和Rac信號。這些交互作用導致溶酶體分泌小泡與胞質膜融合形成褶皺緣[17]。細胞內的H+穿過褶皺緣被泵出細胞外，與Cl-形成HCl使骨組織脫礦；同時，組織蛋白酶K分泌水平增加，使骨基質被降解。目前，組織蛋白酶K抑制劑作為新型的抗吸收藥物已進入臨床試驗階段[18-20]。最新研究顯示，OC表達的組織蛋白酶K能下調OB中RANKL的表達[4]。Src的表達是OC吸收作用所必需的，其在腫瘤中的過表達加強了腫瘤細胞的增殖、侵襲和轉移。因此，在轉移性骨疾病中，Src靶向藥物能同時抑制OC和腫瘤細胞的作用。質子泵抑制劑也已開發作為藥物，但尚未進入臨床試驗。
在骨形成過程中，大量蛋白隨著膠原一起被裝配，包括TGF-β、BMP、FGF和IGF；在骨吸收過程中，這些蛋白會被OC釋放出來并被活化，參與正常或病理狀態下的骨吸收過程。例如直接或通過調節RANKL或骨保護素（osteoprotegerin，OPG）的表達間接誘導OC的形成[16]。TGF-β還能吸引OB至骨吸收部位，使其充當偶聯因子的角色[21]。
在溶骨條件下，如佩吉特病（變形性骨炎）、巨細胞腫瘤和修復性骨肉芽腫中，OC起著巨型多核細胞的作用，其形成無需貼附于骨基質表面。例如，在修復性肉芽腫或巨細胞腫瘤中大部分OC均遠離骨組織，只有小部分OC處于骨表面，在原發性乳腺癌、胰腺癌和其他癌癥中偶見OC，但OC在這些腫瘤中的作用和形成機制尚不明確。許多蛋白，如樹突狀細胞特異性跨膜蛋白（dendritic-cell-specific transmembrane protein，DC-STAMP）、OC-STAMP及CD9等，均與細胞融合過程有關，它們的表達受到PU.1、MITF、c-Fos和NFATc1的調控[7]。Fujita等[22]發現維生素E能激活撕裂原活化蛋白激酶14和MITF的活性，從而誘導DC-STAMP的表達和OCP的融合。該研究還發現，維生素E能促進大鼠OC的形成并使大鼠骨容量下降，提示過量服用維生素E有可能導致骨質疏松癥。
4 骨免疫學與協同刺激信號
NF-κB和NFATc1信號調節OC形成，連同它們在淋巴結形成、免疫應答及炎癥性關節炎中不可或缺的作用，成為了骨免疫學的新領域，該領域主要研究骨骼系統與免疫系統細胞之間的相互作用[23]。協同刺激信號是免疫應答中的組成成分，基于T細胞活化雙信號模型提出的。在骨免疫學中，協同刺激信號通過使配體結合于免疫球蛋白樣受體，如TREM-2（一種由骨髓樣細胞表達的觸發受體）和OC聯合受體使NFATc1被激活，從而促進OC的形成和活化。盡管OCP上大部分受體的配體還未確定，但OC聯合受體可被膠原的一些特殊部位激活，這些部位在骨吸收過程中會暴露出來[24]。這些受體招募與之適配的分子（如FcRγ和DAP12），引起適配分子中免疫受體酪氨酸激活基序（immunoreceptor tyrosine-based activation motif，ITAM）的磷酸化和下游信號分子的活化。RANK和協同刺激信號均能激活磷脂酶Cγ和鈣-鈣調蛋白信號，引起細胞質中儲備鈣的釋放，并通過鈣依賴性磷酸酶——鈣神經素使NFATc1去磷酸化并轉移至細胞核。因此，協同刺激信號和RANK信號可能都是通過激活NFATc1促進OC的形成和活化，NFATc1可能是炎癥性骨疾病中一個重要的治療靶標。
NFATc1的激活過程可被環孢素A阻斷，它是一種鈣神經素/NFATc1復合物抑制劑，在臨床上作為免疫抑制藥物。Koga等[25]研究表明環孢素A能阻止RA小鼠的骨流失。NFATc1還能促進轉錄因子Osterix的表達，該轉錄因子是OB分化中處于Runx2下游的重要調節因子。正常小鼠攝入環孢素A后，因NFATc1誘導的OB形成過程受到抑制而引起骨質疏松癥，提示在正常骨重建過程中，NFATc1對OB分化的作用比對OC分化的作用更重要[25]。在炎癥性骨疾病中，骨形成過程的抑制通常有多種機制，包括TNF介導的OB功能抑制[1]，而在這些疾病中，NFATc1抑制物的主要作用應是減少骨的吸收。
T細胞和B細胞出現在RA患者關節和牙周炎患者牙齦組織中，并表達RANKL促進骨誘裂發生，但其作用機制較復雜。例如，CD3陽性T輔助（Th）細胞表達RANKL，Th17細胞通過IL-17誘導RANKL的表達，而T調節細胞則通過IL-4和IL-10的表達抑制OC的形成；Th1細胞表達INF-γ，該分子在OCP分化的不同階段對OC的形成具有抑制和促進雙重作用[12]。Berthelot等[26]發現RA患者的齦溝液中出現T調節細胞，但IL-4和IL-10的水平卻很低，且重度牙周炎患者齦溝液中的水平更低。在炎癥性骨疾病中，T細胞的作用可能是中立的[23]。在牙周炎患者的牙周軟組織中，B細胞比T細胞更多，但其表達RANKL的研究同樣存在爭議[27]。T細胞和B細胞在炎癥性骨流失中的具體作用有待更深入的研究。
5 OC形成和功能的負調控
OC的形成和功能受到多種機制的負調控，如甲狀腺C細胞分泌的降鈣素等，但這些機制在RANKL被發現之前幾乎均未被確定。RANKL的發現使研究者能夠獲得足夠數量的高純度OCP進行基因表達譜研究。OPG是整個骨吸收過程中最主要的負調節物，它通過與RANKL結合來競爭性抑制RANK與RANKL的相互作用。大多數青少年佩吉特病都是因OCP的編碼基因發生功能缺失突變引起的，患者體內過量的RANKL表達引起骨質疏松，這與OPG基因敲除小鼠的表型相似。
5.1 OB介導的負調控
OB能通過多種信號通路參與OC形成的負調控，并能調節OPG的表達。例如，典型的Wnt/β-catenin信號通路不僅是OB形成過程所必需，還能促進OB中OPG的表達[28]。相反，Wnt-5a介導的非典型信號通路則通過OCP中的孤兒受體蛋白（類似于酪氨酸激酶受體）促進OC的形成[29]。此外，Jagged-1/Notch-1信號通路也能促進OB的分化，并提高間質細胞中OPG/RANKL的表達比值，從而抑制OC的形成[1]。
信號素家族（Semas）也能調節OC和OB之間的相互作用，它們以分泌蛋白和膜蛋白的形式被這兩種細胞廣泛表達。Sema3A由OB和OC分泌，能通過抑制ITAM和RhoA信號來抑制RANKL誘導的OC形成；Sema4D由OC表達，能通過激活IGF-1信號抑制因子RhoA-ROCK來抑制OB的分化及其功能。相反，Sema6D則能通過TREM-2/DAP12/PLCγ途徑誘導NFATc1的活化，從而促進OC的形成，并能通過OC中Rac-GTP的生成來誘導偽足小體的形成，從而促進OC的活化[30]。Semas通過神經叢素和跨膜蛋白傳遞信號，缺少這些蛋白的基因敲除小鼠存在骨硬化癥或骨質疏松癥，說明它們在骨細胞功能中起著非常重要的作用。
RANKL還能通過某些調控機制限制OC的形成。例如，c-Fos能調節NFATc1誘導的OC形成過程，還能促進干擾素-β的分泌，干擾素-β反過來能結合于OCP上的c-Fos受體，從而導致c-Fos蛋白水平的下降。c-Fos/NFATc1信號還能促進OCP表面膜附著型配體B2的表達。膜附著型配體在胚胎發育過程中能直接與鄰近細胞的Eph受體結合并雙向傳遞信號，從而調節軸突細胞、內皮細胞及免疫細胞的功能。膜附著型配體B2結合于OB上的Eph4受體后，經反向信號傳遞下調c-Fos和NFATc1的表達，從而限制OC的形成，而正向信號則通過抑制小型GTP酶RhoA來促進OB前體細胞的分化[31]。
以上這些不同的交互作用在BRU具體是如何發生、在何處發生、哪些是發生在OC和OB之間或它們的前體細胞之間，目前均未明確。可能機制為在BRU骨吸收部位，OB前體細胞正向調節OC的形成和融合；在相反一側即新骨形成部位，OCP促進OB前體細胞的分化，OB則促進OC的凋亡。此外，成熟的OB中OPG的分泌和其他OC形成負調節蛋白的表達也使OC遠離新骨形成部位。
5.2 RANK信號的組成性轉錄抑制
一些組成性調節機制也能抑制OC的形成。例如，在RANKL缺乏時，Bcl-6會被募集至NFATc1、組織蛋白酶K和DC-STAMP的啟動子部位，從而抑制骨誘裂發生。RANKL能促使Bcl-6從這些蛋白基因的啟動子上移除并被NFATc1替代，從而介導骨誘裂發生[32]。其他一些組成性轉錄抑制物，如干擾素調節因子8、Eos和v-maf肌腱膜纖維肉瘤基因家族蛋白B等，它們的表達受到RANK信號的下調[12]。同時，這些組成性轉錄抑制物也是B淋巴細胞誘導的成熟蛋白1的直接靶點，該蛋白在OC中的缺失會導致因Bcl-6表達上調和骨誘裂發生過程受損而引起的骨硬化癥。相反，Bcl-6基因敲除小鼠OC形成增加，并引發嚴重的骨質疏松癥[32]。因此在OCP中，RANKL/RANK信號通路對NFATc1的活化不僅能直接促進骨誘裂發生，還能通過抑制這些負調節蛋白的表達來間接促進骨誘裂發生。
5.3 促炎性細胞因子
在許多疾病如RA和牙周炎中，細胞因子是發生骨吸收和炎性反應的重要誘導物，但同時也會通過一些途徑來限制這些破壞過程。例如，大多數誘導RANKL表達的因子同時也能誘導OPG的表達，盡管在一定程度上，其絕對效應還是促進骨吸收[33]。與之類似，雖然TNF能誘導骨吸收且不依賴于RANKL途徑，但它同時也能通過某些途徑限制OC的形成，包括阻止非典型NF-κB信號抑制蛋白的降解[14]和誘導OCP中干擾素調節因子8和RBP-Jκ（一種Notch誘導的DNA結合蛋白）的表達[12]。TNF還能促進OC及OCP中TNF刺激基因6的分泌，該基因與OPG協同作用，通過自分泌機制限制OC的活化[34]。具有消炎功能的抗炎性細胞因子IL-10，能通過抑制OCP中c-Fos、c-Jun、TREM-2和NFATc1的表達來限制OC的形成。IL-4則通過在OC形成過程中促進OPG的表達和抑制RANKL、RANK、NF-κB、c-Fos、NFATc1和MAPK的表達及鈣信號來限制骨吸收過程[12]。
6 OC的凋亡與存活
在BRU中新骨形成部位，OC發生凋亡，新骨由OB生成。Nakamura等[35]研究表明，雌激素一方面通過促進TGF-β介導的OC凋亡和OC中Fas配體的表達來維持骨量，另一方面還抑制OC活化調節基因的表達，但并不影響OCP的增殖和融合。Rogers等[36]研究表明，部分雙磷酸鹽類藥物能通過抑制甲羥戊酸途徑中酶的活性和促進半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶（Caspase）的裂解來誘導OC的凋亡，但有些氨基雙磷酸鹽類盡管也能抑制骨吸收，但不誘導OC的凋亡。此外，地諾單抗和雷洛昔芬也能誘導OC的凋亡，但降鈣素和組織蛋白酶K抑制劑卻不能[37-38]。
OC的存活受到多種細胞因子影響，包括M-CSF、RANKL、TNF、IL-1和VEGF-A等。這些因子通過上調Ras/Rac-1/Erk和PI3K/mTOR/S6K信號來促進OC的存活，阻斷這些細胞因子的表達會導致抗凋亡蛋白Bcl-2表達的下降，并加速OC的凋亡[39]。RANKL信號的早期效應之一就是NF-κB p65阻斷Bid和Caspase-3誘導的OCP凋亡。M-CSF則能通過多種途徑阻斷OC的凋亡，包括激活MITF使Bcl-2的表達增加；通過泛素連接酶c-Cbl促進Bim的降解；上調Bcl-XL的表達使Caspase-9前體蛋白的裂解受到抑制；以及抑制Caspase-3、9，使凋亡無法啟動。Bim是一個促凋亡的Bcl-2家族成員，其表達能被IL-3經Raf/Erk和PI3K/mTOR途徑下調。Bim基因敲除小鼠OC的存活增加，但活性卻降低[39]。但OC存活的加強總體有利于增加骨吸收。
7 小結與展望
近年來OC形成和功能活化調節機制的研究已取得了顯著進展。骨髓來源的OCP在一系列趨化因子和細胞因子的作用下經血循環進入骨組織并分化成OC，發揮骨吸收功能。M-CSF和RANKL是OC形成和活化過程中最重要的調節因子，其調節作用可通過多種信號通路實現。活化的OC除了介導骨吸收，還具有參與免疫應答、調節OB形成等功能，因此骨免疫學的概念被提出，調節T細胞活化的協同刺激信號被證明也能促進OC的形成和活化。NFATc1是骨免疫學研究的重點，并有可能成為炎癥性骨疾病的治療靶點。OC的形成和功能還受到多種機制的負調控，包括OB介導的負調控、RANKL信號的組成性轉錄抑制和一些促炎性細胞因子。OPG是骨吸收過程中最重要的負調節物，多種負調節機制均與該蛋白的表達相關。此外，對OC凋亡和存活的調節也會影響骨吸收的進程。所有這些研究都有助于了解各種骨性疾病對骨組織的破壞機制，尋找更合理的生物學治療靶標，從而開發更有效的治療藥物。