引用本文： 孫舒瑤, 王椿, 冉興無. 微小RNA在糖尿病創面愈合中的研究進展. 中國修復重建外科雜志, 2014, 28(11): 1431-1434. doi: 10.7507/1002-1892.20140308 復制
糖尿病患者創面常遷延不愈，治療困難，費用高，是糖尿病最具威脅性的慢性并發癥，也是致殘、致死的主要原因。導致創面遷延不愈的因素較多，包括生長因子合成減少、血管新生降低、巨噬細胞減少及功能受損、膠原沉積減少、新生肉芽組織減少、角質細胞和成纖維細胞遷移以及增殖減弱等[1]。
微小RNA（microRNA，miRNA）是近年發現的一種重要調控因子，主要作用于轉錄后水平的調控[2]，它是內源性基因編碼、長度約為22個核苷酸分子的非編碼單鏈小分子RNA。研究表明，miRNA是多種生理及病理過程的主要參與者，與細胞生長、變異、遷移、凋亡、血管新生、致癌作用等有關，調節異常可引起一系列疾病[3-6]。創面愈合是一種涉及多種細胞及分子的復雜過程，主要包括炎癥期、增生期和重塑期3個階段。miRNA在皮膚形成及創面愈合過程中起調控作用[7-8]，其表達紊亂會影響創面愈合。目前已有研究發現糖尿病患者體內存在多種表達異常的miRNA，本文就其中部分miRNA在糖尿病患者創面愈合各期中的研究進展作一綜述。
1 炎癥期相關miRNA
越來越多的證據顯示糖尿病慢性創面與炎癥基因表達持續上調有密切關系[9]，包括抑制及促進炎性反應兩方面。
miRNA-146是首個被發現在免疫系統中有調節作用的RNA，它與自身免疫性疾病、炎性反應、腫瘤等密切相關[10-13]。miRNA-146家族包括miRNA-146a及miRNA-146b，兩者基因分別位于人第5號染色體及第10號染色體，它們的成熟序列僅相差2個堿基。目前對miRNA-146a的研究較多。miRNA-146a的啟動子上游有NF-κB的結合位點，脂多糖、TNF-α、IL-1等可經NF-κB誘導miRNA-146a的表達[14]。miRNA-146a通過直接下調Toll樣受體及IL-1b通路上的兩個關鍵分子—TNF受體相關因子6（TNF receptor-associated factor 6，TRAF6）和IL-1受體相關激酶1，減少IL-1、IL-6及TNF-α的釋放，負調控炎性反應及免疫反應[14-15]。Xu等[16]的研究顯示與正常大鼠相比，糖尿病大鼠miRNA-146a表達無明顯差異；但當潰瘍形成后，糖尿病大鼠潰瘍局部miRNA-146a的表達明顯下調，提示miRNA-146a表達下調可能導致糖尿病皮膚潰瘍的慢性炎癥。研究表明，miRNA-146a過表達后可以通過TRAF6、IL-1受體相關激酶1抑制MyD88信號通路誘導免疫耐受[17]。而糖尿病創面局部miRNA-146a表達下調，會造成局部炎性細胞持續高反應，引起過度炎性刺激。另外，熊瑋等[18]的體外研究發現，miRNA-146a可以促進血管平滑肌細胞的增殖及遷移，其作用可能與促進NF-κB p65的表達、誘導炎癥有關。
miRNA-155是大多數炎性介質的作用靶點，TNF-α、聚肌苷酸（聚）胞苷酸、IFN-β均可誘導miRNA-155上調，而升高的miRNA-155可以降低基質金屬蛋白酶的表達，基質金屬蛋白酶可介導炎癥對組織的損傷，提示miRNA-155可能是一種保護性的miRNA[10]。同時也有研究報道，IL-10可以抑制miRNA-155的轉錄，解除miRNA-155對SHIP1（src homology-2 domain-containing inositol 5-phosphatase?1）基因的抑制，使磷脂酰肌醇三磷酸轉變為無活性的磷脂酰肌醇雙磷酸，發揮抗炎作用[19]。Kishore等[20]將小鼠心肌成纖維細胞暴露于正常血糖及高血糖環境中，24 h后發現高血糖環境下miRNA-155明顯上調。
有研究表明高血糖可以上調血管平滑肌細胞上的miRNA-125b[21]。miRNA-125b的作用靶點是Suv39h1，可誘導Suv39h1降低，導致炎性因子（如IL-6、單核細胞趨化蛋白1）表達升高，以及促進單核細胞黏附于血管平滑肌細胞上。另外，miRNA-125b還可與TNF-αmRNA的3’UTR結合抑制其翻譯[22]，TNF-α是重要的炎性因子，在組織重塑及炎癥的產生及維持中均有重要作用，miRNA-125b對于局部炎性反應的總體調控作用需進一步研究。
2 增生期相關miRNA
有研究通過Dicer敲除小鼠模型證實miRNA在血管新生中的作用[23]；此后，大量研究關注于miRNA對血管新生的影響。
2.1 促進血管新生
miRNA-126為內皮細胞特異性miRNA，其作用靶點是VEGF信號通路中的兩個負調控因子——萌芽相關蛋白1及3-磷酸激酶調節蛋白2。實驗發現，大鼠缺乏miRNA-126即表現出血管滲漏、出血，提示miRNA-126在維持血管內皮功能穩定、血管壁完整、血管新生及創面愈合中發揮重要作用，被認為是內皮細胞特異性的血管生成調節因子[24]。Zampetaki等[25]研究發現糖尿病患者組織中miRNA-126的表達受到明顯抑制，且內皮凋亡小體中miRNA-126的含量呈葡萄糖依賴性，并成負相關。
大多數糖尿病慢性創面存在微循環障礙，低灌注造成組織局部缺氧。miRNA-210是一類對缺氧很敏感的miRNA。低氧誘導因子1（hypoxia-inducible factor 1，HIF-1）是低氧傳感機制和調節轉錄的一個核心因子，而miRNA-210是HIF的一個穩定靶點，低氧狀態下HIF-1α發生穩定化，從而誘導miRNA-210上調[26-29]。miRNA-210的直接作用靶點是Ephrin-A3 [26]，Ephrin家族是VEGF信號通路調節血管新生過程的重要組成分子，miRNA-210可以通過下調Ephrin-A3的蛋白表達，促進血管新生。另外miRNA-210表達升高，還可抑制轉錄因子E2F3，影響角質細胞增殖，阻礙缺血性創面的愈合[27, 30]。
miRNA-93的作用靶點是VEGF-A，高血糖狀態下內皮細胞中miRNA-93的表達明顯下調，VEGF-A的表達亦明顯下調[31]，提示miRNA可以正向調控VEGF-A的表達。氧化還原狀態是刺激血管新生的重要因素，Roy等[32]首次提出miRNA可以通過微血管內皮細胞中的NADPH氧化酶調節細胞的氧化還原狀態。
2.2 抑制血管新生
miRNA-320的目標靶點包括多種生長因子（如VEGF、FGF、IGF-1）及其受體。Wang等[33]的研究發現，糖尿病心肌微血管內皮細胞中miRNA-320呈高表達，通過轉染miRNA-320的抑制劑至GK小鼠心肌微血管內皮細胞上，可改善心肌細胞的增殖及遷移，還可增加IGF-1的表達，后者可促進血管新生。由此可見，高表達的miRNA-320在糖尿病患者創面局部血管新生障礙中也發揮一定作用。
miRNA-503能抑制血管新生，其作用靶點主要是細胞周期調節物cdc25A及細胞周期素E1。研究顯示，與非糖尿病/非下肢缺血的正常對照組相比，糖尿病組患者下肢缺血的肌肉以及內皮細胞中miRNA-503均為高表達[34]。體外及動物實驗證實，在高血糖及缺氧的條件下，內皮細胞上的miRNA-503表達上調[34]。通過誘導或反義寡核苷酸阻遏miRNA-503后，可以改善內皮細胞的功能。
miRNA-221/222在人臍靜脈內皮細胞高表達，其靶點為c-kit。c-kit是干細胞因子的酪氨酸激酶受體，可以促進內皮細胞遷移及毛細血管形成[35]。miRNA-221/222通過抑制c-kit，抑制血管新生。Li等[36]研究了miRNA-221在糖尿病誘導的內皮功能紊亂中的作用，發現miRNA-221高表達，c-kit低表達，進一步明確了c-kit為miRNA-221/222的作用靶點。Togliatto等[37]觀察了miRNA-221/222在高血糖及高糖化終產物介導的血管損害中的作用，發現高血糖及高糖化終產物可通過下調miRNA-221/222，使miRNA-221/222對細胞周期激酶抑制蛋白P27KIP1及P57KIP2的抑制作用減弱，從而損害內皮細胞及內皮祖細胞，影響血管新生。提示miRNA-221/222直接參與了高血糖及高糖化終產物相關性細胞周期的改變。
miRNA-200b可以直接作用于微血管內皮細胞上的Ets-1，還可以使Ets-1的相關基因沉默，包括基質金屬蛋白酶1及VEGF受體2。低氧及HIF-1α穩定化均可以抑制miRNA-200b表達[32]。McArthur等[38]提出在糖尿病鼠的視網膜中miRNA-200b表達下調，同時VEGF-A表達上調，認為miRNA-200b還可以通過作用于VEGF-A發揮抑制血管新生及降低血管通透性的作用。
2.3 促進肉芽組織形成及再上皮化
miRNA-21最初被認為是一個致癌miRNA，最近研究表明其在多種細胞增殖、分化、凋亡、上皮細胞間質化及遷移中均發揮重要作用[39-40]。有研究顯示，miRNA-21可以促進創面局部成纖維細胞及角質細胞的遷移[41-42]，從而促進創面的肉芽組織形成及再上皮化，加快創面愈合。miRNA-21的作用靶點是程序性細胞凋亡因子4（programmed cell death 4，PDCD4），后者在血管內皮細胞中發揮促凋亡作用[43]。PDCD4還是一種促炎性蛋白，可以提高轉錄因子NF-κB的活性，抑制抗炎因子IL-10的產生。而IL-10缺乏是糖尿病創面局部炎性應答紊亂的重要原因[44]。細胞轉染premiRNA-21后可抑制NF-κB的活性，促進IL-10產生[45]。
Madhyastha等[41]比較了糖尿病大鼠及正常大鼠的皮膚組織，發現糖尿病大鼠皮膚中miRNA-21顯著高表達，然而在潰瘍愈合過程中，正常對照組創面局部組織中miRNA-21表達逐漸上調，糖尿病大鼠miRNA-21表達卻呈下降趨勢。這一變化可能與糖尿病創面愈合延遲有關。因此，miRNA-21在糖尿病慢性創面的局部炎癥、血管新生及細胞遷移方面均發揮一定作用。
3 重塑期相關miRNA
TGF-β家族因子是損傷修復及細胞外基質合成的重要調節因素[46]。研究發現，miRNA-29的異常表達與包括TGF-β在內的促纖維化細胞因子及部分生長因子有關，而miRNA-29還具有調節促纖維化細胞因子的作用。miRNA-29家族包括miRNA-29a、miRNA-29b、miRNA-29c，膠原沉積是創面重塑期的重要步驟，miRNA-29a可以直接調節膠原表達[47]，miRNA-29b及miRNA-29c可以抑制一些細胞外基質蛋白，還可抑制Smads及β-連環蛋白，后兩者對創面的瘢痕愈合有重要影響[48]。目前有研究提出在糖尿病鼠體內miRNA-29家族在胰島素靶組織肌肉、脂肪及肝臟中均呈高表達，且miRNA-29a和miRNA-29b可能與胰島素抵抗有關[49]。但miRNA-29a的表達水平與糖尿病慢性創面間的關系尚未明確，仍需進一步研究。
4 展望
對于糖尿病創面，以上miRNA的異常表達在創面愈合過程中所起作用尚需進一步研究。糖尿病創面治療風險大，預后欠佳，致殘率及致死率均較高，進一步研究miRNA可以為足潰瘍的治療提供更多的理論及臨床依據。
糖尿病患者創面常遷延不愈，治療困難，費用高，是糖尿病最具威脅性的慢性并發癥，也是致殘、致死的主要原因。導致創面遷延不愈的因素較多，包括生長因子合成減少、血管新生降低、巨噬細胞減少及功能受損、膠原沉積減少、新生肉芽組織減少、角質細胞和成纖維細胞遷移以及增殖減弱等[1]。
微小RNA（microRNA，miRNA）是近年發現的一種重要調控因子，主要作用于轉錄后水平的調控[2]，它是內源性基因編碼、長度約為22個核苷酸分子的非編碼單鏈小分子RNA。研究表明，miRNA是多種生理及病理過程的主要參與者，與細胞生長、變異、遷移、凋亡、血管新生、致癌作用等有關，調節異常可引起一系列疾病[3-6]。創面愈合是一種涉及多種細胞及分子的復雜過程，主要包括炎癥期、增生期和重塑期3個階段。miRNA在皮膚形成及創面愈合過程中起調控作用[7-8]，其表達紊亂會影響創面愈合。目前已有研究發現糖尿病患者體內存在多種表達異常的miRNA，本文就其中部分miRNA在糖尿病患者創面愈合各期中的研究進展作一綜述。
1 炎癥期相關miRNA
越來越多的證據顯示糖尿病慢性創面與炎癥基因表達持續上調有密切關系[9]，包括抑制及促進炎性反應兩方面。
miRNA-146是首個被發現在免疫系統中有調節作用的RNA，它與自身免疫性疾病、炎性反應、腫瘤等密切相關[10-13]。miRNA-146家族包括miRNA-146a及miRNA-146b，兩者基因分別位于人第5號染色體及第10號染色體，它們的成熟序列僅相差2個堿基。目前對miRNA-146a的研究較多。miRNA-146a的啟動子上游有NF-κB的結合位點，脂多糖、TNF-α、IL-1等可經NF-κB誘導miRNA-146a的表達[14]。miRNA-146a通過直接下調Toll樣受體及IL-1b通路上的兩個關鍵分子—TNF受體相關因子6（TNF receptor-associated factor 6，TRAF6）和IL-1受體相關激酶1，減少IL-1、IL-6及TNF-α的釋放，負調控炎性反應及免疫反應[14-15]。Xu等[16]的研究顯示與正常大鼠相比，糖尿病大鼠miRNA-146a表達無明顯差異；但當潰瘍形成后，糖尿病大鼠潰瘍局部miRNA-146a的表達明顯下調，提示miRNA-146a表達下調可能導致糖尿病皮膚潰瘍的慢性炎癥。研究表明，miRNA-146a過表達后可以通過TRAF6、IL-1受體相關激酶1抑制MyD88信號通路誘導免疫耐受[17]。而糖尿病創面局部miRNA-146a表達下調，會造成局部炎性細胞持續高反應，引起過度炎性刺激。另外，熊瑋等[18]的體外研究發現，miRNA-146a可以促進血管平滑肌細胞的增殖及遷移，其作用可能與促進NF-κB p65的表達、誘導炎癥有關。
miRNA-155是大多數炎性介質的作用靶點，TNF-α、聚肌苷酸（聚）胞苷酸、IFN-β均可誘導miRNA-155上調，而升高的miRNA-155可以降低基質金屬蛋白酶的表達，基質金屬蛋白酶可介導炎癥對組織的損傷，提示miRNA-155可能是一種保護性的miRNA[10]。同時也有研究報道，IL-10可以抑制miRNA-155的轉錄，解除miRNA-155對SHIP1（src homology-2 domain-containing inositol 5-phosphatase?1）基因的抑制，使磷脂酰肌醇三磷酸轉變為無活性的磷脂酰肌醇雙磷酸，發揮抗炎作用[19]。Kishore等[20]將小鼠心肌成纖維細胞暴露于正常血糖及高血糖環境中，24 h后發現高血糖環境下miRNA-155明顯上調。
有研究表明高血糖可以上調血管平滑肌細胞上的miRNA-125b[21]。miRNA-125b的作用靶點是Suv39h1，可誘導Suv39h1降低，導致炎性因子（如IL-6、單核細胞趨化蛋白1）表達升高，以及促進單核細胞黏附于血管平滑肌細胞上。另外，miRNA-125b還可與TNF-αmRNA的3’UTR結合抑制其翻譯[22]，TNF-α是重要的炎性因子，在組織重塑及炎癥的產生及維持中均有重要作用，miRNA-125b對于局部炎性反應的總體調控作用需進一步研究。
2 增生期相關miRNA
有研究通過Dicer敲除小鼠模型證實miRNA在血管新生中的作用[23]；此后，大量研究關注于miRNA對血管新生的影響。
2.1 促進血管新生
miRNA-126為內皮細胞特異性miRNA，其作用靶點是VEGF信號通路中的兩個負調控因子——萌芽相關蛋白1及3-磷酸激酶調節蛋白2。實驗發現，大鼠缺乏miRNA-126即表現出血管滲漏、出血，提示miRNA-126在維持血管內皮功能穩定、血管壁完整、血管新生及創面愈合中發揮重要作用，被認為是內皮細胞特異性的血管生成調節因子[24]。Zampetaki等[25]研究發現糖尿病患者組織中miRNA-126的表達受到明顯抑制，且內皮凋亡小體中miRNA-126的含量呈葡萄糖依賴性，并成負相關。
大多數糖尿病慢性創面存在微循環障礙，低灌注造成組織局部缺氧。miRNA-210是一類對缺氧很敏感的miRNA。低氧誘導因子1（hypoxia-inducible factor 1，HIF-1）是低氧傳感機制和調節轉錄的一個核心因子，而miRNA-210是HIF的一個穩定靶點，低氧狀態下HIF-1α發生穩定化，從而誘導miRNA-210上調[26-29]。miRNA-210的直接作用靶點是Ephrin-A3 [26]，Ephrin家族是VEGF信號通路調節血管新生過程的重要組成分子，miRNA-210可以通過下調Ephrin-A3的蛋白表達，促進血管新生。另外miRNA-210表達升高，還可抑制轉錄因子E2F3，影響角質細胞增殖，阻礙缺血性創面的愈合[27, 30]。
miRNA-93的作用靶點是VEGF-A，高血糖狀態下內皮細胞中miRNA-93的表達明顯下調，VEGF-A的表達亦明顯下調[31]，提示miRNA可以正向調控VEGF-A的表達。氧化還原狀態是刺激血管新生的重要因素，Roy等[32]首次提出miRNA可以通過微血管內皮細胞中的NADPH氧化酶調節細胞的氧化還原狀態。
2.2 抑制血管新生
miRNA-320的目標靶點包括多種生長因子（如VEGF、FGF、IGF-1）及其受體。Wang等[33]的研究發現，糖尿病心肌微血管內皮細胞中miRNA-320呈高表達，通過轉染miRNA-320的抑制劑至GK小鼠心肌微血管內皮細胞上，可改善心肌細胞的增殖及遷移，還可增加IGF-1的表達，后者可促進血管新生。由此可見，高表達的miRNA-320在糖尿病患者創面局部血管新生障礙中也發揮一定作用。
miRNA-503能抑制血管新生，其作用靶點主要是細胞周期調節物cdc25A及細胞周期素E1。研究顯示，與非糖尿病/非下肢缺血的正常對照組相比，糖尿病組患者下肢缺血的肌肉以及內皮細胞中miRNA-503均為高表達[34]。體外及動物實驗證實，在高血糖及缺氧的條件下，內皮細胞上的miRNA-503表達上調[34]。通過誘導或反義寡核苷酸阻遏miRNA-503后，可以改善內皮細胞的功能。
miRNA-221/222在人臍靜脈內皮細胞高表達，其靶點為c-kit。c-kit是干細胞因子的酪氨酸激酶受體，可以促進內皮細胞遷移及毛細血管形成[35]。miRNA-221/222通過抑制c-kit，抑制血管新生。Li等[36]研究了miRNA-221在糖尿病誘導的內皮功能紊亂中的作用，發現miRNA-221高表達，c-kit低表達，進一步明確了c-kit為miRNA-221/222的作用靶點。Togliatto等[37]觀察了miRNA-221/222在高血糖及高糖化終產物介導的血管損害中的作用，發現高血糖及高糖化終產物可通過下調miRNA-221/222，使miRNA-221/222對細胞周期激酶抑制蛋白P27KIP1及P57KIP2的抑制作用減弱，從而損害內皮細胞及內皮祖細胞，影響血管新生。提示miRNA-221/222直接參與了高血糖及高糖化終產物相關性細胞周期的改變。
miRNA-200b可以直接作用于微血管內皮細胞上的Ets-1，還可以使Ets-1的相關基因沉默，包括基質金屬蛋白酶1及VEGF受體2。低氧及HIF-1α穩定化均可以抑制miRNA-200b表達[32]。McArthur等[38]提出在糖尿病鼠的視網膜中miRNA-200b表達下調，同時VEGF-A表達上調，認為miRNA-200b還可以通過作用于VEGF-A發揮抑制血管新生及降低血管通透性的作用。
2.3 促進肉芽組織形成及再上皮化
miRNA-21最初被認為是一個致癌miRNA，最近研究表明其在多種細胞增殖、分化、凋亡、上皮細胞間質化及遷移中均發揮重要作用[39-40]。有研究顯示，miRNA-21可以促進創面局部成纖維細胞及角質細胞的遷移[41-42]，從而促進創面的肉芽組織形成及再上皮化，加快創面愈合。miRNA-21的作用靶點是程序性細胞凋亡因子4（programmed cell death 4，PDCD4），后者在血管內皮細胞中發揮促凋亡作用[43]。PDCD4還是一種促炎性蛋白，可以提高轉錄因子NF-κB的活性，抑制抗炎因子IL-10的產生。而IL-10缺乏是糖尿病創面局部炎性應答紊亂的重要原因[44]。細胞轉染premiRNA-21后可抑制NF-κB的活性，促進IL-10產生[45]。
Madhyastha等[41]比較了糖尿病大鼠及正常大鼠的皮膚組織，發現糖尿病大鼠皮膚中miRNA-21顯著高表達，然而在潰瘍愈合過程中，正常對照組創面局部組織中miRNA-21表達逐漸上調，糖尿病大鼠miRNA-21表達卻呈下降趨勢。這一變化可能與糖尿病創面愈合延遲有關。因此，miRNA-21在糖尿病慢性創面的局部炎癥、血管新生及細胞遷移方面均發揮一定作用。
3 重塑期相關miRNA
TGF-β家族因子是損傷修復及細胞外基質合成的重要調節因素[46]。研究發現，miRNA-29的異常表達與包括TGF-β在內的促纖維化細胞因子及部分生長因子有關，而miRNA-29還具有調節促纖維化細胞因子的作用。miRNA-29家族包括miRNA-29a、miRNA-29b、miRNA-29c，膠原沉積是創面重塑期的重要步驟，miRNA-29a可以直接調節膠原表達[47]，miRNA-29b及miRNA-29c可以抑制一些細胞外基質蛋白，還可抑制Smads及β-連環蛋白，后兩者對創面的瘢痕愈合有重要影響[48]。目前有研究提出在糖尿病鼠體內miRNA-29家族在胰島素靶組織肌肉、脂肪及肝臟中均呈高表達，且miRNA-29a和miRNA-29b可能與胰島素抵抗有關[49]。但miRNA-29a的表達水平與糖尿病慢性創面間的關系尚未明確，仍需進一步研究。
4 展望
對于糖尿病創面，以上miRNA的異常表達在創面愈合過程中所起作用尚需進一步研究。糖尿病創面治療風險大，預后欠佳，致殘率及致死率均較高，進一步研究miRNA可以為足潰瘍的治療提供更多的理論及臨床依據。