引用本文： 陳冬, 劉亞雄, 賀健康, 王振, 馬磊, 靳忠民. 原位3-D打印技術的研究現狀與未來. 中國修復重建外科雜志, 2014, 28(11): 1428-1430. doi: 10.7507/1002-1892.20140307 復制
3-D打印技術是通過分層加工、疊加成型方式制造三維實體，也稱作快速成型技術。近年來該技術發展迅速，已廣泛用于機械制造、航空航天和生物醫療等領域。在外科修復與重建方面，主要用于定制手術方案模型和個性化植入物，體外打印組織工程支架，以及直接打印生物材料與細胞的混合物制備立體人工組織，用于修復重建受損組織。但對于直接采用自體細胞進行體外3-D打印或培養形成細胞團后植入患者體內的方法，在醫療界尚存在許多爭議；同時缺損組織形態主要由術中切除范圍確定，因而術前無法進行植入物的準確設計與制造；如植入物較大時植入也對機體造成較大創傷。隨著實時測量技術和生物制造技術的發展，3-D打印技術出現了一個重要分支——原位3-D打印技術。該技術是指在手術過程中，通過對患者病變部位進行掃描，獲得缺損部位數據，同時快速采集患者細胞（如干細胞）與生物材料混合，然后利用生物3-D打印機直接在缺損部位進行定制化、形態適配化的原位3-D打印，實現人體組織的修復。由于原位3-D打印可以采用機械臂通過單孔進入腹腔內打印，實現了微創化手術，無需后處理操作，縮短手術介入時間，臨床應用潛力巨大。從理論上說，原位3-D打印技術可用于不同組織修復重建，但目前研究主要集中在真皮組織修復、小鼠顱骨缺損修復、小牛股骨和骨軟骨缺損修復。現就目前以上領域的研究進展作一綜述，總結研究現狀，展望未來發展方向。
1 真皮組織修復
在日常生活中，皮膚燒傷非常常見。大面積皮膚缺損會引起體液丟失、水電解質紊亂及低蛋白血癥、嚴重感染等，因而皮膚修復具有重要意義[1]。如果全層皮膚缺損直徑 > ?4 cm時，創面不能自行愈合。傳統治療方法是采用自體皮膚或商業皮膚移植修復，但該方法所需材料來源及尺寸有限，準備時間長，在病情嚴重情況下無法及時挽救患者生命。
2010年，美國維克森林大學再生醫學研究所制造了一臺能直接修復皮膚缺損的原位3-D打印機[2]。首先，利用生物打印機的激光掃描器對患者傷口進行掃描，并標示出需要進行皮膚移植的部位；然后，打印機一個噴墨閥噴出凝血酶，另一個噴墨閥噴出細胞、Ⅰ型膠原蛋白以及纖維蛋白原組成的混合物，通過凝血酶和纖維蛋白原相互反應形成纖維；最后打印一層角質細胞和纖維細胞，形成皮膚。通過對小鼠皮膚傷口模型打印人成纖維細胞和角質細胞進行驗證，表明直接打印兩種不同的皮膚細胞可行且細胞均成活；與未作處理的自然對照組相比，通過原位3-D打印修復的傷口愈合速度更快。
2014年，美國Microfab公司和維克森林大學再生醫學研究所合作開發出一種用于真皮修復的噴墨打印機，結合低體積高精度的噴墨系統，控制細胞、生長因子和脫細胞基質的有序沉積，形成皮膚替代物，為患者提供原位快速皮膚修復[3]。該打印機使用的打印材料為融合自體細胞，將細胞打印在皮膚缺損部位后，通過即時交聯劑霧化器或紫外光來實現水凝膠材料和細胞的交聯固化，形成皮膚替代物。
2013年，英國倫敦大學學院的Sofokleous等[4]提出一種手持多噴頭電流體噴射槍系統，利用電噴霧和靜電紡絲技術實時原位3-D打印聚合物網格，其具有類似于皮膚的細胞外基質形態和結構特征，能對患者皮膚破損部位進行原位修復。
本課題組提出了一種3-D打印技術與壓印技術相結合的原位深皮修復方法，該方法可以快速、精準的適配缺損組織形貌，形成具有微流道的組織，實現深皮修復。具體操作步驟：①用表面探測器對缺損部位進行掃描，獲取缺損部位數據；②使用一個打印頭在缺損部位打印混合有平滑肌細胞、成纖維細胞或干細胞的光敏水溶液；③用透明硅膠模具對光敏水溶液進行壓印，同時進行曝光使材料固化，獲得一層具有流道的結構；④移開模具，使用另一個打印頭在形成的流道中注射混合有血管內皮細胞的溫敏溶液，作為打印下一層結構的輔助支撐；⑤重復以上步驟，進行逐層累加，形成多層構建體；注意控制該構建體處于合適的溫度，使溫敏水溶性材料溶解，最終形成具有流道的深皮修復結構。但目前該方法仍處于研究初期，尚未進行動物實驗。
2 硬組織修復
2.1 顱骨
隨著工業的發展和高速交通工具的普及，顱腦損傷已成為一種常見病、多發病[5]。急性顱腦損傷病情危重、變化迅速，死亡率較高[6]。因此探索一種能及時顱腦損傷修復方法具有重要意義。
法國波爾多第二大學的Keriquel等[7]提出一種通過計算機輔助和醫療機器人在小鼠顱骨原位3-D打印納米羥基磷灰石修復顱骨的方法。手術過程中采用CCD相機掃描定位，計算機控制機器運動，對齊至z軸方向上，利用激光誘導移動方法（利用脈沖激光傳送打印材料到基質上）在缺損部位打印納米羥基磷灰石溶液，精確控制材料、藥量和空間結構，逐層累加，進行顱骨修復。實驗結果表明該方法修復小鼠顱骨缺損后有骨組織生成，且速度快于自體修復。
2.2 骨和骨軟骨
骨和骨軟骨損傷在運動或交通事故傷中常見，傳統組織工程修復方法是將自體或同種異體細胞培養后接種至一種組織相容性好、可降解的生物材料上，然后植入生物體內修復缺損。這一過程周期長且操作復雜，因此需要一種可以利用生物材料創建定制化植入物，加快軟骨修復進程，減少手術操作時間的一種新技術。
2010年，美國康奈爾大學的Cohen等[8]提出了一種骨和骨軟骨缺損的原位修復方法。首先用CT掃描股骨，獲得損傷部位的圖像，然后在Mimics V12軟件中重建獲得三維圖像，用計算機處理獲得制造路徑，將損傷部位裝夾固定于打印機上進行原位打印修復。軟骨缺損的打印材料是一種在打印前已發生離子交聯的藻酸鹽水凝膠，成型過程不依賴外部因素實現相變，適用于原位3-D打印。骨組織修復材料為脫鈣骨基質制劑。
近期，澳大利亞電子材料科學國家重點實驗室（ACES）提出了一種用生物筆原位修復骨組織的方法[9]。該方法通過將細胞溶于生物聚合物，如海藻酸、海藻萃取液中，手工操作生物筆將其注射在骨組織缺損部位，然后注射一層保護性凝膠，同時紫外光固化，并逐層累加，達到原位修復骨組織缺損的目的。但這種原位修復方式由于缺乏數字化控制技術的介入，不屬于真正意義上的原位3-D打印技術。
本課題組提出采用原位3-D打印技術進行牙齒修復的方法，首先利用掃描設備對牙齒缺損部位進行掃描，計算缺損部位模型，然后利用牙科光敏樹脂或陶瓷材料依據掃描獲得的數據在缺損部位成型。成型后無需后期處理，減少了傳統手工塑型和后期反復修模處理步驟。
3 體內打印醫療器械
近幾十年來，植入醫療器械，如腦起搏器、心臟起搏器、神經刺激器，作為一種改善患者生理條件的裝置，在外科治療中廣泛應用，輔助維持患者的生理功能，改善了患者生活質量。但是植入醫療器械手術過程繁瑣、創傷大，有一系列開顱/開胸手術、設備植入、傷口縫合等復雜程序[10]。同時這些設備本身對患者也存在很大潛在風險，比如生物相容性。因此，需要一種新的植入醫療器械方法或者設備，以實現低成本、易操作、微創性、小型化、生物相容性好的目標。清華大學劉靜課題組[11]提出了一種利用原位3-D打印技術以微創方式直接在生物體目標組織處噴墨注射成型醫療電子器件的方法。他們首先將生物相容的封裝材料注射于體內并固化形成特定結構，然后在此區域內進一步順次注射具有導電性的液態金屬墨水、絕緣性墨水和配套的微納尺度器件等形成目標電子裝置，通過控制微注射器的進針方向、注射部位、注射量、針頭移位及速度，完成在體內目標組織處按預定形狀及功能3-D打印終端器械的目標[10-11]，實現原位微創化植入醫療器械目的。
4 展望
原位3-D打印技術是在3-D打印技術基礎上提出的一種新的外科修復重建醫療模式，具有巨大優勢和潛力，但目前該技術仍處于起步階段，實際用于臨床還存在以下問題。
①?小型化：為了減小治療過程中對患者造成的創傷，原位3-D打印修復需在有限的空間內進行，因此掃描和打印設備尺寸均不宜過大，未來需要研究新的智能材料或采用柔性驅動結構，實現設備小型化和手術方式微創性。
②?測量技術：原位3-D打印技術整合了生物制造技術和成像技術[7]，未來需要研究專用的軟件來控制不同的生物材料和細胞沉積，采用更先進的測量技術對打印位置進行測量，以獲得打印部位精確幾何形狀和成型掃描路徑。
③?滅菌環境：原位3-D打印相關器械需與人體直接接觸，因此打印材料以及手術過程中的滅菌非常重要，需要進一步完善滅菌方法來提高手術安全性[3]。
④?打印材料：日本橫濱市立大學Takebe等[12]研發了一種利用人類誘導多能干細胞培養成為肝臟的方法，該方法可用于器官修復，也可以制造器官替代物。這種新的干細胞技術可能成為原位3-D打印技術原材料制造方法，為促進該技術用于臨床奠定了基礎。
原位3-D打印技術的發展依賴于機械、材料、生物、醫療以及計算機控制等多學科交叉的推進，其在未來醫學領域中具有廣泛的應用前景。
3-D打印技術是通過分層加工、疊加成型方式制造三維實體，也稱作快速成型技術。近年來該技術發展迅速，已廣泛用于機械制造、航空航天和生物醫療等領域。在外科修復與重建方面，主要用于定制手術方案模型和個性化植入物，體外打印組織工程支架，以及直接打印生物材料與細胞的混合物制備立體人工組織，用于修復重建受損組織。但對于直接采用自體細胞進行體外3-D打印或培養形成細胞團后植入患者體內的方法，在醫療界尚存在許多爭議；同時缺損組織形態主要由術中切除范圍確定，因而術前無法進行植入物的準確設計與制造；如植入物較大時植入也對機體造成較大創傷。隨著實時測量技術和生物制造技術的發展，3-D打印技術出現了一個重要分支——原位3-D打印技術。該技術是指在手術過程中，通過對患者病變部位進行掃描，獲得缺損部位數據，同時快速采集患者細胞（如干細胞）與生物材料混合，然后利用生物3-D打印機直接在缺損部位進行定制化、形態適配化的原位3-D打印，實現人體組織的修復。由于原位3-D打印可以采用機械臂通過單孔進入腹腔內打印，實現了微創化手術，無需后處理操作，縮短手術介入時間，臨床應用潛力巨大。從理論上說，原位3-D打印技術可用于不同組織修復重建，但目前研究主要集中在真皮組織修復、小鼠顱骨缺損修復、小牛股骨和骨軟骨缺損修復。現就目前以上領域的研究進展作一綜述，總結研究現狀，展望未來發展方向。
1 真皮組織修復
在日常生活中，皮膚燒傷非常常見。大面積皮膚缺損會引起體液丟失、水電解質紊亂及低蛋白血癥、嚴重感染等，因而皮膚修復具有重要意義[1]。如果全層皮膚缺損直徑 > ?4 cm時，創面不能自行愈合。傳統治療方法是采用自體皮膚或商業皮膚移植修復，但該方法所需材料來源及尺寸有限，準備時間長，在病情嚴重情況下無法及時挽救患者生命。
2010年，美國維克森林大學再生醫學研究所制造了一臺能直接修復皮膚缺損的原位3-D打印機[2]。首先，利用生物打印機的激光掃描器對患者傷口進行掃描，并標示出需要進行皮膚移植的部位；然后，打印機一個噴墨閥噴出凝血酶，另一個噴墨閥噴出細胞、Ⅰ型膠原蛋白以及纖維蛋白原組成的混合物，通過凝血酶和纖維蛋白原相互反應形成纖維；最后打印一層角質細胞和纖維細胞，形成皮膚。通過對小鼠皮膚傷口模型打印人成纖維細胞和角質細胞進行驗證，表明直接打印兩種不同的皮膚細胞可行且細胞均成活；與未作處理的自然對照組相比，通過原位3-D打印修復的傷口愈合速度更快。
2014年，美國Microfab公司和維克森林大學再生醫學研究所合作開發出一種用于真皮修復的噴墨打印機，結合低體積高精度的噴墨系統，控制細胞、生長因子和脫細胞基質的有序沉積，形成皮膚替代物，為患者提供原位快速皮膚修復[3]。該打印機使用的打印材料為融合自體細胞，將細胞打印在皮膚缺損部位后，通過即時交聯劑霧化器或紫外光來實現水凝膠材料和細胞的交聯固化，形成皮膚替代物。
2013年，英國倫敦大學學院的Sofokleous等[4]提出一種手持多噴頭電流體噴射槍系統，利用電噴霧和靜電紡絲技術實時原位3-D打印聚合物網格，其具有類似于皮膚的細胞外基質形態和結構特征，能對患者皮膚破損部位進行原位修復。
本課題組提出了一種3-D打印技術與壓印技術相結合的原位深皮修復方法，該方法可以快速、精準的適配缺損組織形貌，形成具有微流道的組織，實現深皮修復。具體操作步驟：①用表面探測器對缺損部位進行掃描，獲取缺損部位數據；②使用一個打印頭在缺損部位打印混合有平滑肌細胞、成纖維細胞或干細胞的光敏水溶液；③用透明硅膠模具對光敏水溶液進行壓印，同時進行曝光使材料固化，獲得一層具有流道的結構；④移開模具，使用另一個打印頭在形成的流道中注射混合有血管內皮細胞的溫敏溶液，作為打印下一層結構的輔助支撐；⑤重復以上步驟，進行逐層累加，形成多層構建體；注意控制該構建體處于合適的溫度，使溫敏水溶性材料溶解，最終形成具有流道的深皮修復結構。但目前該方法仍處于研究初期，尚未進行動物實驗。
2 硬組織修復
2.1 顱骨
隨著工業的發展和高速交通工具的普及，顱腦損傷已成為一種常見病、多發病[5]。急性顱腦損傷病情危重、變化迅速，死亡率較高[6]。因此探索一種能及時顱腦損傷修復方法具有重要意義。
法國波爾多第二大學的Keriquel等[7]提出一種通過計算機輔助和醫療機器人在小鼠顱骨原位3-D打印納米羥基磷灰石修復顱骨的方法。手術過程中采用CCD相機掃描定位，計算機控制機器運動，對齊至z軸方向上，利用激光誘導移動方法（利用脈沖激光傳送打印材料到基質上）在缺損部位打印納米羥基磷灰石溶液，精確控制材料、藥量和空間結構，逐層累加，進行顱骨修復。實驗結果表明該方法修復小鼠顱骨缺損后有骨組織生成，且速度快于自體修復。
2.2 骨和骨軟骨
骨和骨軟骨損傷在運動或交通事故傷中常見，傳統組織工程修復方法是將自體或同種異體細胞培養后接種至一種組織相容性好、可降解的生物材料上，然后植入生物體內修復缺損。這一過程周期長且操作復雜，因此需要一種可以利用生物材料創建定制化植入物，加快軟骨修復進程，減少手術操作時間的一種新技術。
2010年，美國康奈爾大學的Cohen等[8]提出了一種骨和骨軟骨缺損的原位修復方法。首先用CT掃描股骨，獲得損傷部位的圖像，然后在Mimics V12軟件中重建獲得三維圖像，用計算機處理獲得制造路徑，將損傷部位裝夾固定于打印機上進行原位打印修復。軟骨缺損的打印材料是一種在打印前已發生離子交聯的藻酸鹽水凝膠，成型過程不依賴外部因素實現相變，適用于原位3-D打印。骨組織修復材料為脫鈣骨基質制劑。
近期，澳大利亞電子材料科學國家重點實驗室（ACES）提出了一種用生物筆原位修復骨組織的方法[9]。該方法通過將細胞溶于生物聚合物，如海藻酸、海藻萃取液中，手工操作生物筆將其注射在骨組織缺損部位，然后注射一層保護性凝膠，同時紫外光固化，并逐層累加，達到原位修復骨組織缺損的目的。但這種原位修復方式由于缺乏數字化控制技術的介入，不屬于真正意義上的原位3-D打印技術。
本課題組提出采用原位3-D打印技術進行牙齒修復的方法，首先利用掃描設備對牙齒缺損部位進行掃描，計算缺損部位模型，然后利用牙科光敏樹脂或陶瓷材料依據掃描獲得的數據在缺損部位成型。成型后無需后期處理，減少了傳統手工塑型和后期反復修模處理步驟。
3 體內打印醫療器械
近幾十年來，植入醫療器械，如腦起搏器、心臟起搏器、神經刺激器，作為一種改善患者生理條件的裝置，在外科治療中廣泛應用，輔助維持患者的生理功能，改善了患者生活質量。但是植入醫療器械手術過程繁瑣、創傷大，有一系列開顱/開胸手術、設備植入、傷口縫合等復雜程序[10]。同時這些設備本身對患者也存在很大潛在風險，比如生物相容性。因此，需要一種新的植入醫療器械方法或者設備，以實現低成本、易操作、微創性、小型化、生物相容性好的目標。清華大學劉靜課題組[11]提出了一種利用原位3-D打印技術以微創方式直接在生物體目標組織處噴墨注射成型醫療電子器件的方法。他們首先將生物相容的封裝材料注射于體內并固化形成特定結構，然后在此區域內進一步順次注射具有導電性的液態金屬墨水、絕緣性墨水和配套的微納尺度器件等形成目標電子裝置，通過控制微注射器的進針方向、注射部位、注射量、針頭移位及速度，完成在體內目標組織處按預定形狀及功能3-D打印終端器械的目標[10-11]，實現原位微創化植入醫療器械目的。
4 展望
原位3-D打印技術是在3-D打印技術基礎上提出的一種新的外科修復重建醫療模式，具有巨大優勢和潛力，但目前該技術仍處于起步階段，實際用于臨床還存在以下問題。
①?小型化：為了減小治療過程中對患者造成的創傷，原位3-D打印修復需在有限的空間內進行，因此掃描和打印設備尺寸均不宜過大，未來需要研究新的智能材料或采用柔性驅動結構，實現設備小型化和手術方式微創性。
②?測量技術：原位3-D打印技術整合了生物制造技術和成像技術[7]，未來需要研究專用的軟件來控制不同的生物材料和細胞沉積，采用更先進的測量技術對打印位置進行測量，以獲得打印部位精確幾何形狀和成型掃描路徑。
③?滅菌環境：原位3-D打印相關器械需與人體直接接觸，因此打印材料以及手術過程中的滅菌非常重要，需要進一步完善滅菌方法來提高手術安全性[3]。
④?打印材料：日本橫濱市立大學Takebe等[12]研發了一種利用人類誘導多能干細胞培養成為肝臟的方法，該方法可用于器官修復，也可以制造器官替代物。這種新的干細胞技術可能成為原位3-D打印技術原材料制造方法，為促進該技術用于臨床奠定了基礎。
原位3-D打印技術的發展依賴于機械、材料、生物、醫療以及計算機控制等多學科交叉的推進，其在未來醫學領域中具有廣泛的應用前景。