引用本文： 王茜, 張輝, 耿麗鑫, 李琪佳, 甘洪全, 王輝, 畢成, 王志強. MG63細胞與國產多孔鉭材料共培養后成骨相關因子的表達研究. 中國修復重建外科雜志, 2014, 28(11): 1422-1427. doi: 10.7507/1002-1892.20140306 復制
近年來，越來越多骨移植替代材料進入醫療領域，金屬材料因具有高強度、高硬度、韌性好及抗疲勞性高等優勢得到廣泛應用[1]。其中多孔鉭材料化學穩定性好，為三維立體結構，力學性能與正常骨組織相近，具備良好的生物相容性[2-5]，有利于成骨細胞黏附生長，促進骨長入[6-7]，是目前最佳的金屬假體材料。目前應用較多的是美國Zimmer公司生產的多孔鉭金屬材料，價格較昂貴，國內難以廣泛應用。為此，重慶潤澤醫療器械有限公司聯合國內多家科研機構，采用粉末澆注高溫煅燒工藝技術成功制備了多孔鉭材料。
Runt相關轉錄因子2（Runt-related transcription factor 2，Runx-2）、骨鈣素（osteocalcin，OC）是成骨相關的重要因子，纖維連接蛋白（fibronectin，FN）與細胞黏附關系密切[8-11]。本實驗將國產多孔鉭材料與人成骨樣細胞MG63細胞共培養，觀察細胞在該材料上增殖、黏附情況，以及成骨因子Runx-2、OC、FN在多孔鉭浸提液和多孔鉭支架不同培養環境下表達的變化情況，探討國產多孔鉭材料作為骨組織工程支架的可行性。
1 材料與方法
1.1 實驗材料及主要試劑、儀器
MG63細胞（中國醫學科學院基礎醫學研究所北京協和細胞資源中心）。多孔鉭材料（重慶潤澤醫療器械有限公司），外觀呈深灰色，表面光滑，表面及橫斷面可見均勻分布的蜂窩狀、針尖大小孔隙（圖 1 a）；掃描電鏡觀察示材料表面及斷面可見直徑為20～50?μm的微粒，微粒間均勻分布直徑400～600?μm的微孔結構，孔隙率65%～80%，孔隙間呈相互連通的網狀結構（圖?1 b、c）。將其制備成直徑15 mm、厚3 mm的圓柱形薄片，高壓滅菌備用。
圖1
多孔鉭材料形貌觀察???大體觀察?掃描電鏡觀察微孔結構（×200）?掃描電鏡觀察微粒大小及孔隙（×1 000）??圖 2??MG63細胞形態學觀察（倒置相差顯微鏡×100）?原代培養3 d ?第3代細胞培養3 d??圖 3??MG63細胞ALP染色鑒定（×200）??圖 4??培養各時間點A組細胞-材料復合物掃描電鏡觀察（×500）? 3 d ? 5 d ?7 d
Figure1.
Appearance of porous tantalum ?General observation ? SEM observation of the microporous structure (×200) ? SEM observation of the microscope particle and pore size (×1 000)??Fig. 2??MG63 cells morphological observation (Inverted phase contrast microscope×100) ? Primary cells at 3 days after culture ? The 3rd generation cells at 3 days after culture??Fig. 3??Alkaline phosphatase staining of MG63 cells (×200)??Fig. 4??SEM observation of cells-scaffolds in group A at different time (×500) ? At 3 days ? At 5 days ? At 7 days
MEM培養液、胰蛋白酶、EDTA、FBS（GIBCO公司，美國）；兔抗人Runx-2多克隆抗體、超敏ECL化學發光試劑盒（北京博奧森生物技術有限公司）；兔抗人OC多克隆抗體、兔抗人FN單克隆抗體（Abgent公司，美國）；PV兩步法免疫組織化學試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司）；預染蛋白Marker（天津灝洋生物制品科技有限公司）；ALP檢測試劑盒（南京建成生物制品有限公司）。倒置相差顯微鏡（Nikon公司，日本）；Leica1600硬組織切片機（Leica公司，德國）；JSM-6030LV掃描電鏡（電子株式會社，日本）；激光掃描共聚焦顯微鏡（Olympus公司，日本）；Bio-Rad?680酶標儀（Bio-Rad公司，美國）。
1.2 MG63細胞培養及鑒定
取MG63細胞復蘇后加入含10%FBS、1%青霉素和1%鏈霉素的MEM培養基培養，37℃、5%CO2及飽和濕度孵箱內靜置培養，倒置相差顯微鏡下觀察細胞生長情況。2～3 d換液1次，待細胞生長融合至80%時進行傳代。取生長狀態良好的第3代細胞，接種于預置無菌蓋玻片的12孔板內，7 d后行ALP染色鑒定。
1.3 多孔鉭浸提液制備
取高壓滅菌后的多孔鉭材料，根據GB/TISO10993-5：2009醫療器械生物學評價[12]方法制備多孔鉭浸提液，置于37℃、5%CO2及飽和濕度孵箱內72?h后備用。
1.4 實驗分組及方法
取生長狀態良好的第3代MG63細胞，生長至80%融合后，加0.25%胰蛋白酶37℃消化3 min，以離心半徑8?cm、800 r/min離心10 min，棄上清并計數。將實驗分為3組，A組為多孔鉭材料組，B組為多孔鉭浸提液組，C組為對照組。A組取高壓滅菌的多孔鉭材料，用MEM培養液浸潤24 h后置于24孔板內；取25μL細胞懸液以濃度為1?×106?個/mL滴加至多孔鉭材料表面，于37℃、5%CO2及飽和濕度孵箱內靜置2?h后，將材料翻轉，向另一面滴加相同濃度細胞懸液25?μL，相同條件靜置2 h后，將負載細胞的材料轉入一新孔中，加入1?mL MEM培養液繼續培養。于原孔中加0.25%胰蛋白酶37℃消化3?min后收集細胞，計數，計算出附著于材料上的細胞數為2×104個。B組于每孔中直接接種2?×104個MG63細胞，加多孔鉭浸提液1?mL；C組于每孔中直接接種2×104個MG63細胞，加MEM培養液1?mL。3組培養板均置于37℃、5%CO2及飽和濕度孵箱內培養，隔天換液1次，連續培養7 d。
1.5 觀測指標
1.5.1 掃描電鏡觀察
培養3、5、7 d取出A組細胞-材料復合物，PBS沖洗，2.5%戊二醛固定，梯度乙醇脫水，臨界點干燥、噴金，掃描電鏡觀察細胞在多孔鉭材料上的生長情況。
1.5.2 免疫組織化學染色觀察
培養5?d取3組細胞，常規消化傳代，取第4代細胞計數，以1×106個/mL密度接種于預置無菌蓋玻片的6孔板內；常規培養細胞至70%融合后，按照PV兩步法免疫組織化學試劑盒操作說明測定Runx-2、OC和FN的表達量。具體步驟：取出細胞爬片，PBS洗3次，每次3 min；4%多聚甲醛固定30?min；0.5%Triton X-100滴加至蓋玻片上，室溫作用20?min；3%H2O2阻斷20 min，PBS洗3次；細胞爬片分別加入兔抗人Runx-2多克隆抗體（1:100）、兔抗人OC多克隆抗體（1:100）、兔抗人FN單克隆抗體（1:200），4℃過夜；PBS洗滌，滴加二抗，室溫孵育40 min；PBS洗滌，DAB顯色，脫水透明，中性樹膠封片，光鏡下觀察。各組每個放大倍數隨機選13張圖片，采用Image Pro-Plus圖像分析軟件測定吸光度（A）值，取均值。
1.5.3 Western blot檢測
培養5 d收集3組細胞，加入細胞裂解液裂解，提取蛋白定量后，加入4?×樣本緩沖液，95℃變性5 min。取20μg樣品在SDS-PAGE上電泳，電轉至硝酸纖維素膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，分別加入兔抗人Runx-2多克隆抗體（1:100）、兔抗人OC多克隆抗體（1:100）、兔抗人FN單克隆抗體（1:200），4℃過夜，PBS洗滌3次，每次10 min；加辣根過氧化物酶標記的二抗（1:2 000），室溫孵育2?h；PBS洗滌3次，加入ECL化學發光試劑后放入暗盒中壓片并依次顯影、固定，并用其配套軟件分析實驗結果。以Runx-2、OC、FN與β-actin比值表示相應蛋白表達量。
1.6 統計學方法
采用SPSS16.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 MG63細胞形態學觀察及鑒定
倒置相差顯微鏡下觀察原代細胞接種后為透亮球形，貼壁生長并呈梭形及多角形，細胞質向外伸展形成突起；3 d后細胞快速生長體積增大，相互連結（圖 2 a）；5?d后細胞生長融合至80%～90%，細胞成片生長，細胞形態不易區分。第3代細胞形態趨于單一化，呈長梭形或多角形（圖 2 b）；ALP染色呈陽性（圖 3）。
2.2 細胞-材料復合物掃描電鏡觀察
掃描電鏡觀察示，培養3 d細胞在材料表面及孔隙內黏附生長，細胞排列較稀疏，突起少；5 d，相鄰細胞互相連接成片狀，覆蓋材料表面及孔隙內壁；7 d，細胞分泌大量細胞外基質，覆蓋大部分材料表面。見圖 4。
2.3 免疫組織化學染色觀察
各組細胞均有不同程度Runx-2、OC和FN表達，細胞質中均可見棕黃色顆粒，其中A組細胞質深染，表達較其余2組明顯。見圖 5。定量分析顯示，A組Runx-2、OC表達量顯著高于B、C組，差異有統計學意義（P < 0.05）；B、C組間差異無統計學意義（P > 0.05）。A組FN表達量高于B、C組，B組高于C組，但3組間比較差異無統計學意義（F=1.943，P=0.158）。見表 1。
圖5
培養5 d各組免疫組織化學染色觀察（×200）? A組Runx-2 ? B組Runx-2 ? C組Runx-2 ? A組OC ? B組OC ? C組OC ? A組FN ? B組FN ? C組FN
Figure5.
Immunohistochemical staining observation of 3 groups at 5 days after culture (×200) ? Runx-2 in group A ? Runx-2 in group B ? Runx-2 in group C ? OC in group A ?OC in group B ? OC in group C ? FN in group A ? FN in group B ? FN in group C
表1
免疫組織化學染色檢測培養5 d各組Runx-2、OC及FN表達量（n=13，2.4 Western blot檢測
A組Runx-2、OC蛋白表達量明顯高于B、C組，差異有統計學意義（P < 0.05）；B、C組間差異無統計學意義（P > 0.05）。3組FN蛋白表達量比較差異均無統計學意義（F=0.173，P=0.842）。見圖 6、表 2。
圖6
Western blot檢測培養5 d各組Runx-2、OC和FN蛋白表達??1：C組2：B組3：A組
Figure6.
Western blot detection for protein expressions of Runx-2, OC, and FN at 5 days after culture??1: Group C 2: Group B 3: Group A
表2
Western blot檢測培養5 d各組Runx-2、OC及FN蛋白表達量（n=11，3 討論
有文獻報道，金屬材料的三維結構有利于成骨細胞黏附、生長，可增強植入材料與骨間連接，促進骨長入；同時有利于營養物質在植入材料的運輸，促進骨再生；而且成骨細胞可沿三維多孔結構的孔隙生長，使植入物與骨間更加穩固[13-14]。本研究采用的多孔鉭材料是經粉末澆注高溫煅燒技術制備，呈三維立體結構，大體觀察多孔鉭深灰色表面上可見針尖大小蜂窩狀孔隙，孔隙率達65%～80%。掃描電鏡觀察可見多孔鉭材料表面及斷面有直徑20～50?μm的微粒，微粒間有直徑400～600μm的微孔結構，且微粒間孔隙呈相互連通的網狀結構。多孔鉭的納米微孔結構可對成骨細胞增殖起重要影響，其粗糙的表面能吸附大分子，影響細胞增殖、黏附和成骨能力。有報道鉭還可促進成骨細胞Ⅰ型膠原等的表達[15]。成骨細胞是骨形成的主要功能細胞，可經歷細胞增殖、細胞外基質成熟和礦化等階段，最終調控骨形成。細胞與支架復合培養是檢測支架材料生物相容性的最敏感方法[16]，MG63細胞是一種廣泛應用于組織工程研究的種子細胞。細胞與多孔支架復合培養后，支架的三維結構可加快營養物質交換，促進骨長入[17]。本研究中，掃描電鏡發現MG63細胞與國產多孔鉭材料共培養后，細胞隨時間延長逐步長入材料孔隙中，并分泌大量基質，細胞伸出偽足，相互連結并最終覆蓋材料表面，提示國產多孔鉭的三維立體材料有利于細胞的黏附、增殖，促進骨長入。
多孔鉭材料在骨誘導和促進骨再生方面表現優異[6, 18]，但具體機制尚不明確。Runx-2是BMP蛋白家族下游的一個重要調節因子，屬于Runx家族，是成骨細胞的特異轉錄因子，在骨再生過程中發揮重要作用，可參與多種成骨分化因子的調控[19]。Runx-2能上調成骨細胞中的相關基因使其定向分化，有研究提示Runx-2基因敲除小鼠在膜內無法成骨，表明Runx-2可影響成骨[8]。OC是成骨細胞分化和成熟的標志，能直接反映骨形成速度，在細胞外基質礦化過程中發揮重要調節作用，可通過測定OC的表達來評價成骨情況[9]。OC還可與羥基磷灰石中的Ca2+結合，吸引與骨礦化有關的相關蛋白，在骨形成和礦化中發揮重要作用[20]。FN是一種具備多種生物學性能的高分子糖蛋白，是重要的細胞黏附因子，參與成骨細胞的增殖、成骨過程，主要功能是介導細胞黏著，在細胞粘連、形態維持方面起重要作用，可誘導Ⅰ型膠原表達，并促進細胞貼壁時間和融合時間[8, 21]。
本研究采用免疫組織化學染色和Western blot法檢測各組Runx-2、OC和FN的表達情況，結果發現各組Runx-2、OC和FN均呈陽性表達。A組與B組比較，Runx-2、OC陽性細胞細胞質染色深，定量分析表達量差異有統計學意義；Western blot結果也提示A組Runx-2、OC蛋白高表達。而B組Runx-2、OC表達與C組比較差異無統計學意義，提示多孔鉭的三維結構可能通過上調節成骨特異轉錄因子Runx-2，進而影響成骨，造成OC表達升高，與前期報道一致[5]。同時，通過對FN免疫組織化學染色和Western blot結果分析，發現3組蛋白表達量呈C、B、A組依次增高的趨勢，但差異均無統計學意義。提示在本實驗條件下，可能存在FN因子的激活，但表達影響并不明顯，具體原因有待進一步研究分析。
綜上述，國產多孔鉭材料具備良好的三維立體結構，有利于成骨細胞黏附、增殖，并可影響成骨轉錄因子Runx-2、OC的表達，促進骨長入，可用作骨組織工程支架材料。但本研究缺少其他金屬材料作為陽性對照，將在下一步研究中完善。
近年來，越來越多骨移植替代材料進入醫療領域，金屬材料因具有高強度、高硬度、韌性好及抗疲勞性高等優勢得到廣泛應用[1]。其中多孔鉭材料化學穩定性好，為三維立體結構，力學性能與正常骨組織相近，具備良好的生物相容性[2-5]，有利于成骨細胞黏附生長，促進骨長入[6-7]，是目前最佳的金屬假體材料。目前應用較多的是美國Zimmer公司生產的多孔鉭金屬材料，價格較昂貴，國內難以廣泛應用。為此，重慶潤澤醫療器械有限公司聯合國內多家科研機構，采用粉末澆注高溫煅燒工藝技術成功制備了多孔鉭材料。
Runt相關轉錄因子2（Runt-related transcription factor 2，Runx-2）、骨鈣素（osteocalcin，OC）是成骨相關的重要因子，纖維連接蛋白（fibronectin，FN）與細胞黏附關系密切[8-11]。本實驗將國產多孔鉭材料與人成骨樣細胞MG63細胞共培養，觀察細胞在該材料上增殖、黏附情況，以及成骨因子Runx-2、OC、FN在多孔鉭浸提液和多孔鉭支架不同培養環境下表達的變化情況，探討國產多孔鉭材料作為骨組織工程支架的可行性。
1 材料與方法
1.1 實驗材料及主要試劑、儀器
MG63細胞（中國醫學科學院基礎醫學研究所北京協和細胞資源中心）。多孔鉭材料（重慶潤澤醫療器械有限公司），外觀呈深灰色，表面光滑，表面及橫斷面可見均勻分布的蜂窩狀、針尖大小孔隙（圖 1 a）；掃描電鏡觀察示材料表面及斷面可見直徑為20～50?μm的微粒，微粒間均勻分布直徑400～600?μm的微孔結構，孔隙率65%～80%，孔隙間呈相互連通的網狀結構（圖?1 b、c）。將其制備成直徑15 mm、厚3 mm的圓柱形薄片，高壓滅菌備用。
圖1
多孔鉭材料形貌觀察???大體觀察?掃描電鏡觀察微孔結構（×200）?掃描電鏡觀察微粒大小及孔隙（×1 000）??圖 2??MG63細胞形態學觀察（倒置相差顯微鏡×100）?原代培養3 d ?第3代細胞培養3 d??圖 3??MG63細胞ALP染色鑒定（×200）??圖 4??培養各時間點A組細胞-材料復合物掃描電鏡觀察（×500）? 3 d ? 5 d ?7 d
Figure1.
Appearance of porous tantalum ?General observation ? SEM observation of the microporous structure (×200) ? SEM observation of the microscope particle and pore size (×1 000)??Fig. 2??MG63 cells morphological observation (Inverted phase contrast microscope×100) ? Primary cells at 3 days after culture ? The 3rd generation cells at 3 days after culture??Fig. 3??Alkaline phosphatase staining of MG63 cells (×200)??Fig. 4??SEM observation of cells-scaffolds in group A at different time (×500) ? At 3 days ? At 5 days ? At 7 days
MEM培養液、胰蛋白酶、EDTA、FBS（GIBCO公司，美國）；兔抗人Runx-2多克隆抗體、超敏ECL化學發光試劑盒（北京博奧森生物技術有限公司）；兔抗人OC多克隆抗體、兔抗人FN單克隆抗體（Abgent公司，美國）；PV兩步法免疫組織化學試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司）；預染蛋白Marker（天津灝洋生物制品科技有限公司）；ALP檢測試劑盒（南京建成生物制品有限公司）。倒置相差顯微鏡（Nikon公司，日本）；Leica1600硬組織切片機（Leica公司，德國）；JSM-6030LV掃描電鏡（電子株式會社，日本）；激光掃描共聚焦顯微鏡（Olympus公司，日本）；Bio-Rad?680酶標儀（Bio-Rad公司，美國）。
1.2 MG63細胞培養及鑒定
取MG63細胞復蘇后加入含10%FBS、1%青霉素和1%鏈霉素的MEM培養基培養，37℃、5%CO2及飽和濕度孵箱內靜置培養，倒置相差顯微鏡下觀察細胞生長情況。2～3 d換液1次，待細胞生長融合至80%時進行傳代。取生長狀態良好的第3代細胞，接種于預置無菌蓋玻片的12孔板內，7 d后行ALP染色鑒定。
1.3 多孔鉭浸提液制備
取高壓滅菌后的多孔鉭材料，根據GB/TISO10993-5：2009醫療器械生物學評價[12]方法制備多孔鉭浸提液，置于37℃、5%CO2及飽和濕度孵箱內72?h后備用。
1.4 實驗分組及方法
取生長狀態良好的第3代MG63細胞，生長至80%融合后，加0.25%胰蛋白酶37℃消化3 min，以離心半徑8?cm、800 r/min離心10 min，棄上清并計數。將實驗分為3組，A組為多孔鉭材料組，B組為多孔鉭浸提液組，C組為對照組。A組取高壓滅菌的多孔鉭材料，用MEM培養液浸潤24 h后置于24孔板內；取25μL細胞懸液以濃度為1?×106?個/mL滴加至多孔鉭材料表面，于37℃、5%CO2及飽和濕度孵箱內靜置2?h后，將材料翻轉，向另一面滴加相同濃度細胞懸液25?μL，相同條件靜置2 h后，將負載細胞的材料轉入一新孔中，加入1?mL MEM培養液繼續培養。于原孔中加0.25%胰蛋白酶37℃消化3?min后收集細胞，計數，計算出附著于材料上的細胞數為2×104個。B組于每孔中直接接種2?×104個MG63細胞，加多孔鉭浸提液1?mL；C組于每孔中直接接種2×104個MG63細胞，加MEM培養液1?mL。3組培養板均置于37℃、5%CO2及飽和濕度孵箱內培養，隔天換液1次，連續培養7 d。
1.5 觀測指標
1.5.1 掃描電鏡觀察
培養3、5、7 d取出A組細胞-材料復合物，PBS沖洗，2.5%戊二醛固定，梯度乙醇脫水，臨界點干燥、噴金，掃描電鏡觀察細胞在多孔鉭材料上的生長情況。
1.5.2 免疫組織化學染色觀察
培養5?d取3組細胞，常規消化傳代，取第4代細胞計數，以1×106個/mL密度接種于預置無菌蓋玻片的6孔板內；常規培養細胞至70%融合后，按照PV兩步法免疫組織化學試劑盒操作說明測定Runx-2、OC和FN的表達量。具體步驟：取出細胞爬片，PBS洗3次，每次3 min；4%多聚甲醛固定30?min；0.5%Triton X-100滴加至蓋玻片上，室溫作用20?min；3%H2O2阻斷20 min，PBS洗3次；細胞爬片分別加入兔抗人Runx-2多克隆抗體（1:100）、兔抗人OC多克隆抗體（1:100）、兔抗人FN單克隆抗體（1:200），4℃過夜；PBS洗滌，滴加二抗，室溫孵育40 min；PBS洗滌，DAB顯色，脫水透明，中性樹膠封片，光鏡下觀察。各組每個放大倍數隨機選13張圖片，采用Image Pro-Plus圖像分析軟件測定吸光度（A）值，取均值。
1.5.3 Western blot檢測
培養5 d收集3組細胞，加入細胞裂解液裂解，提取蛋白定量后，加入4?×樣本緩沖液，95℃變性5 min。取20μg樣品在SDS-PAGE上電泳，電轉至硝酸纖維素膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，分別加入兔抗人Runx-2多克隆抗體（1:100）、兔抗人OC多克隆抗體（1:100）、兔抗人FN單克隆抗體（1:200），4℃過夜，PBS洗滌3次，每次10 min；加辣根過氧化物酶標記的二抗（1:2 000），室溫孵育2?h；PBS洗滌3次，加入ECL化學發光試劑后放入暗盒中壓片并依次顯影、固定，并用其配套軟件分析實驗結果。以Runx-2、OC、FN與β-actin比值表示相應蛋白表達量。
1.6 統計學方法
采用SPSS16.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 MG63細胞形態學觀察及鑒定
倒置相差顯微鏡下觀察原代細胞接種后為透亮球形，貼壁生長并呈梭形及多角形，細胞質向外伸展形成突起；3 d后細胞快速生長體積增大，相互連結（圖 2 a）；5?d后細胞生長融合至80%～90%，細胞成片生長，細胞形態不易區分。第3代細胞形態趨于單一化，呈長梭形或多角形（圖 2 b）；ALP染色呈陽性（圖 3）。
2.2 細胞-材料復合物掃描電鏡觀察
掃描電鏡觀察示，培養3 d細胞在材料表面及孔隙內黏附生長，細胞排列較稀疏，突起少；5 d，相鄰細胞互相連接成片狀，覆蓋材料表面及孔隙內壁；7 d，細胞分泌大量細胞外基質，覆蓋大部分材料表面。見圖 4。
2.3 免疫組織化學染色觀察
各組細胞均有不同程度Runx-2、OC和FN表達，細胞質中均可見棕黃色顆粒，其中A組細胞質深染，表達較其余2組明顯。見圖 5。定量分析顯示，A組Runx-2、OC表達量顯著高于B、C組，差異有統計學意義（P < 0.05）；B、C組間差異無統計學意義（P > 0.05）。A組FN表達量高于B、C組，B組高于C組，但3組間比較差異無統計學意義（F=1.943，P=0.158）。見表 1。
圖5
培養5 d各組免疫組織化學染色觀察（×200）? A組Runx-2 ? B組Runx-2 ? C組Runx-2 ? A組OC ? B組OC ? C組OC ? A組FN ? B組FN ? C組FN
Figure5.
Immunohistochemical staining observation of 3 groups at 5 days after culture (×200) ? Runx-2 in group A ? Runx-2 in group B ? Runx-2 in group C ? OC in group A ?OC in group B ? OC in group C ? FN in group A ? FN in group B ? FN in group C
表1
免疫組織化學染色檢測培養5 d各組Runx-2、OC及FN表達量（n=13，2.4 Western blot檢測
A組Runx-2、OC蛋白表達量明顯高于B、C組，差異有統計學意義（P < 0.05）；B、C組間差異無統計學意義（P > 0.05）。3組FN蛋白表達量比較差異均無統計學意義（F=0.173，P=0.842）。見圖 6、表 2。
圖6
Western blot檢測培養5 d各組Runx-2、OC和FN蛋白表達??1：C組2：B組3：A組
Figure6.
Western blot detection for protein expressions of Runx-2, OC, and FN at 5 days after culture??1: Group C 2: Group B 3: Group A
表2
Western blot檢測培養5 d各組Runx-2、OC及FN蛋白表達量（n=11，3 討論
有文獻報道，金屬材料的三維結構有利于成骨細胞黏附、生長，可增強植入材料與骨間連接，促進骨長入；同時有利于營養物質在植入材料的運輸，促進骨再生；而且成骨細胞可沿三維多孔結構的孔隙生長，使植入物與骨間更加穩固[13-14]。本研究采用的多孔鉭材料是經粉末澆注高溫煅燒技術制備，呈三維立體結構，大體觀察多孔鉭深灰色表面上可見針尖大小蜂窩狀孔隙，孔隙率達65%～80%。掃描電鏡觀察可見多孔鉭材料表面及斷面有直徑20～50?μm的微粒，微粒間有直徑400～600μm的微孔結構，且微粒間孔隙呈相互連通的網狀結構。多孔鉭的納米微孔結構可對成骨細胞增殖起重要影響，其粗糙的表面能吸附大分子，影響細胞增殖、黏附和成骨能力。有報道鉭還可促進成骨細胞Ⅰ型膠原等的表達[15]。成骨細胞是骨形成的主要功能細胞，可經歷細胞增殖、細胞外基質成熟和礦化等階段，最終調控骨形成。細胞與支架復合培養是檢測支架材料生物相容性的最敏感方法[16]，MG63細胞是一種廣泛應用于組織工程研究的種子細胞。細胞與多孔支架復合培養后，支架的三維結構可加快營養物質交換，促進骨長入[17]。本研究中，掃描電鏡發現MG63細胞與國產多孔鉭材料共培養后，細胞隨時間延長逐步長入材料孔隙中，并分泌大量基質，細胞伸出偽足，相互連結并最終覆蓋材料表面，提示國產多孔鉭的三維立體材料有利于細胞的黏附、增殖，促進骨長入。
多孔鉭材料在骨誘導和促進骨再生方面表現優異[6, 18]，但具體機制尚不明確。Runx-2是BMP蛋白家族下游的一個重要調節因子，屬于Runx家族，是成骨細胞的特異轉錄因子，在骨再生過程中發揮重要作用，可參與多種成骨分化因子的調控[19]。Runx-2能上調成骨細胞中的相關基因使其定向分化，有研究提示Runx-2基因敲除小鼠在膜內無法成骨，表明Runx-2可影響成骨[8]。OC是成骨細胞分化和成熟的標志，能直接反映骨形成速度，在細胞外基質礦化過程中發揮重要調節作用，可通過測定OC的表達來評價成骨情況[9]。OC還可與羥基磷灰石中的Ca2+結合，吸引與骨礦化有關的相關蛋白，在骨形成和礦化中發揮重要作用[20]。FN是一種具備多種生物學性能的高分子糖蛋白，是重要的細胞黏附因子，參與成骨細胞的增殖、成骨過程，主要功能是介導細胞黏著，在細胞粘連、形態維持方面起重要作用，可誘導Ⅰ型膠原表達，并促進細胞貼壁時間和融合時間[8, 21]。
本研究采用免疫組織化學染色和Western blot法檢測各組Runx-2、OC和FN的表達情況，結果發現各組Runx-2、OC和FN均呈陽性表達。A組與B組比較，Runx-2、OC陽性細胞細胞質染色深，定量分析表達量差異有統計學意義；Western blot結果也提示A組Runx-2、OC蛋白高表達。而B組Runx-2、OC表達與C組比較差異無統計學意義，提示多孔鉭的三維結構可能通過上調節成骨特異轉錄因子Runx-2，進而影響成骨，造成OC表達升高，與前期報道一致[5]。同時，通過對FN免疫組織化學染色和Western blot結果分析，發現3組蛋白表達量呈C、B、A組依次增高的趨勢，但差異均無統計學意義。提示在本實驗條件下，可能存在FN因子的激活，但表達影響并不明顯，具體原因有待進一步研究分析。
綜上述，國產多孔鉭材料具備良好的三維立體結構，有利于成骨細胞黏附、增殖，并可影響成骨轉錄因子Runx-2、OC的表達，促進骨長入，可用作骨組織工程支架材料。但本研究缺少其他金屬材料作為陽性對照，將在下一步研究中完善。
