引用本文： 蒲磊, 吳劍, 孟明耀, 倪海燕, 葉飛, 李亞雄, 蔣立虹. 不同脫細胞方案制備主動脈細胞外基質支架的比較研究. 中國修復重建外科雜志, 2014, 28(11): 1413-1421. doi: 10.7507/1002-1892.20140305 復制
目前，采用戊二醛固定異種血管和高分子聚合物（滌綸、膨體聚四氟乙烯）方法人工構建的心外管道移植物已成功用于復雜先天性心臟病的外科治療，如改良Fonton術、Rastelli術等，并取得良好效果，但仍存在血管直徑錯配、內膜增生、血栓形成、鈣鹽沉積、順應性不佳、缺乏生長和重塑潛能等問題[1-3]，再次手術干預率高[4]。應用組織工程技術構建具備生物活性的組織工程大直徑血管，有望克服現有心外管道移植物缺陷[5-6]。組織工程血管研究主要包括支架材料、種子細胞、體外細胞種植、生物信號分子和體內重塑等方面，其中支架材料是構建組織工程大直徑血管的先決條件[3, 7]。理想的支架材料應具備適宜的生物降解性和力學性能、免疫原性低、良好的生物相容性。豬與人的基因同源性相對較近，且豬主動脈來源廣泛，經脫細胞制備的細胞外基質支架具有適宜的力學性能和尺寸[8-9]，含有各種蛋白系列和細胞因子，能為種子細胞黏附及增殖提供理想的生理微環境[10]，成為組織工程大直徑血管支架的研究熱點。
脫細胞是獲得異種細胞外基質支架的重要方法，理想脫細胞方法要求在完全去除細胞基礎上，完整保留細胞外基質，并保持支架良好的生物力學性能和適宜的生物相容性。常見的脫細胞試劑包括胰蛋白酶、Triton X-100、脫氧膽酸鈉、SDS等[10-11]；本研究通過比較5種常用脫細胞方案的脫細胞效率、脫細胞導致的細胞外基質破壞和生物機械力學性能變化，建立SD大鼠腹壁植入模型評估支架的免疫原性和組織相容性差異，為下一步主動脈脫細胞方法的選擇及組織工程血管的構建提供依據。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
40日齡雄性SD大鼠90只，體重（100±10）g，購自昆明醫科大學動物實驗中心。市售豬升主動脈30根，每根長6 cm，直徑（1.5±0.2）cm。
2.5%胰蛋白酶、0.02%EDTA、Triton X-100（MP公司，美國）；脫氧膽酸鈉、SDS（Adamas公司，瑞士）；DNA酶Ⅰ、頭孢唑林鈉、兩性霉素B、環丙沙星、慶大霉素（Sigma公司，美國）；1%青霉素-鏈霉素（BI公司，以色列）；鼠抗豬Ⅰ型膠原單克隆抗體（1:400；Abcam公司，英國）；鼠抗豬彈性蛋白單克隆抗體（1:50；Thermo公司，美國）；辣根過氧化物酶標記兔抗鼠二抗（Dako公司，丹麥）；AxyPrep基因組DNA提取試劑盒（Axgen公司，美國）。恒溫搖床（Thermo公司，美國）；光鏡（Nikon公司，日本）；分光光度計（Eppendorf公司，德國）；掃描電鏡（Hitachi公司，日本）；電子萬能材料試驗機（深圳瑞格爾儀器有限公司）。
1.2 實驗分組及方法
取豬升主動脈PBS沖洗后，置于50 mL離心管，熱缺血時間 < 30 min；離心管中加入30?mL含200?mg/ L頭孢唑林鈉、250 mg/L兩性霉素B、3?mg/L環丙沙星、120 mg/L慶大霉素的PBS溶液，冰上轉運至實驗室，隨機分成6組（n=5）。對照組（F組）不行脫細胞處理，置于4℃冰箱保存；A～E組應用蒸餾水進行破細胞處理12 h后，分別應用5種方案進行脫細胞處理，脫細胞過程樣本均置于恒溫搖床內（37℃、200?r/ min），脫細胞溶液體積為150?mL/根。A組：0.1%胰蛋白酶[12-13]/0.02%EDTA/PBS（pH7.3）；B組：1%Triton X-100/0.02%EDTA[8, 14]/蒸餾水（pH7.3）；C組：1%脫氧膽酸鈉[15-16]/蒸餾水（pH7.3）；D組：0.5%脫氧膽酸鈉/0.5%SDS[17-?18]/蒸餾水（pH7.3）；E組：1%脫氧膽酸[19-20]/蒸餾水（pH7.3）。脫細胞72 h，每24小時換液，最后24 h加入17 U/mL脫氧核糖核酸酶[21]。
1.3 觀測指標
1.3.1 大體及HE染色觀察
脫細胞處理后，大體觀察各組樣本。然后沿血管長軸切開，取部分樣本以10%中性甲醛PBS溶液（pH7.2）室溫固定24 h，脫水、透明，常規石蠟包埋，切片（片厚4?μm）。常規行HE染色，鏡下觀察脫細胞情況及組織結構形態。
1.3.2 DNA定量分析
各組分別取—?80℃凍存樣本25?mg（n=5），應用AxyPrep基因組DNA提取試劑盒，按操作流程提取樣本DNA。應用分光光度計于260?nm波長處對DNA進行定量分析。
1.3.3 免疫組織化學染色觀察
采用Envision兩步法行免疫組織化學染色。取各組石蠟包埋樣本（n=5），切片，撈片、烤干、脫蠟后，應用煮沸法抗原修復，血清封閉后加一抗（Ⅰ型膠原、彈性蛋白），室溫孵育1 h，加二抗，DAB顯色，蘇木素復染，脫水后封片，光鏡下觀察。于400倍鏡下，應用光鏡自帶圖像分析軟件NIS-Elements BR3.22.64對免疫組織化學陽性表達進行半定量分析，抗原表達量=陰性對照組灰度值－實驗組灰度值。
1.3.4 掃描電鏡觀察
取各組樣本（n=5），以2.5%戊二醛PBS溶液（pH7.3）室溫固定48 h，PBS洗滌3次，每次30 min；1%鵝脫氧膽酸溶液后固定2 h，PBS洗滌3次，每次30 min；梯度乙醇脫水，40℃叔丁醇滲透處理2 h，—?20℃冰箱冷凍干燥后電鍍濺射噴金，掃描電鏡觀察樣本內膜表面結構和多孔結構。
1.3.5 生物力學測定
取各組樣本（n=5）沿血管壁長軸方向剪成矩形（2 cm×1 cm），應用電子萬能材料試驗機進行生物力學測定，拉伸速度為20 mm/min，以試驗機自帶的RDSC-6000控制系統軟件記錄樣本抗張強度、最大應力、斷裂伸長率。
1.4 大鼠腹壁肌間植入相關檢測
1.4.1 大鼠腹壁肌間植入方法
90只SD大鼠隨機分為6組，每組15只。于大腿肌肉注射3%戊巴比妥鈉（0.12?mL/100 g）麻醉，仰臥位固定，切開右側腹部皮膚，鈍性分離腹直肌與腹外斜肌，獲得約1.4?cm?×1.4?cm竇道，分別埋植A～F組大小為1.0?cm?×1.0?cm的樣本。術后背部注射1%青霉素-鏈霉素雙抗（2?mL/100 g）。
1.4.2 大體及HE染色觀察
術后密切觀察切口愈合狀況。7、14、28 d各組隨機取5只大鼠，同上法麻醉后沿原切口切開皮膚，肉眼觀察植入物情況。隨后采用空氣栓塞法處死大鼠，沿植入物周邊2?mm剪下腹壁全層標本，10%中性甲醛固定，常規HE染色，光鏡下分別觀察反應區（腹壁肌肉與植入物交界處）及中間區（植入物中央區域）情況。由2名病理科醫師對同一樣本反應區隨機選擇2個高倍視野（×?400），對中性粒細胞、淋巴細胞、巨噬細胞浸潤及血管生成情況進行半定量計數分析，取均值。
1.5 統計學方法
采用SPSS17.0統計軟件進行分析。計量資料以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 大體及HE染色觀察
經脫細胞處理后，A～E組升主動脈支架均呈白色，具備正常血管形態。HE染色示，F組可見細胞均勻分布于血管內膜、中膜和外膜側；A、D組完全去除細胞成分，細胞外基質纖維排列整齊、完整；B、C、E組細胞成分較F組減少，但尚未完全去除細胞，細胞外基質纖維完整性良好、排列整齊，其中C組內膜側細胞成分減少明顯。見圖 1。
圖1
各組樣本內膜側HE染色觀察（×100）???A組?B組?C組?D組?E組?F組??圖 2??各組Ⅰ型膠原免疫組織化學染色觀察（×400）? A組?B組?C組?D組?E組?F組
Figure1.
HE staining observation of intimal side of each group (×100)?? ?Group A ?Group B ?Group C ?Group D ?Group E? Group F??Fig. 2??Immunohistochemical staining observation of collagen typeⅠin each group (×400) ?Group A ?Group B ?Group C ?Group D ?Group E ?Group F
2.2 DNA定量分析
A、D組DNA含量顯著低于其他組，差異有統計學意義（P < 0.05），A、D組間差異無統計學意義（P > 0.05）；B、C、E組DNA含量明顯低于F組，差異有統計學意義（P < 0.05）；B、C、E組間差異亦有統計學意義（P < 0.05）。見表 1。
表1
各組樣本相關檢測指標比較（n=5，2.3 免疫組織化學染色觀察
各組均見Ⅰ型膠原和彈性蛋白陽性表達，其中A組Ⅰ型膠原表達明顯弱于其余各組，B、C、D、E組Ⅰ型膠原表達接近F組；各組彈性蛋白表達未見明顯差異。見圖 2、3。
圖3
各組彈性蛋白免疫組織化學染色觀察??（×400）? A組?B組?C組? D組?E組?F組??圖 4??各組掃描電鏡觀察（×500）?A組?B組?C組?D組?E組? F組
Figure3.
Immunohistochemical staining observation of elastin in each group (×400)?? ?Group A ?Group B ?Group C ?Group D ?Group E ?Group F??Fig. 4??Scanning electron microscope observation of each group (×500) ?Group A ?Group B ?Group C ?Group D ?Group E ?Group F
半定量抗原表達分析顯示，A組Ⅰ型膠原表達量顯著低于其余各組，差異有統計學意義（P < 0.05）；D組顯著低于B、C、E、F組，差異亦有統計學意義（P < 0.05）；其余組間比較差異無統計學意義（P > 0.05）。各組間彈性蛋白表達量比較差異均無統計學意義（P > 0.05）。見表 1。
2.4 掃描電鏡觀察
掃描電鏡觀察示，F組表面可見緊密連接的內皮細胞，呈鵝卵石樣；A組可見松散排列的細胞外基質纖維，局部纖維斷裂，基底膜結構破壞嚴重；C、D組基底膜完整，C組多孔結構較D組多；B、E組基底膜完整，未見明顯孔隙結構，基底膜上可見散在分布的細胞膜樣結構。見圖 4。
2.5 生物力學測定
A組最大應力和抗張強度顯著低于其余各組，B組顯著高于其余各組，差異均有統計學意義（P < 0.05）；C、D、E、F組間差異無統計學意義（P > 0.05）。A組斷裂伸長率顯著高于其余各組，B組顯著低于其余各組，差異均有統計學意義（P < 0.05）；C、D、E、F組間差異無統計學意義（P > 0.05）。見表 1。
2.6 大鼠腹壁肌間植入相關檢測
2.6.1 大體觀察
術后大鼠均成活，切口愈合良好，生長狀況良好。術后7 d，各組植入物均明顯突出于腹壁，切開皮膚可見植入物局部明顯突出；14 d，各組植入物仍突出于腹壁，切開皮膚可見局部稍突出；28 d，各組植入物局部未見突出，但能觸及，切開皮膚未見局部突出，植入物較前明顯變薄。
2.6.2 HE染色
術后7、14、28 d，各組均可見大量淋巴細胞及少量巨噬細胞、中性粒細胞浸潤，并有較多血管新生。術后7 d，A、D組鄰近反應區部位植入物結構相對完整；B、C、E、F組植入物結構變模糊，反應區范圍較A、D組廣；各組中間區植入物組織形態未見明顯變化。見圖 5。術后14、28 d，A、B、C、E、F組反應區范圍廣，反應區邊緣植入物結構模糊；D組反應區范圍相對其他各組窄，反應區邊緣植入物結構相對完整。B、C、E、F組原有細胞成分隨時間延長逐漸減少，28?d時僅植入物中間區可見細胞核成分；A、D組中間區局部見細胞浸潤。見圖 6。
圖5
術后7 d各組植入物反應區HE染色觀察（×100）???A組?B組?C組?D組?E組?F組??圖 6??術后28 d各組植入物中間區HE染色觀察（×100）???A組?B組?C組?D組?E組?F組
Figure5.
HE staining observation of graft reaction?zone in each group at 7 days after implantation (×100)? ?Group A ?Group B ?Group C ?Group D ?Group E ?Group F??Fig. 6?? HE staining observation of graft intermediate?zone in each group at 28 days after implantation (×100)? ?Group A ?Group B ?Group C ?Group D ?Group E ?Group F
半定量計數顯示，術后7 d，C、D組淋巴細胞和中性粒細胞數明顯低于A、B、E、F組，差異有統計學意義（P < 0.05）；D組淋巴細胞數低于C組，差異有統計學意義（P < 0.05），但兩組中性粒細胞數比較差異無統計學意義（P > 0.05）。F組淋巴細胞數低于E組，差異有統計學意義（P < 0.05），但與A、B組比較差異無統計學意義（P > 0.05）；F組中性粒細胞浸潤顯著高于A、B、E組，差異有統計學意義（P < 0.05）；A、B、E組間淋巴細胞和中性粒細胞數比較，差異均無統計學意義（P > 0.05）。D組巨噬細胞數明顯低于其余5組，差異有統計學意義（P < 0.05）；其余5組間差異無統計學意義（P > 0.05）。各組新生血管數比較，差異均無統計學意義（F=1.705，P=0.172）。
術后14 d，D組淋巴細胞數明顯低于其余5組，E組明顯高于其余各組，差異有統計學意義（P < 0.05）；A、B、C、F組間比較差異無統計學意義（P > 0.05）。F組中性粒細胞數明顯高于其余5組，差異有統計學意義（P < 0.05）；其余各組間比較差異無統計學意義（P > 0.05）。F組巨噬細胞數明顯高于B、C、D、E組，差異有統計學意義（P < 0.05）；F組與A組比較差異無統計學意義（P > 0.05）；A、B、C、D、E組間比較差異亦無統計學意義（P > 0.05）。A組新生血管數與其余各組比較，差異均無統計學意義（P > 0.05）；B組明顯低于D、E、F組，差異有統計學意義（P < 0.05），與C組比較差異無統計學意義（P > 0.05）；C組明顯低于F組，差異有統計學意義（P < 0.05），與D、E組差異無統計學意義（P > 0.05）；D、E、F組間比較，差異均無統計學意義（P > 0.05）。
術后28 d，D組淋巴細胞數顯著低于其余5組，B組顯著低于A、C、E、F組，差異均有統計學意義（P < 0.05）；A、C、E、F組間差異無統計學意義（P > 0.05）。A、F組中性粒細胞數顯著高于B、C、D、E組，差異有統計學意義（P < 0.05），A、F組間差異有統計學意義（P < 0.05）；B、C、D、E組間差異無統計學意義（P > 0.05）。A、E組巨噬細胞數顯著高于B、D、F組，差異有統計學意義（P < 0.05），A、E組間及B、D、F組間差異均無統計學意義（P > 0.05）；C組顯著高于D組，差異有統計學意義（P < 0.05）；C組與A、B、E、F組間差異均無統計學意義（P > 0.05）。各組新生血管數比較，差異均無統計學意義（F=2.530，P=0.056）。見表 2。
表2
各組各時間點淋巴細胞、中性粒細胞、巨噬細胞浸潤和血管生成檢測（n=5，個/視野，3 討論
組織工程血管構建中，支架是細胞黏附的平臺和誘導目標組織再生的基礎，它需要具備與靶血管相似的三維解剖結構、生物力學性能，良好的生物相容性和低免疫原性[10, 22]。目前，用于組織工程研究的支架材料可分為聚合物支架和生物支架兩類。聚合物支架材料來源廣泛、易于加工，但組織相容性欠佳，不能完全模擬天然血管的細胞外基質結構；可降解聚合物支架的在體重塑過程易導致生物力學性能下降，不能滿足血流動力學要求。隨著對異種細胞外基質和免疫學研究的深入，異種脫細胞血管支架因具備天然的三維立體結構、良好的生物相容性、生物力學性能與人體血管相近等特性日益受到重視。對于細胞外基質支架而言，脫細胞有效性決定了支架的免疫原性、生物相容性和應用潛能，不同脫細胞方法均會破壞細胞外基質結構，改變生物力學性能；同時，支架的表面結構也會影響種子細胞的生物學功能。因此，選用不同脫細胞試劑，對其脫細胞有效性、主要細胞外基質蛋白破壞、生物力學性能改變和生物相容性進行研究，優化脫細胞方案，獲得理想支架用于構建組織工程大直徑血管具有重要意義。
本研究中，我們在低滲預處理條件下，分別采用胰蛋白酶/EDTA、Triton X-100/EDTA、脫氧膽酸鈉、脫氧膽酸鈉/SDS、脫氧膽酸制備豬升主動脈脫細胞支架，以求獲得最適宜的主動脈細胞外基質支架。獲得脫細胞支架的前提條件是有效去除細胞成分，本研究選用的脫細胞試劑中，胰蛋白酶常用于細胞培養過程，它通過分離蛋白連接達到脫細胞效果；去垢劑（Triton X-100、脫氧膽酸鈉、SDS、脫氧膽酸）能與細胞膜的脂質雙分子層整合，破壞并溶解細胞膜結構[23]；EDTA屬于基質金屬蛋白酶抑制劑類防腐劑，能減少蛋白酶對細胞外基質的溶解和破壞，還能降低細胞間聯合的穩定性，增強脫細胞效率。5種脫細胞方法中，A、D組能有效去除細胞；C組能去除內皮細胞和部分動脈基質間細胞；B、E組能去除大部分內皮細胞，但不能去除動脈基質間細胞成分；掃描電鏡觀察示B、E組基底膜上有細胞膜樣結構殘留，進一步說明這兩種方法的主動脈脫細胞效率有限。
細胞外基質蛋白可維持生物機械力學性能，不定形細胞外基質內含有一些信號分子影響種子細胞的黏附、增殖和遷移；不同脫細胞方法具有不同程度侵襲性，可能導致細胞外基質蛋白和不定形細胞外基質成分破壞。本研究中，免疫組織化學染色觀察示，A組脫細胞方法引起Ⅰ型膠原破壞，但未引起彈性蛋白破壞；掃描電鏡觀察示A組主動脈支架基底膜破壞、細胞基質纖維暴露、局部可見基質纖維斷裂；生物力學測定示，A組主動脈支架的抗拉強度和最大應力下降，斷裂伸長率增大。結果表明，A組胰蛋白酶的侵襲力強，破壞細胞外基質并嚴重影響生物力學性能。既往應用胰蛋白酶對肺動脈去細胞支架的研究也獲得相似結果[21]。B、C、D、E組的免疫組織化學染色結果顯示主要細胞外基質蛋白破壞不明顯，掃描電鏡示基底膜結構完整，局部區域可見一些多孔結構；此外，C、D、E組的生物力學性能與F組相近。這些結果表明，基于胰蛋白酶的脫細胞方案侵襲性強，有效脫細胞的同時導致Ⅰ型膠原和基底膜破壞、細胞外基質纖維暴露，同時引起豬主動脈支架材料的最大應力和抗張強度下降，彈性增強。C、D、E組脫細胞處理后，主要細胞外基質蛋白組成和生物力學性能無明顯改變。另外，B組脫細胞豬主動脈支架的抗拉強度和最大應力明顯增加，但斷裂伸長率下降，說明B組方法對支架具有一定固定作用，但需要進一步深入研究。
異種細胞外基質支架的免疫原性和組織相容性一直是困擾研究者的難題。目前，有關異種抗原和決定異種支架組織相容性的機制尚未完全闡明。細胞膜和細胞核成分是引起異種免疫反應的關鍵因素，研究表明，異種抗原主要表達于細胞膜，如α-1，3半乳糖異種抗原主要表達于內皮細胞表面[24]。臨床心臟瓣膜病變患者行生物瓣置換后，鈣化是常見并發癥，對再次手術取出的生物瓣行組織學觀察發現鈣鹽主要沉著于細胞核部位，可能機制為戊二醛處理異種組織不能完全消除異種抗原[25]；生物瓣置換后，再次手術干預率隨年齡增加而降低，組織工程瓣膜應用于兒科患者更易出現功能障礙[26]，這說明受體免疫活性、移植物免疫原性和移植物組織相容性是決定目標移植物行使功能和適應性重塑的關鍵。因此，本研究選用生長發育期SD大鼠，構建腹壁肌間植入模型以評估各脫細胞支架的免疫原性和組織相容性。本研究中，各組支架植入SD大鼠體內后，B、C、E、F組原有細胞成分逐漸減少，證實了異種細胞膜和細胞核引起超急性、急性免疫排除的觀點，也表明細胞外基質具有免疫惰性和重建能力。7、14、28?d，D組反應區內的淋巴細胞數顯著低于其余各組，14、28?d時D組中性粒細胞數亦低于其余各組，表明D組支架的免疫原性和組織相容性優于其余各組。A組雖能有效去除細胞，但該組主動脈支架移植物反應區內仍可見大量淋巴細胞和較多中性粒細胞浸潤，可能與基底膜嚴重破壞、細胞外基質纖維暴露、纖維疏松共同導致較多抗原暴露，引發較強的免疫反應有關，還需要進一步研究證實。
植入物體內重塑成熟過程決定移植物應用。研究表明，巨噬細胞可極化為M1型和M2型，其中M1型為促炎性反應表型，促進植入物降解；M2型為抗炎性反應表型，促進植入物重塑、組織修復[27-28]。本研究中，有效脫細胞的A、D組和未完全脫細胞的B、C、E、F組反應區內巨噬細胞數并未呈現出一定規律，未能有效反映植入物的免疫原性，可能與巨噬細胞極化相關。隨后，我們將對巨噬細胞表型變化及其相應分子機制進行研究。血管新生與炎性反應強弱和植入物重塑密切相關。本研究中，各組新生血管數未見明顯差異，D組脫細胞支架移植后免疫原性顯著低于其余各組，但其小血管生成、可降解性能與其他移植物未見明顯差異，進一步說明D組方案脫細胞處理后獲得的主動脈支架具備構建組織工程大直徑血管的潛力。
綜上述，我們認為采用0.5%脫氧膽酸鈉/0.5% SDS/蒸餾水方法具有以下優點：①有效去除細胞成分的同時保存天然的基底膜和細胞外基質纖維，并獲得一定數量多孔結構，理論上能為種子細胞黏附、增殖和遷移提供更適宜的微環境；②獲得的支架生物力學性能與天然動脈相似，有利于組織工程血管植入行使正常生理功能；③該方案獲得的支架免疫原性明顯低于其他方案，組織相容性優于其他4種方案。但本研究未對支架的細胞相容性和動物體內生理功能進行相應評估，有待進一步研究完善。
目前，采用戊二醛固定異種血管和高分子聚合物（滌綸、膨體聚四氟乙烯）方法人工構建的心外管道移植物已成功用于復雜先天性心臟病的外科治療，如改良Fonton術、Rastelli術等，并取得良好效果，但仍存在血管直徑錯配、內膜增生、血栓形成、鈣鹽沉積、順應性不佳、缺乏生長和重塑潛能等問題[1-3]，再次手術干預率高[4]。應用組織工程技術構建具備生物活性的組織工程大直徑血管，有望克服現有心外管道移植物缺陷[5-6]。組織工程血管研究主要包括支架材料、種子細胞、體外細胞種植、生物信號分子和體內重塑等方面，其中支架材料是構建組織工程大直徑血管的先決條件[3, 7]。理想的支架材料應具備適宜的生物降解性和力學性能、免疫原性低、良好的生物相容性。豬與人的基因同源性相對較近，且豬主動脈來源廣泛，經脫細胞制備的細胞外基質支架具有適宜的力學性能和尺寸[8-9]，含有各種蛋白系列和細胞因子，能為種子細胞黏附及增殖提供理想的生理微環境[10]，成為組織工程大直徑血管支架的研究熱點。
脫細胞是獲得異種細胞外基質支架的重要方法，理想脫細胞方法要求在完全去除細胞基礎上，完整保留細胞外基質，并保持支架良好的生物力學性能和適宜的生物相容性。常見的脫細胞試劑包括胰蛋白酶、Triton X-100、脫氧膽酸鈉、SDS等[10-11]；本研究通過比較5種常用脫細胞方案的脫細胞效率、脫細胞導致的細胞外基質破壞和生物機械力學性能變化，建立SD大鼠腹壁植入模型評估支架的免疫原性和組織相容性差異，為下一步主動脈脫細胞方法的選擇及組織工程血管的構建提供依據。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
40日齡雄性SD大鼠90只，體重（100±10）g，購自昆明醫科大學動物實驗中心。市售豬升主動脈30根，每根長6 cm，直徑（1.5±0.2）cm。
2.5%胰蛋白酶、0.02%EDTA、Triton X-100（MP公司，美國）；脫氧膽酸鈉、SDS（Adamas公司，瑞士）；DNA酶Ⅰ、頭孢唑林鈉、兩性霉素B、環丙沙星、慶大霉素（Sigma公司，美國）；1%青霉素-鏈霉素（BI公司，以色列）；鼠抗豬Ⅰ型膠原單克隆抗體（1:400；Abcam公司，英國）；鼠抗豬彈性蛋白單克隆抗體（1:50；Thermo公司，美國）；辣根過氧化物酶標記兔抗鼠二抗（Dako公司，丹麥）；AxyPrep基因組DNA提取試劑盒（Axgen公司，美國）。恒溫搖床（Thermo公司，美國）；光鏡（Nikon公司，日本）；分光光度計（Eppendorf公司，德國）；掃描電鏡（Hitachi公司，日本）；電子萬能材料試驗機（深圳瑞格爾儀器有限公司）。
1.2 實驗分組及方法
取豬升主動脈PBS沖洗后，置于50 mL離心管，熱缺血時間 < 30 min；離心管中加入30?mL含200?mg/ L頭孢唑林鈉、250 mg/L兩性霉素B、3?mg/L環丙沙星、120 mg/L慶大霉素的PBS溶液，冰上轉運至實驗室，隨機分成6組（n=5）。對照組（F組）不行脫細胞處理，置于4℃冰箱保存；A～E組應用蒸餾水進行破細胞處理12 h后，分別應用5種方案進行脫細胞處理，脫細胞過程樣本均置于恒溫搖床內（37℃、200?r/ min），脫細胞溶液體積為150?mL/根。A組：0.1%胰蛋白酶[12-13]/0.02%EDTA/PBS（pH7.3）；B組：1%Triton X-100/0.02%EDTA[8, 14]/蒸餾水（pH7.3）；C組：1%脫氧膽酸鈉[15-16]/蒸餾水（pH7.3）；D組：0.5%脫氧膽酸鈉/0.5%SDS[17-?18]/蒸餾水（pH7.3）；E組：1%脫氧膽酸[19-20]/蒸餾水（pH7.3）。脫細胞72 h，每24小時換液，最后24 h加入17 U/mL脫氧核糖核酸酶[21]。
1.3 觀測指標
1.3.1 大體及HE染色觀察
脫細胞處理后，大體觀察各組樣本。然后沿血管長軸切開，取部分樣本以10%中性甲醛PBS溶液（pH7.2）室溫固定24 h，脫水、透明，常規石蠟包埋，切片（片厚4?μm）。常規行HE染色，鏡下觀察脫細胞情況及組織結構形態。
1.3.2 DNA定量分析
各組分別取—?80℃凍存樣本25?mg（n=5），應用AxyPrep基因組DNA提取試劑盒，按操作流程提取樣本DNA。應用分光光度計于260?nm波長處對DNA進行定量分析。
1.3.3 免疫組織化學染色觀察
采用Envision兩步法行免疫組織化學染色。取各組石蠟包埋樣本（n=5），切片，撈片、烤干、脫蠟后，應用煮沸法抗原修復，血清封閉后加一抗（Ⅰ型膠原、彈性蛋白），室溫孵育1 h，加二抗，DAB顯色，蘇木素復染，脫水后封片，光鏡下觀察。于400倍鏡下，應用光鏡自帶圖像分析軟件NIS-Elements BR3.22.64對免疫組織化學陽性表達進行半定量分析，抗原表達量=陰性對照組灰度值－實驗組灰度值。
1.3.4 掃描電鏡觀察
取各組樣本（n=5），以2.5%戊二醛PBS溶液（pH7.3）室溫固定48 h，PBS洗滌3次，每次30 min；1%鵝脫氧膽酸溶液后固定2 h，PBS洗滌3次，每次30 min；梯度乙醇脫水，40℃叔丁醇滲透處理2 h，—?20℃冰箱冷凍干燥后電鍍濺射噴金，掃描電鏡觀察樣本內膜表面結構和多孔結構。
1.3.5 生物力學測定
取各組樣本（n=5）沿血管壁長軸方向剪成矩形（2 cm×1 cm），應用電子萬能材料試驗機進行生物力學測定，拉伸速度為20 mm/min，以試驗機自帶的RDSC-6000控制系統軟件記錄樣本抗張強度、最大應力、斷裂伸長率。
1.4 大鼠腹壁肌間植入相關檢測
1.4.1 大鼠腹壁肌間植入方法
90只SD大鼠隨機分為6組，每組15只。于大腿肌肉注射3%戊巴比妥鈉（0.12?mL/100 g）麻醉，仰臥位固定，切開右側腹部皮膚，鈍性分離腹直肌與腹外斜肌，獲得約1.4?cm?×1.4?cm竇道，分別埋植A～F組大小為1.0?cm?×1.0?cm的樣本。術后背部注射1%青霉素-鏈霉素雙抗（2?mL/100 g）。
1.4.2 大體及HE染色觀察
術后密切觀察切口愈合狀況。7、14、28 d各組隨機取5只大鼠，同上法麻醉后沿原切口切開皮膚，肉眼觀察植入物情況。隨后采用空氣栓塞法處死大鼠，沿植入物周邊2?mm剪下腹壁全層標本，10%中性甲醛固定，常規HE染色，光鏡下分別觀察反應區（腹壁肌肉與植入物交界處）及中間區（植入物中央區域）情況。由2名病理科醫師對同一樣本反應區隨機選擇2個高倍視野（×?400），對中性粒細胞、淋巴細胞、巨噬細胞浸潤及血管生成情況進行半定量計數分析，取均值。
1.5 統計學方法
采用SPSS17.0統計軟件進行分析。計量資料以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 大體及HE染色觀察
經脫細胞處理后，A～E組升主動脈支架均呈白色，具備正常血管形態。HE染色示，F組可見細胞均勻分布于血管內膜、中膜和外膜側；A、D組完全去除細胞成分，細胞外基質纖維排列整齊、完整；B、C、E組細胞成分較F組減少，但尚未完全去除細胞，細胞外基質纖維完整性良好、排列整齊，其中C組內膜側細胞成分減少明顯。見圖 1。
圖1
各組樣本內膜側HE染色觀察（×100）???A組?B組?C組?D組?E組?F組??圖 2??各組Ⅰ型膠原免疫組織化學染色觀察（×400）? A組?B組?C組?D組?E組?F組
Figure1.
HE staining observation of intimal side of each group (×100)?? ?Group A ?Group B ?Group C ?Group D ?Group E? Group F??Fig. 2??Immunohistochemical staining observation of collagen typeⅠin each group (×400) ?Group A ?Group B ?Group C ?Group D ?Group E ?Group F
2.2 DNA定量分析
A、D組DNA含量顯著低于其他組，差異有統計學意義（P < 0.05），A、D組間差異無統計學意義（P > 0.05）；B、C、E組DNA含量明顯低于F組，差異有統計學意義（P < 0.05）；B、C、E組間差異亦有統計學意義（P < 0.05）。見表 1。
表1
各組樣本相關檢測指標比較（n=5，2.3 免疫組織化學染色觀察
各組均見Ⅰ型膠原和彈性蛋白陽性表達，其中A組Ⅰ型膠原表達明顯弱于其余各組，B、C、D、E組Ⅰ型膠原表達接近F組；各組彈性蛋白表達未見明顯差異。見圖 2、3。
圖3
各組彈性蛋白免疫組織化學染色觀察??（×400）? A組?B組?C組? D組?E組?F組??圖 4??各組掃描電鏡觀察（×500）?A組?B組?C組?D組?E組? F組
Figure3.
Immunohistochemical staining observation of elastin in each group (×400)?? ?Group A ?Group B ?Group C ?Group D ?Group E ?Group F??Fig. 4??Scanning electron microscope observation of each group (×500) ?Group A ?Group B ?Group C ?Group D ?Group E ?Group F
半定量抗原表達分析顯示，A組Ⅰ型膠原表達量顯著低于其余各組，差異有統計學意義（P < 0.05）；D組顯著低于B、C、E、F組，差異亦有統計學意義（P < 0.05）；其余組間比較差異無統計學意義（P > 0.05）。各組間彈性蛋白表達量比較差異均無統計學意義（P > 0.05）。見表 1。
2.4 掃描電鏡觀察
掃描電鏡觀察示，F組表面可見緊密連接的內皮細胞，呈鵝卵石樣；A組可見松散排列的細胞外基質纖維，局部纖維斷裂，基底膜結構破壞嚴重；C、D組基底膜完整，C組多孔結構較D組多；B、E組基底膜完整，未見明顯孔隙結構，基底膜上可見散在分布的細胞膜樣結構。見圖 4。
2.5 生物力學測定
A組最大應力和抗張強度顯著低于其余各組，B組顯著高于其余各組，差異均有統計學意義（P < 0.05）；C、D、E、F組間差異無統計學意義（P > 0.05）。A組斷裂伸長率顯著高于其余各組，B組顯著低于其余各組，差異均有統計學意義（P < 0.05）；C、D、E、F組間差異無統計學意義（P > 0.05）。見表 1。
2.6 大鼠腹壁肌間植入相關檢測
2.6.1 大體觀察
術后大鼠均成活，切口愈合良好，生長狀況良好。術后7 d，各組植入物均明顯突出于腹壁，切開皮膚可見植入物局部明顯突出；14 d，各組植入物仍突出于腹壁，切開皮膚可見局部稍突出；28 d，各組植入物局部未見突出，但能觸及，切開皮膚未見局部突出，植入物較前明顯變薄。
2.6.2 HE染色
術后7、14、28 d，各組均可見大量淋巴細胞及少量巨噬細胞、中性粒細胞浸潤，并有較多血管新生。術后7 d，A、D組鄰近反應區部位植入物結構相對完整；B、C、E、F組植入物結構變模糊，反應區范圍較A、D組廣；各組中間區植入物組織形態未見明顯變化。見圖 5。術后14、28 d，A、B、C、E、F組反應區范圍廣，反應區邊緣植入物結構模糊；D組反應區范圍相對其他各組窄，反應區邊緣植入物結構相對完整。B、C、E、F組原有細胞成分隨時間延長逐漸減少，28?d時僅植入物中間區可見細胞核成分；A、D組中間區局部見細胞浸潤。見圖 6。
圖5
術后7 d各組植入物反應區HE染色觀察（×100）???A組?B組?C組?D組?E組?F組??圖 6??術后28 d各組植入物中間區HE染色觀察（×100）???A組?B組?C組?D組?E組?F組
Figure5.
HE staining observation of graft reaction?zone in each group at 7 days after implantation (×100)? ?Group A ?Group B ?Group C ?Group D ?Group E ?Group F??Fig. 6?? HE staining observation of graft intermediate?zone in each group at 28 days after implantation (×100)? ?Group A ?Group B ?Group C ?Group D ?Group E ?Group F
半定量計數顯示，術后7 d，C、D組淋巴細胞和中性粒細胞數明顯低于A、B、E、F組，差異有統計學意義（P < 0.05）；D組淋巴細胞數低于C組，差異有統計學意義（P < 0.05），但兩組中性粒細胞數比較差異無統計學意義（P > 0.05）。F組淋巴細胞數低于E組，差異有統計學意義（P < 0.05），但與A、B組比較差異無統計學意義（P > 0.05）；F組中性粒細胞浸潤顯著高于A、B、E組，差異有統計學意義（P < 0.05）；A、B、E組間淋巴細胞和中性粒細胞數比較，差異均無統計學意義（P > 0.05）。D組巨噬細胞數明顯低于其余5組，差異有統計學意義（P < 0.05）；其余5組間差異無統計學意義（P > 0.05）。各組新生血管數比較，差異均無統計學意義（F=1.705，P=0.172）。
術后14 d，D組淋巴細胞數明顯低于其余5組，E組明顯高于其余各組，差異有統計學意義（P < 0.05）；A、B、C、F組間比較差異無統計學意義（P > 0.05）。F組中性粒細胞數明顯高于其余5組，差異有統計學意義（P < 0.05）；其余各組間比較差異無統計學意義（P > 0.05）。F組巨噬細胞數明顯高于B、C、D、E組，差異有統計學意義（P < 0.05）；F組與A組比較差異無統計學意義（P > 0.05）；A、B、C、D、E組間比較差異亦無統計學意義（P > 0.05）。A組新生血管數與其余各組比較，差異均無統計學意義（P > 0.05）；B組明顯低于D、E、F組，差異有統計學意義（P < 0.05），與C組比較差異無統計學意義（P > 0.05）；C組明顯低于F組，差異有統計學意義（P < 0.05），與D、E組差異無統計學意義（P > 0.05）；D、E、F組間比較，差異均無統計學意義（P > 0.05）。
術后28 d，D組淋巴細胞數顯著低于其余5組，B組顯著低于A、C、E、F組，差異均有統計學意義（P < 0.05）；A、C、E、F組間差異無統計學意義（P > 0.05）。A、F組中性粒細胞數顯著高于B、C、D、E組，差異有統計學意義（P < 0.05），A、F組間差異有統計學意義（P < 0.05）；B、C、D、E組間差異無統計學意義（P > 0.05）。A、E組巨噬細胞數顯著高于B、D、F組，差異有統計學意義（P < 0.05），A、E組間及B、D、F組間差異均無統計學意義（P > 0.05）；C組顯著高于D組，差異有統計學意義（P < 0.05）；C組與A、B、E、F組間差異均無統計學意義（P > 0.05）。各組新生血管數比較，差異均無統計學意義（F=2.530，P=0.056）。見表 2。
表2
各組各時間點淋巴細胞、中性粒細胞、巨噬細胞浸潤和血管生成檢測（n=5，個/視野，3 討論
組織工程血管構建中，支架是細胞黏附的平臺和誘導目標組織再生的基礎，它需要具備與靶血管相似的三維解剖結構、生物力學性能，良好的生物相容性和低免疫原性[10, 22]。目前，用于組織工程研究的支架材料可分為聚合物支架和生物支架兩類。聚合物支架材料來源廣泛、易于加工，但組織相容性欠佳，不能完全模擬天然血管的細胞外基質結構；可降解聚合物支架的在體重塑過程易導致生物力學性能下降，不能滿足血流動力學要求。隨著對異種細胞外基質和免疫學研究的深入，異種脫細胞血管支架因具備天然的三維立體結構、良好的生物相容性、生物力學性能與人體血管相近等特性日益受到重視。對于細胞外基質支架而言，脫細胞有效性決定了支架的免疫原性、生物相容性和應用潛能，不同脫細胞方法均會破壞細胞外基質結構，改變生物力學性能；同時，支架的表面結構也會影響種子細胞的生物學功能。因此，選用不同脫細胞試劑，對其脫細胞有效性、主要細胞外基質蛋白破壞、生物力學性能改變和生物相容性進行研究，優化脫細胞方案，獲得理想支架用于構建組織工程大直徑血管具有重要意義。
本研究中，我們在低滲預處理條件下，分別采用胰蛋白酶/EDTA、Triton X-100/EDTA、脫氧膽酸鈉、脫氧膽酸鈉/SDS、脫氧膽酸制備豬升主動脈脫細胞支架，以求獲得最適宜的主動脈細胞外基質支架。獲得脫細胞支架的前提條件是有效去除細胞成分，本研究選用的脫細胞試劑中，胰蛋白酶常用于細胞培養過程，它通過分離蛋白連接達到脫細胞效果；去垢劑（Triton X-100、脫氧膽酸鈉、SDS、脫氧膽酸）能與細胞膜的脂質雙分子層整合，破壞并溶解細胞膜結構[23]；EDTA屬于基質金屬蛋白酶抑制劑類防腐劑，能減少蛋白酶對細胞外基質的溶解和破壞，還能降低細胞間聯合的穩定性，增強脫細胞效率。5種脫細胞方法中，A、D組能有效去除細胞；C組能去除內皮細胞和部分動脈基質間細胞；B、E組能去除大部分內皮細胞，但不能去除動脈基質間細胞成分；掃描電鏡觀察示B、E組基底膜上有細胞膜樣結構殘留，進一步說明這兩種方法的主動脈脫細胞效率有限。
細胞外基質蛋白可維持生物機械力學性能，不定形細胞外基質內含有一些信號分子影響種子細胞的黏附、增殖和遷移；不同脫細胞方法具有不同程度侵襲性，可能導致細胞外基質蛋白和不定形細胞外基質成分破壞。本研究中，免疫組織化學染色觀察示，A組脫細胞方法引起Ⅰ型膠原破壞，但未引起彈性蛋白破壞；掃描電鏡觀察示A組主動脈支架基底膜破壞、細胞基質纖維暴露、局部可見基質纖維斷裂；生物力學測定示，A組主動脈支架的抗拉強度和最大應力下降，斷裂伸長率增大。結果表明，A組胰蛋白酶的侵襲力強，破壞細胞外基質并嚴重影響生物力學性能。既往應用胰蛋白酶對肺動脈去細胞支架的研究也獲得相似結果[21]。B、C、D、E組的免疫組織化學染色結果顯示主要細胞外基質蛋白破壞不明顯，掃描電鏡示基底膜結構完整，局部區域可見一些多孔結構；此外，C、D、E組的生物力學性能與F組相近。這些結果表明，基于胰蛋白酶的脫細胞方案侵襲性強，有效脫細胞的同時導致Ⅰ型膠原和基底膜破壞、細胞外基質纖維暴露，同時引起豬主動脈支架材料的最大應力和抗張強度下降，彈性增強。C、D、E組脫細胞處理后，主要細胞外基質蛋白組成和生物力學性能無明顯改變。另外，B組脫細胞豬主動脈支架的抗拉強度和最大應力明顯增加，但斷裂伸長率下降，說明B組方法對支架具有一定固定作用，但需要進一步深入研究。
異種細胞外基質支架的免疫原性和組織相容性一直是困擾研究者的難題。目前，有關異種抗原和決定異種支架組織相容性的機制尚未完全闡明。細胞膜和細胞核成分是引起異種免疫反應的關鍵因素，研究表明，異種抗原主要表達于細胞膜，如α-1，3半乳糖異種抗原主要表達于內皮細胞表面[24]。臨床心臟瓣膜病變患者行生物瓣置換后，鈣化是常見并發癥，對再次手術取出的生物瓣行組織學觀察發現鈣鹽主要沉著于細胞核部位，可能機制為戊二醛處理異種組織不能完全消除異種抗原[25]；生物瓣置換后，再次手術干預率隨年齡增加而降低，組織工程瓣膜應用于兒科患者更易出現功能障礙[26]，這說明受體免疫活性、移植物免疫原性和移植物組織相容性是決定目標移植物行使功能和適應性重塑的關鍵。因此，本研究選用生長發育期SD大鼠，構建腹壁肌間植入模型以評估各脫細胞支架的免疫原性和組織相容性。本研究中，各組支架植入SD大鼠體內后，B、C、E、F組原有細胞成分逐漸減少，證實了異種細胞膜和細胞核引起超急性、急性免疫排除的觀點，也表明細胞外基質具有免疫惰性和重建能力。7、14、28?d，D組反應區內的淋巴細胞數顯著低于其余各組，14、28?d時D組中性粒細胞數亦低于其余各組，表明D組支架的免疫原性和組織相容性優于其余各組。A組雖能有效去除細胞，但該組主動脈支架移植物反應區內仍可見大量淋巴細胞和較多中性粒細胞浸潤，可能與基底膜嚴重破壞、細胞外基質纖維暴露、纖維疏松共同導致較多抗原暴露，引發較強的免疫反應有關，還需要進一步研究證實。
植入物體內重塑成熟過程決定移植物應用。研究表明，巨噬細胞可極化為M1型和M2型，其中M1型為促炎性反應表型，促進植入物降解；M2型為抗炎性反應表型，促進植入物重塑、組織修復[27-28]。本研究中，有效脫細胞的A、D組和未完全脫細胞的B、C、E、F組反應區內巨噬細胞數并未呈現出一定規律，未能有效反映植入物的免疫原性，可能與巨噬細胞極化相關。隨后，我們將對巨噬細胞表型變化及其相應分子機制進行研究。血管新生與炎性反應強弱和植入物重塑密切相關。本研究中，各組新生血管數未見明顯差異，D組脫細胞支架移植后免疫原性顯著低于其余各組，但其小血管生成、可降解性能與其他移植物未見明顯差異，進一步說明D組方案脫細胞處理后獲得的主動脈支架具備構建組織工程大直徑血管的潛力。
綜上述，我們認為采用0.5%脫氧膽酸鈉/0.5% SDS/蒸餾水方法具有以下優點：①有效去除細胞成分的同時保存天然的基底膜和細胞外基質纖維，并獲得一定數量多孔結構，理論上能為種子細胞黏附、增殖和遷移提供更適宜的微環境；②獲得的支架生物力學性能與天然動脈相似，有利于組織工程血管植入行使正常生理功能；③該方案獲得的支架免疫原性明顯低于其他方案，組織相容性優于其他4種方案。但本研究未對支架的細胞相容性和動物體內生理功能進行相應評估，有待進一步研究完善。
