引用本文： 姜未, 雷光華, 林博文, 王華, 呂猛, 高曙光, 張方杰, 曾超. 骨橋蛋白對人膝骨關節炎軟骨細胞基質金屬蛋白酶13表達的影響. 中國修復重建外科雜志, 2014, 28(11): 1342-1345. doi: 10.7507/1002-1892.20140291 復制
骨關節炎是臨床骨科常見疾病，嚴重影響中老年人的健康和生活質量[1-2]，主要表現為關節疼痛、腫脹、僵硬、畸形和功能障礙等[3]。目前骨關節炎病因尚未明確，軟骨磨損、缺失是核心病理改變，炎性介質/因子刺激造成軟骨合成與分解代謝紊亂，促使軟骨細胞外基質中最主要成分Ⅱ型膠原的水解是骨關節炎發病的主要分子機制[4-5]。
骨橋蛋白（osteopontin，OPN）是一種磷酸化糖蛋白，廣泛參與炎性反應、腫瘤轉移等生理過程。研究已證實OPN在骨關節炎組織中高表達，且與骨關節炎的病理程度相關[6-8]。但OPN對骨關節炎發生的具體調控機制罕見報道。基質金屬蛋白酶13（matrix metalloproteinase 13，MMP-13）是水解Ⅱ型膠原的重要MMP之一，其可加速細胞外基質降解，促進軟骨退變[9-11]。基于以上背景，本研究擬通過人膝骨關節炎軟骨細胞模型，觀察OPN干預對MMP-13表達的影響，以明確OPN參與骨關節炎發生發展的具體作用機制，為臨床骨關節炎的進一步防治提供理論依據。
1 材料與方法
1.1 實驗標本與主要試劑、儀器
人膝骨關節炎軟骨標本由中南大學湘雅醫院骨科收治的14例（16膝）原發膝骨關節炎患者自愿捐贈，男4例，女10例；年齡48～73歲，平均64.1歲。取人工全膝關節置換術中獲得的截骨塊，PBS液反復清洗，切取關節面軟骨缺損區邊緣處軟骨組織[12]。
重組人OPN/SPP1蛋白（北京義翹神州生物技術有限公司）；兔抗人MMP-13單克隆抗體（Abgent公司，美國）；羊抗兔IgG、TRIzol試劑盒（Invitrogen公司，美國）；Ⅱ型膠原抗體、Ⅱ型膠原酶（Abcam公司，美國）；0.05%胰蛋白酶-EDTA、DEME/F12培養基（GIBCO公司，美國）；反轉錄試劑盒（Fermentans公司，美國）；JC-PL006 IP細胞裂解液（西安晶彩生物科技有限公司）。倒置相差顯微鏡（Olympus公司，日本）；IPP6.0圖像分析軟件（Media Cybernetics公司，美國）。
1.2 骨關節炎軟骨細胞分離培養及鑒定
將軟骨組織切為l mm×1 mm×1 mm大小，PBS液清洗2次后轉入培養皿中，加入4～5 mL 0.15%Ⅱ型膠原酶，置于37℃、5%CO2培養箱消化，直至軟骨組織塊基本消失、溶液變混濁為止。將溶液轉入離心管，以離心半徑12 cm，1 200 r/min離心8 min，棄上清，加入完全培養基（含20%FBS的DMEM/F12培養基），充分混勻，計數細胞，以1×105個/mL密度將細胞懸液接種于25 mL培養瓶中，置于37℃、5%CO2及飽和濕度培養箱中培養，定期換液。當原代細胞融合并覆蓋瓶底75%～80%時，用0.05%胰蛋白酶消化，按1:3比例傳代。倒置相差顯微鏡下觀察細胞生長情況。取第1代軟骨細胞行Ⅱ型膠原免疫組織化學染色鑒定。
1.3 實驗分組及方法
1.3.1 時間依賴性
取第1代軟骨細胞，根據觀察時間點不同分為0、24、48、72 h 4組。各組采用含1?μg/?mL OPN的完全培養基，于37℃、5%CO2培養箱中培養至對應時間，取材行實時熒光定量PCR和Western blot檢測。
1.3.2 濃度依賴性
取第1代軟骨細胞，根據OPN濃度不同分為0、0.5、1、2、4μg/mL 5組。各組采用含對應濃度OPN的完全培養基，于37℃、5%CO2培養箱中培養48 h，取材行實時熒光定量PCR和Western blot檢測。
1.4 檢測指標
1.4.1 實時熒光定量PCR檢測
參照TRIzol試劑盒說明提取細胞標本總RNA，鑒定RNA的純度及完整性。根據GenBank中MMP-13序列設計探針，上游引物：5' -GTGCCCTTCTTCACACAGAC-3' ，下游引物：5' -CAGAATTCAAAGGCCACATC-3' ；β-actin為對照。將1μg RNA加入逆轉錄體系中合成cDNA，置于—?20℃保存備用。取1?μL cDNA模板加至PCR擴增反應體系中，95℃變性15 s，60℃退火30 s，72℃延伸75 s，循環40次。計算MMP-13/β-actin mRNA相對表達量。
1.4.2 Western blot檢測
收集細胞于干凈EP管，加入Western及IP細胞裂解液。考馬斯亮藍法制作標準曲線，檢測樣品的蛋白定量；灌膠、上樣、轉膜，使用一抗（1:500兔抗人MMP-13單克隆抗體），二抗（1:2?000生物素標記的羊抗兔IgG），圖片曝光后用IPP6.0圖像分析軟件進行灰度分析。
1.5 統計學方法
采用SPSS16.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，當數據成正態分布、方差齊時，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗；當數據成非正態分布、方差不齊時，組間比較采用Kruskal-Wallis H檢驗。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 軟骨細胞形態學觀察及鑒定
倒置相差顯微鏡下觀察示，原代軟骨細胞呈三角或多角等不規則形狀，向四周爬行生長（圖 1 a）。與原代軟骨細胞相比，第1代軟骨細胞成團減少，形態均一，密度稍低，細胞間可見偽足連接（圖 1?b）。
圖1
軟骨細胞形態學觀察（倒置相差顯微鏡×100）???原代細胞?第1代細胞??圖 2?第1代軟骨細胞Ⅱ型膠原免疫組織化學染色鑒定（×?400）??圖 3?1μg/mL OPN干預后各時間點軟骨細胞MMP-13表達? mRNA表達?蛋白表達??圖 4?各濃度OPN干預48 h后軟骨細胞MMP-13表達?mRNA表達?蛋白表達
Figure1.
Chondrocyte morphological observation (Inverted phase contrast microscope×100)? ?Primary cells ?The first generation of cells??Fig. 2?Immunohistochemical staining of the first generation of chondrocytes stained with collagen typeⅡ(×400)?Fig. 3?Expressions of MMP-13 in the chondrocytes stimulated with OPN at 1μg/mL for different time ?MMP-13 mRNA ?MMP-13 protein?Fig. 4?Expressions of MMP-13 in the chondrocytes stimulated with OPN at different concentrations for 48 hours ?MMP-13 mRNA ? MMP-13 protein
免疫組織化學染色示Ⅱ型膠原染色后呈棕黃色陽性，大量分布于軟骨細胞胞質及細胞外基質（圖 2）。
2.2 OPN干預后MMP-13表達的時間依賴性
經1μg/mL OPN干預培養后，軟骨細胞MMP-13 mRNA及蛋白表達水平隨時間增加呈升高趨勢，48?h時達峰值，各時間點間比較差異均有統計學意義（P < 0.05）。見圖 3。
2.3 OPN干預后MMP-13表達的濃度依賴性
不同濃度OPN干預培養48 h后，1μg/mL組MMP-13 mRNA表達水平較0μg/mL組顯著上升，差異有統計學意義（P < 0.05）；0.5、2、4μg/mL組較0?μg/?mL組有一定上升，但比較差異無統計學意義（P > 0.05），且顯著低于1μg/mL組（P < 0.05）。而0.5、1、2、4μg/mL組MMP-13蛋白表達水平均較0μg/mL組顯著上升，差異均有統計學意義（P < 0.05）；其中1?μg/ mL組升高最為顯著，但與其余各濃度組比較差異均無統計學意義（P > 0.05）。見圖 4。
3 討論
OPN是一種帶負電荷的分泌型磷酸化糖蛋白，存在于體內多種細胞和組織中，參與骨礦化、腫瘤細胞遷移、慢性感染性疾病等病理過程。Gao等[6]研究發現人膝骨關節炎軟骨及滑液中OPN均高表達，且軟骨、滑液OPN的表達水平分別與軟骨Mankin評分和Kellgren-Lawrence分級成正相關，提示OPN可能參與了骨關節炎發生發展。類似結果在Honsawek等[7]的研究中也得到證實，同時他發現骨關節炎患者血漿中OPN表達亦顯著升高。在進一步的研究中，他們還發現凝血酶裂解后的OPN片段生物活性更強，且活性程度同樣與骨關節炎程度相關[8]。但以上研究僅觀察了OPN與骨關節炎的相關性，對OPN在骨關節炎發生發展中的明確作用及具體機制未作分析。
MMP-13參與分解代謝軟骨細胞外基質，大量研究證實其在骨關節炎發生發展中具有重要作用[9-11]。而且在IL-1β、TNF-α、bFGF等刺激作用下，MMP-13分解作用顯著加強，促進Ⅱ型膠原水解代謝，細胞外基質破壞，軟骨磨損退變[13]。除了對Ⅱ型膠原的直接作用外，MMP-13也具有水解蛋白多糖的能力[14-15]。以上研究表明，MMP-13在骨關節炎發展過程中對軟骨組織完整性的保持起著決定性作用。
我們通過對骨關節炎軟骨細胞進行干預實驗，觀察OPN作用軟骨細胞后MMP-13表達隨時間變化的特點以及不同濃度OPN干預對MMP-13表達的差異。首先經1?μg/mL濃度的OPN進行干預培養，發現MMP-13 mRNA和蛋白表達水平隨培養時間延長均明顯升高，于48 h時達峰值，此時mRNA和蛋白表達量分別約為0 h的19倍和2倍。然后經不同濃度OPN的干預培養，結果顯示隨著濃度增加，軟骨細胞中MMP-13 mRNA和蛋白水平也相應上升，濃度為1?μg/ mL時達峰值。結果表明，OPN具有上調MMP-13表達的作用，且該作用呈時間和濃度依賴性。
OPN對MMP-13的上調作用在肌腱修復及骨肉瘤轉移等相關研究中亦有體現。Mori等[16]觀察了OPN-/-與WT型小鼠髕腱組織中MMP-13表達變化，發現經14 d去神經作用后前者MMP-13 mRNA升高程度明顯高于后者。Berge等[17]對骨肉瘤細胞OPN進行脂質體介導的RNA干擾處理，發現MMP-13表達明顯增高。然而Matsui等[18]研究發現，OPN-/-小鼠軟骨細胞體外培養5 d后MMP-13 mRNA表達水平約為WT型小鼠的3倍，且兩者MMP-13 mRNA初始水平無顯著差異，因此他們認為OPN可下調MMP-13的表達進而延緩骨關節炎進程，同時他們也指出MMP-13表達水平的改變可能與OPN基因敲除后引發其他機制發生而間接導致有關。該結論與本研究結果相反，我們認為可能與觀察的實驗模型不同有關[16]；或OPN本身處于復雜的分子調控網絡中，在不同條件下可表達不同甚至相反的功效，因此需要更深入研究明確。
綜上述，OPN可上調人膝骨關節軟骨細胞MMP-13表達，進而可能影響Ⅱ型膠原和蛋白多糖的合成與分解代謝，促使軟骨細胞外基質降解，加速骨關節炎關節軟骨退變。同時OPN對MMP-13的調節具有時間及濃度依賴性，干預的最佳處理濃度和時間分別為1?μg/mL以及48 h，這為今后細胞實驗中OPN干預提供了數據支持。然而，關于OPN調控MMP-13的具體機制仍不清楚，是否類似于類風濕性關節炎、腫瘤疾病，存在NF-κB、MAPK等通路激活，將是下一步研究重點。
骨關節炎是臨床骨科常見疾病，嚴重影響中老年人的健康和生活質量[1-2]，主要表現為關節疼痛、腫脹、僵硬、畸形和功能障礙等[3]。目前骨關節炎病因尚未明確，軟骨磨損、缺失是核心病理改變，炎性介質/因子刺激造成軟骨合成與分解代謝紊亂，促使軟骨細胞外基質中最主要成分Ⅱ型膠原的水解是骨關節炎發病的主要分子機制[4-5]。
骨橋蛋白（osteopontin，OPN）是一種磷酸化糖蛋白，廣泛參與炎性反應、腫瘤轉移等生理過程。研究已證實OPN在骨關節炎組織中高表達，且與骨關節炎的病理程度相關[6-8]。但OPN對骨關節炎發生的具體調控機制罕見報道。基質金屬蛋白酶13（matrix metalloproteinase 13，MMP-13）是水解Ⅱ型膠原的重要MMP之一，其可加速細胞外基質降解，促進軟骨退變[9-11]。基于以上背景，本研究擬通過人膝骨關節炎軟骨細胞模型，觀察OPN干預對MMP-13表達的影響，以明確OPN參與骨關節炎發生發展的具體作用機制，為臨床骨關節炎的進一步防治提供理論依據。
1 材料與方法
1.1 實驗標本與主要試劑、儀器
人膝骨關節炎軟骨標本由中南大學湘雅醫院骨科收治的14例（16膝）原發膝骨關節炎患者自愿捐贈，男4例，女10例；年齡48～73歲，平均64.1歲。取人工全膝關節置換術中獲得的截骨塊，PBS液反復清洗，切取關節面軟骨缺損區邊緣處軟骨組織[12]。
重組人OPN/SPP1蛋白（北京義翹神州生物技術有限公司）；兔抗人MMP-13單克隆抗體（Abgent公司，美國）；羊抗兔IgG、TRIzol試劑盒（Invitrogen公司，美國）；Ⅱ型膠原抗體、Ⅱ型膠原酶（Abcam公司，美國）；0.05%胰蛋白酶-EDTA、DEME/F12培養基（GIBCO公司，美國）；反轉錄試劑盒（Fermentans公司，美國）；JC-PL006 IP細胞裂解液（西安晶彩生物科技有限公司）。倒置相差顯微鏡（Olympus公司，日本）；IPP6.0圖像分析軟件（Media Cybernetics公司，美國）。
1.2 骨關節炎軟骨細胞分離培養及鑒定
將軟骨組織切為l mm×1 mm×1 mm大小，PBS液清洗2次后轉入培養皿中，加入4～5 mL 0.15%Ⅱ型膠原酶，置于37℃、5%CO2培養箱消化，直至軟骨組織塊基本消失、溶液變混濁為止。將溶液轉入離心管，以離心半徑12 cm，1 200 r/min離心8 min，棄上清，加入完全培養基（含20%FBS的DMEM/F12培養基），充分混勻，計數細胞，以1×105個/mL密度將細胞懸液接種于25 mL培養瓶中，置于37℃、5%CO2及飽和濕度培養箱中培養，定期換液。當原代細胞融合并覆蓋瓶底75%～80%時，用0.05%胰蛋白酶消化，按1:3比例傳代。倒置相差顯微鏡下觀察細胞生長情況。取第1代軟骨細胞行Ⅱ型膠原免疫組織化學染色鑒定。
1.3 實驗分組及方法
1.3.1 時間依賴性
取第1代軟骨細胞，根據觀察時間點不同分為0、24、48、72 h 4組。各組采用含1?μg/?mL OPN的完全培養基，于37℃、5%CO2培養箱中培養至對應時間，取材行實時熒光定量PCR和Western blot檢測。
1.3.2 濃度依賴性
取第1代軟骨細胞，根據OPN濃度不同分為0、0.5、1、2、4μg/mL 5組。各組采用含對應濃度OPN的完全培養基，于37℃、5%CO2培養箱中培養48 h，取材行實時熒光定量PCR和Western blot檢測。
1.4 檢測指標
1.4.1 實時熒光定量PCR檢測
參照TRIzol試劑盒說明提取細胞標本總RNA，鑒定RNA的純度及完整性。根據GenBank中MMP-13序列設計探針，上游引物：5' -GTGCCCTTCTTCACACAGAC-3' ，下游引物：5' -CAGAATTCAAAGGCCACATC-3' ；β-actin為對照。將1μg RNA加入逆轉錄體系中合成cDNA，置于—?20℃保存備用。取1?μL cDNA模板加至PCR擴增反應體系中，95℃變性15 s，60℃退火30 s，72℃延伸75 s，循環40次。計算MMP-13/β-actin mRNA相對表達量。
1.4.2 Western blot檢測
收集細胞于干凈EP管，加入Western及IP細胞裂解液。考馬斯亮藍法制作標準曲線，檢測樣品的蛋白定量；灌膠、上樣、轉膜，使用一抗（1:500兔抗人MMP-13單克隆抗體），二抗（1:2?000生物素標記的羊抗兔IgG），圖片曝光后用IPP6.0圖像分析軟件進行灰度分析。
1.5 統計學方法
采用SPSS16.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，當數據成正態分布、方差齊時，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗；當數據成非正態分布、方差不齊時，組間比較采用Kruskal-Wallis H檢驗。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 軟骨細胞形態學觀察及鑒定
倒置相差顯微鏡下觀察示，原代軟骨細胞呈三角或多角等不規則形狀，向四周爬行生長（圖 1 a）。與原代軟骨細胞相比，第1代軟骨細胞成團減少，形態均一，密度稍低，細胞間可見偽足連接（圖 1?b）。
圖1
軟骨細胞形態學觀察（倒置相差顯微鏡×100）???原代細胞?第1代細胞??圖 2?第1代軟骨細胞Ⅱ型膠原免疫組織化學染色鑒定（×?400）??圖 3?1μg/mL OPN干預后各時間點軟骨細胞MMP-13表達? mRNA表達?蛋白表達??圖 4?各濃度OPN干預48 h后軟骨細胞MMP-13表達?mRNA表達?蛋白表達
Figure1.
Chondrocyte morphological observation (Inverted phase contrast microscope×100)? ?Primary cells ?The first generation of cells??Fig. 2?Immunohistochemical staining of the first generation of chondrocytes stained with collagen typeⅡ(×400)?Fig. 3?Expressions of MMP-13 in the chondrocytes stimulated with OPN at 1μg/mL for different time ?MMP-13 mRNA ?MMP-13 protein?Fig. 4?Expressions of MMP-13 in the chondrocytes stimulated with OPN at different concentrations for 48 hours ?MMP-13 mRNA ? MMP-13 protein
免疫組織化學染色示Ⅱ型膠原染色后呈棕黃色陽性，大量分布于軟骨細胞胞質及細胞外基質（圖 2）。
2.2 OPN干預后MMP-13表達的時間依賴性
經1μg/mL OPN干預培養后，軟骨細胞MMP-13 mRNA及蛋白表達水平隨時間增加呈升高趨勢，48?h時達峰值，各時間點間比較差異均有統計學意義（P < 0.05）。見圖 3。
2.3 OPN干預后MMP-13表達的濃度依賴性
不同濃度OPN干預培養48 h后，1μg/mL組MMP-13 mRNA表達水平較0μg/mL組顯著上升，差異有統計學意義（P < 0.05）；0.5、2、4μg/mL組較0?μg/?mL組有一定上升，但比較差異無統計學意義（P > 0.05），且顯著低于1μg/mL組（P < 0.05）。而0.5、1、2、4μg/mL組MMP-13蛋白表達水平均較0μg/mL組顯著上升，差異均有統計學意義（P < 0.05）；其中1?μg/ mL組升高最為顯著，但與其余各濃度組比較差異均無統計學意義（P > 0.05）。見圖 4。
3 討論
OPN是一種帶負電荷的分泌型磷酸化糖蛋白，存在于體內多種細胞和組織中，參與骨礦化、腫瘤細胞遷移、慢性感染性疾病等病理過程。Gao等[6]研究發現人膝骨關節炎軟骨及滑液中OPN均高表達，且軟骨、滑液OPN的表達水平分別與軟骨Mankin評分和Kellgren-Lawrence分級成正相關，提示OPN可能參與了骨關節炎發生發展。類似結果在Honsawek等[7]的研究中也得到證實，同時他發現骨關節炎患者血漿中OPN表達亦顯著升高。在進一步的研究中，他們還發現凝血酶裂解后的OPN片段生物活性更強，且活性程度同樣與骨關節炎程度相關[8]。但以上研究僅觀察了OPN與骨關節炎的相關性，對OPN在骨關節炎發生發展中的明確作用及具體機制未作分析。
MMP-13參與分解代謝軟骨細胞外基質，大量研究證實其在骨關節炎發生發展中具有重要作用[9-11]。而且在IL-1β、TNF-α、bFGF等刺激作用下，MMP-13分解作用顯著加強，促進Ⅱ型膠原水解代謝，細胞外基質破壞，軟骨磨損退變[13]。除了對Ⅱ型膠原的直接作用外，MMP-13也具有水解蛋白多糖的能力[14-15]。以上研究表明，MMP-13在骨關節炎發展過程中對軟骨組織完整性的保持起著決定性作用。
我們通過對骨關節炎軟骨細胞進行干預實驗，觀察OPN作用軟骨細胞后MMP-13表達隨時間變化的特點以及不同濃度OPN干預對MMP-13表達的差異。首先經1?μg/mL濃度的OPN進行干預培養，發現MMP-13 mRNA和蛋白表達水平隨培養時間延長均明顯升高，于48 h時達峰值，此時mRNA和蛋白表達量分別約為0 h的19倍和2倍。然后經不同濃度OPN的干預培養，結果顯示隨著濃度增加，軟骨細胞中MMP-13 mRNA和蛋白水平也相應上升，濃度為1?μg/ mL時達峰值。結果表明，OPN具有上調MMP-13表達的作用，且該作用呈時間和濃度依賴性。
OPN對MMP-13的上調作用在肌腱修復及骨肉瘤轉移等相關研究中亦有體現。Mori等[16]觀察了OPN-/-與WT型小鼠髕腱組織中MMP-13表達變化，發現經14 d去神經作用后前者MMP-13 mRNA升高程度明顯高于后者。Berge等[17]對骨肉瘤細胞OPN進行脂質體介導的RNA干擾處理，發現MMP-13表達明顯增高。然而Matsui等[18]研究發現，OPN-/-小鼠軟骨細胞體外培養5 d后MMP-13 mRNA表達水平約為WT型小鼠的3倍，且兩者MMP-13 mRNA初始水平無顯著差異，因此他們認為OPN可下調MMP-13的表達進而延緩骨關節炎進程，同時他們也指出MMP-13表達水平的改變可能與OPN基因敲除后引發其他機制發生而間接導致有關。該結論與本研究結果相反，我們認為可能與觀察的實驗模型不同有關[16]；或OPN本身處于復雜的分子調控網絡中，在不同條件下可表達不同甚至相反的功效，因此需要更深入研究明確。
綜上述，OPN可上調人膝骨關節軟骨細胞MMP-13表達，進而可能影響Ⅱ型膠原和蛋白多糖的合成與分解代謝，促使軟骨細胞外基質降解，加速骨關節炎關節軟骨退變。同時OPN對MMP-13的調節具有時間及濃度依賴性，干預的最佳處理濃度和時間分別為1?μg/mL以及48 h，這為今后細胞實驗中OPN干預提供了數據支持。然而，關于OPN調控MMP-13的具體機制仍不清楚，是否類似于類風濕性關節炎、腫瘤疾病，存在NF-κB、MAPK等通路激活，將是下一步研究重點。
