引用本文： 趙榮蘭, 彭效祥, 楚海榮, 宋偉, 劉慶. 可磷酸化短肽偶聯殼聚糖介導兔關節軟骨損傷修復的基因治療. 中國修復重建外科雜志, 2014, 28(11): 1346-1352. doi: 10.7507/1002-1892.20140292 復制
成熟關節軟骨損傷后自身修復能力有限，如何最大限度的誘導和激發關節軟骨細胞的自身修復潛能是目前面臨的挑戰，采用局部轉基因治療關節軟骨損傷備受關注[1-3]。基因載體的選擇與治療效果密切相關，殼聚糖（chitosan，CS）作為非病毒基因載體獲得廣泛研究[4-6]，其攜載治療基因或siRNA的納米粒復合物，已被用于體內和體外轉染哺乳動物細胞相關研究[7-10]。但目前研究顯示，CS/質粒DNA（pDNA）納米粒轉染效率較低，限制了其作為基因治療載體的應用[11]。前期實驗中我們用未經修飾的CS攜載IGF-1基因治療兔軟骨損傷，取得了一定效果[12]，但轉染效率相對較低。之后我們使用基序為LLLRRRDNEY*FY*VRRLL的可磷酸化短肽（phosphorylatable short peptide，pSP）偶聯CS（pSP-CS），由于短肽中含有兩個可被JaK2蛋白激酶磷酸化的酪氨酸殘基（*標記處），pSP-CS/pDNA進入多種細胞系后通過短肽的磷酸化促進了外源基因在細胞內與CS的解離，從而大大提高了pSP-CS/pDNA復合物的轉染效率[13]。本研究以pSP-CS作為關節軟骨損傷基因治療的載體，攜載軟骨退變有效拮抗劑抗炎性因子IL-1受體拮抗劑（IL-1 receptor antagonist，IL-1Ra）[14]和促進軟骨合成代謝的IGF-1基因[15]，直接注射至兔關節腔內，觀察pSP-CS能否將兩基因成功轉入體內并高效表達，實現兩基因在局部協同促進損傷軟骨修復的目的，為下一步臨床應用奠定基礎。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
3月齡健康雄性新西蘭大耳白兔30只，體重2.0～2.5 kg，購于山東魯抗醫藥股份有限公司動物中心。
大腸桿菌菌株E.coli.DH5α、pBudCE4.1真核表達質粒均為本實驗室保存；T4DNA連接酶、限制性內切酶、逆轉錄酶（M-MLV）、Taq DNA聚合酶、dNTPs、實時定量PCR試劑盒（大連寶生物工程有限公司）；博萊霉素、CS（Invitrogen公司，美國）；BCA蛋白測定試劑盒（Pierce公司，美國）；人IGF-1 ELISA檢測試劑盒（R & D公司，美國）；人IL-1Ra ELISA檢測試劑盒（eBiosciene公司，美國）；抗體、免疫組織化學檢測試劑盒（北京博奧森生物技術有限公司）；阿爾辛藍-過碘酸雪夫（alcian blue-periodic acid/schiff，AB-PAS）染液（南京建成生物工程研究所）。
PCR擴增儀、酶標儀、熒光定量PCR儀（Bio-Rad公司，美國）；GeneQuant100微量分光光度計（Biochrom公司，英國）；Image-Pro Plus圖像分析軟件（Media Cybernetics公司，美國）。
1.2 實驗方法
1.2.1 IL-1Ra與IGF-1真核表達載體的構建
分離正常志愿者外周血淋巴細胞，TRIzol法提取總RNA，逆轉錄cDNA。以此cDNA為模板，PCR擴增含信號肽的IL-1Ra全部編碼序列：上游，5'-CCC
1.2.2 pSP-CS/pDNA復合物的制備
由北京奧科生物技術有限公司合成基序為LLLRRRDNEY*FY*VRRLL的pSP。按照文獻[13]方法以pSP偶聯CS形成pSP-CS，將pBudCE4.1空載體及1.2.1中制備的各重組質粒與pSP-CS分別按質量比1:1.5混合，制備pSP-CS/pBudCE4.1、pSP-CS/pBudCE4.1-IL-1Ra、pSP-CS/pBudCE4.1-IGF-1與pSP-CS/pBudCE4.1-IL-1Ra + IGF-1復合物。
1.2.3 實驗分組
將30只大耳白兔雙后肢隨機分為5組（n=12），分別為假手術組（A組）、pSP-CS/pBudCE4.1干預組（B組）、pSP-CS/pBudCE4.1-IL-1Ra干預組（C組）、pSP-CS/pBudCE4.1-IGF-1干預組（D組）、pSP-CS/pBudCE4.1-IL-1Ra + IGF-1干預組（E組）。以20%烏拉坦（5 mL/kg）耳緣靜脈注射麻醉后，無菌條件下，作雙膝髕旁外側長約2 cm的縱切口，暴露股骨外側髁關節面。A組不做任何處理，直接縫合切口；B、C、D、E組用手術鉆制備直徑4 mm、深3 mm的全層軟骨缺損，以見少許新鮮血液滲出為度，制備膝關節外側髁軟骨缺損模型，生理鹽水沖洗關節腔，逐層關閉。術后連續5 d肌肉注射青霉素40萬U。術后分籠飼養，正常活動。結合前期研究結果及相關參考文獻[2, 12, 17-18]，術后1周各干預組給予對應pSP-CS/pDNA復合物，每周2次，共7周；每只每次pDNA劑量為15?μg，用生理鹽水調節至0.5 mL直接關節腔內注射。A組注射等量生理鹽水。術后8周同上法麻醉后處死全部實驗動物進行觀察。
1.3 觀測指標
1.3.1 一般情況
觀察動物術后存活、切口愈合情況，膝關節活動范圍及步態恢復情況。
1.3.2 ELISA檢測
動物處死后用1 mL生理鹽水灌洗膝關節腔，收集灌洗液。4℃以離心半徑8.3 cm，5 000 r/min離心10 min。取上清液，參照人IL-1Ra、IGF-1 ELISA檢測試劑盒說明進行操作，檢測IL-1Ra及IGF-1含量。
1.3.3 實時熒光定量PCR檢測
膝關節腔沖洗后，暴露關節面，刮取損傷區周圍軟骨標本（n=6），置于RNA提取試劑TRIzol中，用于檢測聚集蛋白聚糖（Aggrecan）、基質金屬蛋白酶3（matrix metalloproteinase 3，MMP-3）、MMP抑制劑1（MMP inhibitor 1，TIMP-1）mRNA表達。首先TRIzol法提取軟骨組織總RNA，逆轉錄得到cDNA。對Aggrecan、MMP-3、TIMP-1及內參基因β2-微球蛋白（β2-microglobulin，B2M）進行PCR擴增：95℃預變性5?min；94℃40 s、62℃30?s、72℃20?s，35個循環，72℃延伸5 min。PCR產物以1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定并進行DNA序列分析，目的基因引物序列及擴增產物大小見表 1。對各cDNA樣本進行實時熒光定量PCR分析，反應體系20μL：SYBY Green Mix 10.0?μL、cDNA模板1.0μL、上、下游引物（10?pmol/μL）各0.9?μL、滅菌雙蒸水7.2μL。反應條件：95℃預變性30?s；95℃5?s、62℃20 s、72℃20 s，35個循環。溫度變化速度為20℃/s，計算Aggrecan、MMP-3、TIMP-1及B2M基因的Ct值，以2-ΔΔCt計算基因相對表達量[19]。
表1
目的基因引物序列及擴增產物大小
Table1.
Primer sequence and PCR product size
1.3.4 組織學及免疫組織化學染色觀察
完整切取剩余膝關節損傷區標本（n=6），置于10%中性甲醛溶液固定24 h，脫鈣后石蠟包埋，4μm厚連續切片。切片分別行軟骨蛋白多糖的AB-PAS特異性染色，其中AB陽性染色為藍色，PAS為紫紅色[20]；Aggrecan免疫組織化學染色，陽性染色呈棕褐色。于400倍鏡下，每組各取6張切片，使用Image-Pro Plus圖像分析軟件分析Aggrecan染色吸光度（A）值。
1.4 統計學方法
采用SPSS17.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 一般情況
實驗兔術后無感染及死亡。2只實驗兔B組側關節活動受限，持續跛行3周后恢復；其余各組7 d內關節活動基本恢復正常，膝關節活動范圍較術前無明顯改變。
2.2 ELISA檢測
關節腔灌洗液中A組IGF-1含量與B、C組相似，組間比較差異均無統計學意義（P > 0.05）。D、E組IGF-1含量明顯高于上述3組，差異有統計學意義（P < 0.05）；D、E組間比較差異無統計學意義（P > 0.05）。見圖 1?a。
關節腔灌洗液中A組IL-1Ra含量與B、D組相似，組間比較差異無統計學意義（P > 0.05）。C、E組IL-1Ra含量明顯高于上述3組，差異有統計學意義（P < 0.05）；C、E組間比較差異無統計學意義（P > 0.05）。見圖 1?b。
圖1
ELISA檢測各組IGF-1及IL-1Ra含量? IGF-1 ? IL-1Ra??圖 2?實時熒光定量PCR檢測Aggrecan、MMP-3和TIMP-1 mRNA表達? Aggrecan ? MMP-3 ? TIMP-1??圖 3?各組Aggrecan免疫組織化學染色A值
Figure1.
The concentrations of IGF-1 and IL-1Ra in each group by ELISA ? IGF-1 ? IL-1Ra ??Fig.2 Aggrecan, MMP-3, and TIMP-1 mRNA expressions in each group by real-time fluorescent quantitative PCR detection ? Aggrecan ? MMP-3 ? TIMP-1??Fig.3? The absorbance values of Aggrecan staining in each group
2.3 實時熒光定量PCR檢測
各干預組Aggrecan mRNA相對表達量E組 > D組 > C組 > B組，組間比較差異均有統計學意義（P < 0.05）。除B組與A組比較差異無統計學意義（P > 0.05）；其余各組與A組比較差異均有統計學意義（P < 0.05）。見圖 2?a。
各組MMP-3 mRNA相對表達量B組 > D組 > C組 > E組 > A組，組間比較差異均有統計學意義（P < 0.05）。見圖 2?b。
各組TIMP-1 mRNA相對表達量E組 > C組 > D組 > B組 > A組，組間比較差異均有統計學意義（P < 0.05）。見圖 2?c。
2.4 組織學及免疫組織化學染色觀察
各組Aggrecan染色A值E組 > A組 > D組 > C組 > B組，組間比較差異均有統計學意義（P < 0.05）。見圖 3。鏡下見，A組Aggrecan及AB-PAS染色均為強陽性，軟骨細胞排列規則，呈柱狀，軟骨陷窩明顯；B組Aggrecan和AB-PAS染色呈陰性，缺損區主要為炎性細胞浸潤和纖維組織增生，未見明顯軟骨性修復；C、D組Aggrecan和AB-PAS染色呈陽性，部分缺損區出現新生軟骨修復，軟骨陷窩形成，但新生軟骨排列較紊亂，其中C組炎性細胞浸潤明顯少于D組；E組Aggrecan和AB-PAS染色呈強陽性，缺損區基本被新生軟骨填充，軟骨陷窩形成，排列接近柱狀，明顯優于C、D組（圖 4、5）。
圖4
各組AB-PAS染色觀察? A組（×40）? B組（×40）? C組（×40）? D組（×40）? E組（×40）? A組（×400）? B組（×400）? C組（×400）? D組（×400）? E組（×400）??圖 5?各組Aggrecan免疫組織化學染色觀察? A組（×40）? B組（×40）? C組（×40）? D組（×40）? E組（×40）? A組（×400）? B組（×400）? C組（×400）? D組（×400）? E組（×400）
Figure4.
AB-PAS staining in each group ? Group A (×40) ? Group B (×40) ? Group C (×40) ? Group D (×40) ? Group E (×40) ? Group A (×400) ? Group B (×400) ? Group C (×400) ? Group D (×400) ? Group E (×400)??Fig.5?Immunohistochemical staining?for Aggrecan in each group ? Group A (×40) ? Group B (×40) ? Group C (×40) ? Group D (×40) ? Group E (×40) ? Group A (×400) ? Group B (×400) ? Group C (×400) ? Group D (×400) ? Group E (×400)
3 討論
本研究構建了含有IL-1Ra和IGF-1基因的pBudCE4.1真核共表達質粒，pBudCE4.1含有人巨細胞病毒和人延伸因子1α亞單位兩個獨立的啟動子，可以同時、獨立的表達兩個基因[21]。ELISA檢測結果顯示各干預組關節腔灌洗液中含有大量外源蛋白IL-1Ra和IGF-1，E組IL-1Ra和IGF-1含量分別與C、D組相同，差異無統計學意義。提示pSP-CS/pDNA復合物可以將IL-1Ra和IGF-1基因有效轉入細胞內，并實現外源基因的局部、高效、同步表達；大大減小了后續研究兩基因協同作用時，由于兩基因轉染效率不一致所出現的偏倚。
Aggrecan是關節軟骨細胞外基質中蛋白多糖的主要形式之一，受損軟骨修復時蛋白多糖表達量明顯增加，因此蛋白多糖常被用作軟骨形成的特異性指標之一[22]。本研究顯示在促進Aggrecan表達方面無論在基因或蛋白水平，D組作用均優于C組，提示在促進軟骨合成代謝作用上IGF-1強于IL-1Ra；同時E組作用明顯優于C、D組，提示兩基因在上調Aggrecan表達上具有協同作用。大量研究表明，MMPs在關節軟骨損傷、破壞中起著重要作用[23]。其中由軟骨細胞、滑膜細胞分泌的MMP-3，對關節軟骨基質中的蛋白多糖降解起重要作用[24]。TIMP-1為MMP-3的天然抑制物，正常條件下，MMPs與TIMPs之間相互抑制，維持關節內環境的平衡。當軟骨出現損傷、破壞時，MMPs升高，TIMPs也隨之升高[25]。本研究顯示，軟骨缺損術后，B組損傷導致MMP-3表達水平顯著升高，同時帶動TIMP-1輕度增加，與相關報道結果一致[25]。C組下調MMP-3表達和上調TIMP-1表達作用明顯優于D組，提示在抑制軟骨基質降解作用上IL-1Ra強于IGF-1；同時上述作用E組明顯優于C、D組，提示兩基因在調節MMP-3和TIMP-1表達時存在協同作用；組織學觀察結果進一步證實，D組在促進軟骨基質合成及細胞增殖上優于C組；而C組在抑制炎性反應及軟骨基質降解上優于D組；E組由于IL-1Ra和IGF-1協同作用，使軟骨基質分解代謝被抑制，合成代謝被增強，明顯促進了損傷軟骨的修復，使軟骨缺損處完全被較成熟的新生軟骨所填充，形態接近周圍正常軟骨。
綜上述，pSP-CS可攜帶外源基因IL-1Ra和IGF-1進入兔體內并在局部高效表達，是軟骨損傷基因治療中較理想的基因載體；IL-1Ra和IGF-1兩基因協同作用時軟骨損傷修復效果明顯優于IL-1Ra或IGF-1單基因作用，為多基因聯合治療軟骨損傷奠定了實驗基礎。
成熟關節軟骨損傷后自身修復能力有限，如何最大限度的誘導和激發關節軟骨細胞的自身修復潛能是目前面臨的挑戰，采用局部轉基因治療關節軟骨損傷備受關注[1-3]。基因載體的選擇與治療效果密切相關，殼聚糖（chitosan，CS）作為非病毒基因載體獲得廣泛研究[4-6]，其攜載治療基因或siRNA的納米粒復合物，已被用于體內和體外轉染哺乳動物細胞相關研究[7-10]。但目前研究顯示，CS/質粒DNA（pDNA）納米粒轉染效率較低，限制了其作為基因治療載體的應用[11]。前期實驗中我們用未經修飾的CS攜載IGF-1基因治療兔軟骨損傷，取得了一定效果[12]，但轉染效率相對較低。之后我們使用基序為LLLRRRDNEY*FY*VRRLL的可磷酸化短肽（phosphorylatable short peptide，pSP）偶聯CS（pSP-CS），由于短肽中含有兩個可被JaK2蛋白激酶磷酸化的酪氨酸殘基（*標記處），pSP-CS/pDNA進入多種細胞系后通過短肽的磷酸化促進了外源基因在細胞內與CS的解離，從而大大提高了pSP-CS/pDNA復合物的轉染效率[13]。本研究以pSP-CS作為關節軟骨損傷基因治療的載體，攜載軟骨退變有效拮抗劑抗炎性因子IL-1受體拮抗劑（IL-1 receptor antagonist，IL-1Ra）[14]和促進軟骨合成代謝的IGF-1基因[15]，直接注射至兔關節腔內，觀察pSP-CS能否將兩基因成功轉入體內并高效表達，實現兩基因在局部協同促進損傷軟骨修復的目的，為下一步臨床應用奠定基礎。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
3月齡健康雄性新西蘭大耳白兔30只，體重2.0～2.5 kg，購于山東魯抗醫藥股份有限公司動物中心。
大腸桿菌菌株E.coli.DH5α、pBudCE4.1真核表達質粒均為本實驗室保存；T4DNA連接酶、限制性內切酶、逆轉錄酶（M-MLV）、Taq DNA聚合酶、dNTPs、實時定量PCR試劑盒（大連寶生物工程有限公司）；博萊霉素、CS（Invitrogen公司，美國）；BCA蛋白測定試劑盒（Pierce公司，美國）；人IGF-1 ELISA檢測試劑盒（R & D公司，美國）；人IL-1Ra ELISA檢測試劑盒（eBiosciene公司，美國）；抗體、免疫組織化學檢測試劑盒（北京博奧森生物技術有限公司）；阿爾辛藍-過碘酸雪夫（alcian blue-periodic acid/schiff，AB-PAS）染液（南京建成生物工程研究所）。
PCR擴增儀、酶標儀、熒光定量PCR儀（Bio-Rad公司，美國）；GeneQuant100微量分光光度計（Biochrom公司，英國）；Image-Pro Plus圖像分析軟件（Media Cybernetics公司，美國）。
1.2 實驗方法
1.2.1 IL-1Ra與IGF-1真核表達載體的構建
分離正常志愿者外周血淋巴細胞，TRIzol法提取總RNA，逆轉錄cDNA。以此cDNA為模板，PCR擴增含信號肽的IL-1Ra全部編碼序列：上游，5'-CCC
1.2.2 pSP-CS/pDNA復合物的制備
由北京奧科生物技術有限公司合成基序為LLLRRRDNEY*FY*VRRLL的pSP。按照文獻[13]方法以pSP偶聯CS形成pSP-CS，將pBudCE4.1空載體及1.2.1中制備的各重組質粒與pSP-CS分別按質量比1:1.5混合，制備pSP-CS/pBudCE4.1、pSP-CS/pBudCE4.1-IL-1Ra、pSP-CS/pBudCE4.1-IGF-1與pSP-CS/pBudCE4.1-IL-1Ra + IGF-1復合物。
1.2.3 實驗分組
將30只大耳白兔雙后肢隨機分為5組（n=12），分別為假手術組（A組）、pSP-CS/pBudCE4.1干預組（B組）、pSP-CS/pBudCE4.1-IL-1Ra干預組（C組）、pSP-CS/pBudCE4.1-IGF-1干預組（D組）、pSP-CS/pBudCE4.1-IL-1Ra + IGF-1干預組（E組）。以20%烏拉坦（5 mL/kg）耳緣靜脈注射麻醉后，無菌條件下，作雙膝髕旁外側長約2 cm的縱切口，暴露股骨外側髁關節面。A組不做任何處理，直接縫合切口；B、C、D、E組用手術鉆制備直徑4 mm、深3 mm的全層軟骨缺損，以見少許新鮮血液滲出為度，制備膝關節外側髁軟骨缺損模型，生理鹽水沖洗關節腔，逐層關閉。術后連續5 d肌肉注射青霉素40萬U。術后分籠飼養，正常活動。結合前期研究結果及相關參考文獻[2, 12, 17-18]，術后1周各干預組給予對應pSP-CS/pDNA復合物，每周2次，共7周；每只每次pDNA劑量為15?μg，用生理鹽水調節至0.5 mL直接關節腔內注射。A組注射等量生理鹽水。術后8周同上法麻醉后處死全部實驗動物進行觀察。
1.3 觀測指標
1.3.1 一般情況
觀察動物術后存活、切口愈合情況，膝關節活動范圍及步態恢復情況。
1.3.2 ELISA檢測
動物處死后用1 mL生理鹽水灌洗膝關節腔，收集灌洗液。4℃以離心半徑8.3 cm，5 000 r/min離心10 min。取上清液，參照人IL-1Ra、IGF-1 ELISA檢測試劑盒說明進行操作，檢測IL-1Ra及IGF-1含量。
1.3.3 實時熒光定量PCR檢測
膝關節腔沖洗后，暴露關節面，刮取損傷區周圍軟骨標本（n=6），置于RNA提取試劑TRIzol中，用于檢測聚集蛋白聚糖（Aggrecan）、基質金屬蛋白酶3（matrix metalloproteinase 3，MMP-3）、MMP抑制劑1（MMP inhibitor 1，TIMP-1）mRNA表達。首先TRIzol法提取軟骨組織總RNA，逆轉錄得到cDNA。對Aggrecan、MMP-3、TIMP-1及內參基因β2-微球蛋白（β2-microglobulin，B2M）進行PCR擴增：95℃預變性5?min；94℃40 s、62℃30?s、72℃20?s，35個循環，72℃延伸5 min。PCR產物以1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定并進行DNA序列分析，目的基因引物序列及擴增產物大小見表 1。對各cDNA樣本進行實時熒光定量PCR分析，反應體系20μL：SYBY Green Mix 10.0?μL、cDNA模板1.0μL、上、下游引物（10?pmol/μL）各0.9?μL、滅菌雙蒸水7.2μL。反應條件：95℃預變性30?s；95℃5?s、62℃20 s、72℃20 s，35個循環。溫度變化速度為20℃/s，計算Aggrecan、MMP-3、TIMP-1及B2M基因的Ct值，以2-ΔΔCt計算基因相對表達量[19]。
表1
目的基因引物序列及擴增產物大小
Table1.
Primer sequence and PCR product size
1.3.4 組織學及免疫組織化學染色觀察
完整切取剩余膝關節損傷區標本（n=6），置于10%中性甲醛溶液固定24 h，脫鈣后石蠟包埋，4μm厚連續切片。切片分別行軟骨蛋白多糖的AB-PAS特異性染色，其中AB陽性染色為藍色，PAS為紫紅色[20]；Aggrecan免疫組織化學染色，陽性染色呈棕褐色。于400倍鏡下，每組各取6張切片，使用Image-Pro Plus圖像分析軟件分析Aggrecan染色吸光度（A）值。
1.4 統計學方法
采用SPSS17.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 一般情況
實驗兔術后無感染及死亡。2只實驗兔B組側關節活動受限，持續跛行3周后恢復；其余各組7 d內關節活動基本恢復正常，膝關節活動范圍較術前無明顯改變。
2.2 ELISA檢測
關節腔灌洗液中A組IGF-1含量與B、C組相似，組間比較差異均無統計學意義（P > 0.05）。D、E組IGF-1含量明顯高于上述3組，差異有統計學意義（P < 0.05）；D、E組間比較差異無統計學意義（P > 0.05）。見圖 1?a。
關節腔灌洗液中A組IL-1Ra含量與B、D組相似，組間比較差異無統計學意義（P > 0.05）。C、E組IL-1Ra含量明顯高于上述3組，差異有統計學意義（P < 0.05）；C、E組間比較差異無統計學意義（P > 0.05）。見圖 1?b。
圖1
ELISA檢測各組IGF-1及IL-1Ra含量? IGF-1 ? IL-1Ra??圖 2?實時熒光定量PCR檢測Aggrecan、MMP-3和TIMP-1 mRNA表達? Aggrecan ? MMP-3 ? TIMP-1??圖 3?各組Aggrecan免疫組織化學染色A值
Figure1.
The concentrations of IGF-1 and IL-1Ra in each group by ELISA ? IGF-1 ? IL-1Ra ??Fig.2 Aggrecan, MMP-3, and TIMP-1 mRNA expressions in each group by real-time fluorescent quantitative PCR detection ? Aggrecan ? MMP-3 ? TIMP-1??Fig.3? The absorbance values of Aggrecan staining in each group
2.3 實時熒光定量PCR檢測
各干預組Aggrecan mRNA相對表達量E組 > D組 > C組 > B組，組間比較差異均有統計學意義（P < 0.05）。除B組與A組比較差異無統計學意義（P > 0.05）；其余各組與A組比較差異均有統計學意義（P < 0.05）。見圖 2?a。
各組MMP-3 mRNA相對表達量B組 > D組 > C組 > E組 > A組，組間比較差異均有統計學意義（P < 0.05）。見圖 2?b。
各組TIMP-1 mRNA相對表達量E組 > C組 > D組 > B組 > A組，組間比較差異均有統計學意義（P < 0.05）。見圖 2?c。
2.4 組織學及免疫組織化學染色觀察
各組Aggrecan染色A值E組 > A組 > D組 > C組 > B組，組間比較差異均有統計學意義（P < 0.05）。見圖 3。鏡下見，A組Aggrecan及AB-PAS染色均為強陽性，軟骨細胞排列規則，呈柱狀，軟骨陷窩明顯；B組Aggrecan和AB-PAS染色呈陰性，缺損區主要為炎性細胞浸潤和纖維組織增生，未見明顯軟骨性修復；C、D組Aggrecan和AB-PAS染色呈陽性，部分缺損區出現新生軟骨修復，軟骨陷窩形成，但新生軟骨排列較紊亂，其中C組炎性細胞浸潤明顯少于D組；E組Aggrecan和AB-PAS染色呈強陽性，缺損區基本被新生軟骨填充，軟骨陷窩形成，排列接近柱狀，明顯優于C、D組（圖 4、5）。
圖4
各組AB-PAS染色觀察? A組（×40）? B組（×40）? C組（×40）? D組（×40）? E組（×40）? A組（×400）? B組（×400）? C組（×400）? D組（×400）? E組（×400）??圖 5?各組Aggrecan免疫組織化學染色觀察? A組（×40）? B組（×40）? C組（×40）? D組（×40）? E組（×40）? A組（×400）? B組（×400）? C組（×400）? D組（×400）? E組（×400）
Figure4.
AB-PAS staining in each group ? Group A (×40) ? Group B (×40) ? Group C (×40) ? Group D (×40) ? Group E (×40) ? Group A (×400) ? Group B (×400) ? Group C (×400) ? Group D (×400) ? Group E (×400)??Fig.5?Immunohistochemical staining?for Aggrecan in each group ? Group A (×40) ? Group B (×40) ? Group C (×40) ? Group D (×40) ? Group E (×40) ? Group A (×400) ? Group B (×400) ? Group C (×400) ? Group D (×400) ? Group E (×400)
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本研究構建了含有IL-1Ra和IGF-1基因的pBudCE4.1真核共表達質粒，pBudCE4.1含有人巨細胞病毒和人延伸因子1α亞單位兩個獨立的啟動子，可以同時、獨立的表達兩個基因[21]。ELISA檢測結果顯示各干預組關節腔灌洗液中含有大量外源蛋白IL-1Ra和IGF-1，E組IL-1Ra和IGF-1含量分別與C、D組相同，差異無統計學意義。提示pSP-CS/pDNA復合物可以將IL-1Ra和IGF-1基因有效轉入細胞內，并實現外源基因的局部、高效、同步表達；大大減小了后續研究兩基因協同作用時，由于兩基因轉染效率不一致所出現的偏倚。
Aggrecan是關節軟骨細胞外基質中蛋白多糖的主要形式之一，受損軟骨修復時蛋白多糖表達量明顯增加，因此蛋白多糖常被用作軟骨形成的特異性指標之一[22]。本研究顯示在促進Aggrecan表達方面無論在基因或蛋白水平，D組作用均優于C組，提示在促進軟骨合成代謝作用上IGF-1強于IL-1Ra；同時E組作用明顯優于C、D組，提示兩基因在上調Aggrecan表達上具有協同作用。大量研究表明，MMPs在關節軟骨損傷、破壞中起著重要作用[23]。其中由軟骨細胞、滑膜細胞分泌的MMP-3，對關節軟骨基質中的蛋白多糖降解起重要作用[24]。TIMP-1為MMP-3的天然抑制物，正常條件下，MMPs與TIMPs之間相互抑制，維持關節內環境的平衡。當軟骨出現損傷、破壞時，MMPs升高，TIMPs也隨之升高[25]。本研究顯示，軟骨缺損術后，B組損傷導致MMP-3表達水平顯著升高，同時帶動TIMP-1輕度增加，與相關報道結果一致[25]。C組下調MMP-3表達和上調TIMP-1表達作用明顯優于D組，提示在抑制軟骨基質降解作用上IL-1Ra強于IGF-1；同時上述作用E組明顯優于C、D組，提示兩基因在調節MMP-3和TIMP-1表達時存在協同作用；組織學觀察結果進一步證實，D組在促進軟骨基質合成及細胞增殖上優于C組；而C組在抑制炎性反應及軟骨基質降解上優于D組；E組由于IL-1Ra和IGF-1協同作用，使軟骨基質分解代謝被抑制，合成代謝被增強，明顯促進了損傷軟骨的修復，使軟骨缺損處完全被較成熟的新生軟骨所填充，形態接近周圍正常軟骨。
綜上述，pSP-CS可攜帶外源基因IL-1Ra和IGF-1進入兔體內并在局部高效表達，是軟骨損傷基因治療中較理想的基因載體；IL-1Ra和IGF-1兩基因協同作用時軟骨損傷修復效果明顯優于IL-1Ra或IGF-1單基因作用，為多基因聯合治療軟骨損傷奠定了實驗基礎。
