引用本文： 楊海堂, 趙珩. MSCs老化研究進展. 中國修復重建外科雜志, 2014, 28(8): 1037-1042. doi: 10.7507/1002-1892.20140226 復制
MSCs具有自我更新和多向分化潛能，以及獲取創傷小、來源廣泛等特性，近年來廣泛應用于組織工程研究。但在臨床應用前，通常需經歷擴增、傳代，以獲取大量種子細胞。然而，MSCs在傳代增殖過程中存在老化、增殖和分化能力下降等問題，不利于后續臨床應用。上世紀60年代，Hayflick通過體外培養胚胎和成體成纖維細胞，發現細胞在傳代過程中增殖下降，直至老化死亡，即Hayflick界線。衰老的MSCs通常表現為細胞體積變大、形狀變長，細胞內表達衰老相關的半乳糖苷酶，細胞質內顆粒積聚，細胞周期停滯在G0/G1期。體外細胞培養研究表明，細胞老化是內因（如端粒縮短）和外因（如氧化應激）共同作用的結果[1]。現回顧分析近年來關于MSCs老化機制及相應改善方法的研究進展，為組織工程種子細胞培養提供參考。
1 MSCs老化的內在因素及其改善方法
1.1 端粒改變
線性DNA分子半保留復制時，DNA聚合酶并不能使隨從鏈形成的岡崎片段完整連接，最終導致染色體末端小部分缺失，具有逆轉錄酶性質的端粒酶能夠彌補這種缺陷。但正常人成體干細胞中端粒酶活性較低[2-3]，許多實驗發現MSCs老化伴隨端粒縮短的現象[4-6]。這種端粒隨線性DNA的復制而進行性耗竭的現象，解釋了體外培養MSCs有限的傳代增殖能力，即所謂的復制性老化或Hayflick界限。針對這種生理缺陷，研究人員試圖通過外源性導入維持端粒完整、穩定性所需的端粒酶，使細胞擺脫Hayflick界限的束縛[7-8]。Zhao等[9]將胎兒皮膚來源的人MSCs（human MSCs，hMSCs）轉染人類端粒逆轉錄酶催化亞基的基因hTRT。hTRT陽性hMSCs能迅速在體外擴增，傳代超過70代也未見老化現象（同一親代未轉染的hMSCs傳代約40次出現老化），并具有良好的多向分化潛能和正常核型；細胞形態、表面抗原分析結果與hTRT陰性hMSCs一致，未表達造血干細胞和內皮細胞特異抗原，接種動物體內6個月后未發現致瘤性。表明hTRT可維持hMSCs染色體端粒完整，進而阻止細胞衰老進程。這不僅說明細胞老化與端粒縮短有關，而且提供了一種補償端粒縮短所致老化的方法。
但對hTRT陽性hMSCs的致瘤性仍存在爭議，部分實驗表明有致瘤潛能[10-11]。這種差異可能是逆轉錄病毒不同所致，可加入空載體逆轉錄病毒作為對照觀察；也可能是各實驗異位基因hTRT的表達程度不同所致，可設法使hMSCs表達不同程度的hTRT，比較各種腫瘤基因和抑癌基因的變化情況；也可能與樣本量有關。故hTRT陽性hMSCs的致瘤性仍需更大樣本和更長時間觀察明確。但該方法還有許多需要深入研究的內容，如：如何控制hTRT異位表達的程度和時間；盡管轉導的hTRT致瘤性尚不能確定，但轉導后的MSCs能否與同樣具有端粒酶活性的惡性腫瘤細胞一樣永生，以及二者之間的差別如何。下一步研究可通過將已分化細胞沉默的hTRT基因誘導再活化，以避免逆轉錄病毒轉染潛在的安全性問題。
1.2 全局基因改變
細胞老化機制是復雜的過程，“年輕”細胞和“老化”細胞在生理生化等方面（如形態學、細胞質成分、增殖分化能力等）均發生了不同程度改變。端粒處于染色體末端的固定位置，而染色體很多位點調節著細胞周期、分裂、增殖、代謝等過程，僅染色體末端端粒這一部位的改變并不能完全解釋細胞老化過程。這促使研究者們尚需繼續深入研究MSCs老化發生的機制。
最初對細胞老化的研究主要局限于形態學、細胞化學；如今各種分子生物學技術，尤其是基因組學迅速發展，使得對細胞老化的認識進入新階段。對于“年輕”細胞和“老化”細胞的比較，通常首先對二者進行基因水平上的高通量分析，從總體上比較二者基因表達量改變情況，以便發現和細胞衰老有關的基因[12-14]。眾所周知，生物性狀受遺傳和環境共同影響，但不同的體外培養環境對老化細胞的基因改變是否有影響？
近來，Schallmoser等[15]詳細比較了不同分離方式、培養基、傳代方法對人BMSCs（human BMSCs，hBMSCs）復制性衰老相關基因（有關分化、凋亡、死亡、有絲分裂和增殖等）表達變化的影響，基因微陣列芯片分析發現：各種體外條件下，各組hBMSCs的全局基因改變明顯，但復制性衰老相關基因變化情況十分相似，與分離、培養、擴增條件無關。說明作為內在因素的基因調控環節參與了細胞老化的發生，并在細胞老化過程中起決定性作用，體外培養環境僅影響（加速或減緩）這一老化進程，但不能更改這種趨勢。該實驗的意義在于，使我們從基因水平去檢測干細胞是否存在老化，從而為種子細胞臨床應用的質量控制和安全監測服務。目前尚有很多基因功能不為所知，對于衰老相關基因的探索更少。但由此給我們以下啟示：各組衰老細胞中有關調節細胞生長、分裂、代謝而又變化相似的基因可作為基因水平上細胞老化潛在的分子標志物。最近研究又發現，在正常與衰老細胞間有多種新基因存在明顯差異，其中部分基因與細胞老化有直接或間接關系[16-17]。盡管越來越多衰老相關基因被發現，但目前尚難確定衰老特異性基因。要確定這些差異性基因與細胞老化的關系，需要明確其功能[18-19]。
1.3 表觀遺傳學改變
在細胞分化過程中，基因的選擇性表達產生了不同細胞生物學行為，基因組也發生了很多修飾變化，僅研究細胞增殖分化過程中全基因組量的差異，不能很好反映其功能變化。近年來，表觀遺傳學發展迅速，其中一個非常重要的部分是DNA甲基化修飾。DNA甲基化修飾作為一種重要的表觀遺傳學修飾，能夠通過影響染色質結構、DNA構象、穩定性等方式調控基因表達。針對DNA甲基化與MSCs老化關系的研究也逐漸增多，研究發現MSCs分裂增殖發生老化并伴有特殊的老化相關DNA甲基化（senescence-associated DNA-methylation，SA-DNAm）改變[20-22]。這些都支持細胞復制性老化是一種受特定表觀遺傳學修飾調控的生長發育過程，也間接說明內在性因素在細胞老化中起決定作用。Koch等[23]比較了hMSCs在普通長期培養、γ電離照射誘導老化、誘導永生化以及重組誘導多能干細胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）狀態下SA-DNAm的改變情況。結果發現普通長期培養SA-DNAm改變明顯；而γ電離照射誘導老化未見端粒縮短和SA-DNAm改變，說明γ電離照射誘導的老化與正常復制性老化機制不同；逆轉錄病毒導入端粒酶和SV40-Tag，雖然可使hMSCs永生化，但這種方式不能逆轉SA-DNAm的改變，長期傳代過程中發生了分化能力下降或消失，說明盡管可通過逆轉錄表達端粒酶，維持其端粒長度，達到永生，但不能完全干涉SA-DNAm的變化，細胞在長期培養中仍存在一定功能改變；而iPSCs不僅能永生化，而且未發生SA-DNAm改變，其性質和胚胎干細胞相似，在適宜條件下傳代無老化跡象及功能下降，說明iPSCs可能在逆轉SA-DNAm改變，使細胞擺脫老化并維持其功能中扮演重要角色。SA-DNAm可能為今后逆轉MSCs老化提供重要靶點，而iPSCs不涉及倫理問題，為研究細胞老化提供了較理想的研究對象和方式。近年通過逆轉細胞表觀遺傳學改變而延遲老化，取得了一定進展[24]。
1.4 年齡因素
年齡因素相關的細胞老化盡管受一定生理環境應激影響，但其本質上更能體現作為內在因素的基因調控對MSCs老化的影響。老化細胞主要表現為增殖分化能力下降，但是MSCs老化是否與供體年齡相關仍存在爭議。
Justesen等[25]根據MSCs來源不同將其分為年輕組（來源于18～42歲供體）、健康老年組（66～78歲）、骨質疏松組（58～76歲），結論為各組MSCs數量及成脂、成骨分化無明顯差異，不支持年齡與細胞老化相關。Yamada等[26]將來源于3、4、5、8、12、24周齡的鼠MSCs分為6組進行比較，結果類似，同樣不支持年齡與細胞老化相關。但Justesen等和Yamada等的研究對年齡分組范圍較窄，各年齡段之間生理區別不明顯。Stolzing等[12]根據MSCs來源年齡不同，將其分為年輕組（＜18歲）、成年組（19～40歲）、老年組（＞ 40歲），結論為隨年齡增大MSCs數量降低，增殖能力、多向分化潛能降低，β-半乳糖苷酶陽性細胞增多，結果支持年齡與細胞老化相關。Alt等[27]（年輕組＜ 20歲、成年組30～40歲、老年組＞ 50歲）和Zaim等[28]（年輕組0～12歲、成年組25～50歲、老年組＞ 60歲）的研究結果也支持年齡與細胞老化相關。以上3個研究根據正常人體生理變化特點進行年齡分段，能有效凸顯年齡所致的生理差異。
人體在20歲前各項發育及生理代謝都很迅速，而中年達到平穩，老年進入衰退。這些均有可能導致人體內環境發生變化，尤其處于交界處的年齡組間比較，這種改變可能會很小，以致無法發現差異。所以擴大年齡分組范圍、增大各年齡組間的區分度以及包括20歲之前的年輕組，才能更好體現年齡的意義。很多類似實驗未完全考慮這些因素，年齡范圍較窄，不能很好區分年齡的生理性差異，可能是導致年齡相關的hBMSCs數量、增殖、分化潛能等結論差異的主要原因，其他原因還有性別、分離方法和種屬來源差異等[26]。因此充分考慮生理差異的影響十分必要，有利于得出符合實際、一致的結論，以更好揭示其中的本質差異。
2 MSCs老化的外在因素及其改善方法
2.1 低氧與氧化應激
低氧誘導因子1（hypoxia-inducible factor 1，HIF-1）在缺血、低氧條件下對調節細胞生命周期、維持內環境穩態有重要作用，而且它在腫瘤生長過程中也起重要作用[29]。MSCs與腫瘤細胞有一定相似性。hBMSCs生存在生理性低氧環境（1%～7%）[30]，大量實驗研究表明低氧條件更有利于MSCs增殖傳代[1, 31]。然而低氧如何延緩MSCs老化，進而增強其增殖分化能力的機制尚不清楚。Jin等[32]研究發現，低氧相對于常氧能明顯抑制hBMSCs老化，并且和p16基因表達下調密切相關。進一步比較發現，p16基因表達下調與促分裂素原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號通路中的細胞外信號調節激酶（extracellular signal regulated kinase，ERK）的磷酸化水平下調有直接關系。而在常氧條件下使用抗氧化劑可成功誘導HIF-1α產生，但并不能降低ERK的磷酸化水平，表明ERK磷酸化不是HIF-1α直接作用的結果。Tsai等[33]研究表明，低氧通過抑制p21基因的表達來促進hBMSCs生長，延緩老化；進一步研究發現，低氧條件下HIF-1α和堿螺旋-環-螺旋結構的轉錄因子（TWIST，有促進腫瘤轉移的作用）水平明顯升高，二者均能抑制p21基因，表明HIF-1α-TWIST通過抑制p21基因介導了低氧的這種效應。而且在長期低氧培養條件下未發現細胞染色體異常及致瘤性，表明低氧能夠更好維持正常干細胞性質。由此可見，低氧可通過多種途徑延緩細胞老化，促進細胞增殖分化，HIF-1α在此過程中僅起部分作用。有關低氧延緩細胞老化的機制尚需進一步研究。
上述研究表明，低氧對延緩MSCs老化的作用是肯定的，但組織工程研究中對MSCs的培養是否均需在低氧條件下進行呢？最近，Pattappa等[34]的研究比較了2%、5%、20%O2濃度對hBMSCs傳代的影響，結果發現低氧較常氧條件更能延長hBMSCs老化時間，更有利于維持干細胞特性。但低氧與常氧條件誘導hBMSCs分化為軟骨組織無明顯差異，且只有常氧條件才能誘導其成骨分化，低氧有抑制作用；其他實驗也有類似結果[35-36]。表明在組織工程應用中，需要根據不同分化方向選擇氧濃度。
由上可知，氧濃度對細胞老化有很大影響。氧自由基的過氧化殺傷主要是破壞細胞膜結構和功能，以及核酸、蛋白質等細胞重要結構，而線粒體的呼吸鏈是產生氧自由基的主要場所，被認為是產生氧化應激的主要來源之一。正常體內亦有一系列抗氧化自由基保護機制（如過氧化物歧化酶），最終由于這種保護機制失衡，導致過氧化損傷積聚，進而導致機體發生一系列生理改變。很多實驗表明，氧化應激在細胞老化中扮演重要角色[37-40]，抗氧化劑有利于延緩MSCs老化[41]，但具體作用機制尚不清楚。最近研究發現，氧化應激可導致端粒縮短，激活特定p53轉錄反應，或p38、MAPK等途徑調控細胞老化[42-44]。說明氧化應激通過復雜的機制影響細胞老化，而不是單純的呼吸鏈損傷所致。Zhang等[45]研究線粒體氧化物歧化酶（Mn superoxide dismutase，MnSOD）和谷胱甘肽1（glutathione peroxidase 1，Gpx-1）基因缺失小鼠，發現缺失這兩種抗氧化保護酶能導致氧化應激損傷，但不影響鼠的壽命。然而，鼠的體內抗氧化機制是否與人相同，以及二者對氧化應激的敏感性是否有差異，均有待考證。可能對鼠細胞來說，MnSOD和Gpx-1缺失不足以明顯加速老化，但并不代表氧化應激無法影響鼠的壽命。Zhang等是以線粒體缺失這兩種酶來研究鼠的整體壽命，無法消除其他器官組織的抗氧化代償作用。Ho等[46]研究發現，人胎盤多能干細胞（placenta-derived multipotent cells，PDMCs）老化過程中，其分化能力下降主要是由H2O2途徑調節，而分裂增殖能力下降主要是由p21-PKC途徑調節，與H2O2積聚無明顯關系。以上結果并不能很好解釋氧化應激學說與細胞老化之間的關系，但氧化應激遠期一定會對機體產生損害。氧化應激與加速老化的關系仍需進一步研究，良好的生物模型是深入研究的前提。
2.2 生長因子
各種生長因子對于MSCs的生長、傳代必不可少，傳統的血清培養基成分復雜，很難了解其中某種生長因子扮演的角色，以及他們之間的相互影響，因此有必要采用人工培養基來研究各種生長因子的作用。Ito[47]實驗發現TGF-β1和TGF-β2通過增加細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑的水平（p16、p21、p53）抑制G1期進而加速老化。相對于對照組[FGF-2（-）]，實驗組[FGF-2（+）]通過抑制TGF-β2途徑，能夠明顯延緩hMSCs老化。Takahashi等[48]研究發現，hBMSCs在低血清（low serum，LS） +特定成分生長基質中比傳統血清培養基（DMEM + FBS）擴增更加迅速，但在LS生長基質中細胞倍增幾次后即進入老化、生長停滯階段。進一步研究表明，在LS生長基質中p16ink4a表達水平隨傳代增加而升高，在加速細胞老化進程中起重要作用，這一過程中PDGF-β、bFGF通過激活MAPK促進p16ink4a表達，而且p16ink4a蛋白的表達依賴LS生長基質，并且是可逆的。這一實驗結果表明，一些生長因子可促進細胞生長，但過量后又可能通過p16ink4a加速細胞老化。此實驗的意義在于，可通過改變培養基中生長因子成分和含量來抑制細胞老化的信號途徑，進而延長其培養周期。可以設想，通過選擇性抑制外源性PDGF-B或bFGF誘導的p16ink4a通路，可以實現不加速細胞老化又促進其增殖的目的。傳統血清培養基的有效成分不明確，所以建立含特定成分的培養系統來促進hMSCs增殖、延遲老化，是另一可行性方法。
其他培養基成分，如作為細胞代謝必需的葡萄糖等，均可影響干細胞的老化速度[49-50]。總之，細胞培養環境對獲得理想組織工程種子細胞亦至關重要。在細胞內在因素決定的Hayflick界線尚很難突破的情況下，可通過改變體外培養環境，達到組織工程種子細胞的最佳狀態。
3 小結與展望
細胞的老化機制目前尚不明確，Hayflick 界限的存在使得生理情況下細胞老化無法避免。基因工程結合轉導人端粒酶在改善細胞老化，甚至使MSCs永生化中有重要前景；供體年齡的影響在組織工程中也要考慮；分子生物學的迅速發展將為細胞老化內在機制研究提供極大幫助；iPSCs領域所取得的突破或許是走出當前研究困境的有效途徑之一。各培養條件對細胞生長有很大影響，探索如何通過改變培養條件延緩細胞老化、促進增殖，能夠為臨床應用奠定良好基礎。隨著分子生物學技術的發展和老化機制研究的深入，通過改造細胞來獲得組織工程理想的種子細胞將成為可能。
MSCs具有自我更新和多向分化潛能，以及獲取創傷小、來源廣泛等特性，近年來廣泛應用于組織工程研究。但在臨床應用前，通常需經歷擴增、傳代，以獲取大量種子細胞。然而，MSCs在傳代增殖過程中存在老化、增殖和分化能力下降等問題，不利于后續臨床應用。上世紀60年代，Hayflick通過體外培養胚胎和成體成纖維細胞，發現細胞在傳代過程中增殖下降，直至老化死亡，即Hayflick界線。衰老的MSCs通常表現為細胞體積變大、形狀變長，細胞內表達衰老相關的半乳糖苷酶，細胞質內顆粒積聚，細胞周期停滯在G0/G1期。體外細胞培養研究表明，細胞老化是內因（如端粒縮短）和外因（如氧化應激）共同作用的結果[1]。現回顧分析近年來關于MSCs老化機制及相應改善方法的研究進展，為組織工程種子細胞培養提供參考。
1 MSCs老化的內在因素及其改善方法
1.1 端粒改變
線性DNA分子半保留復制時，DNA聚合酶并不能使隨從鏈形成的岡崎片段完整連接，最終導致染色體末端小部分缺失，具有逆轉錄酶性質的端粒酶能夠彌補這種缺陷。但正常人成體干細胞中端粒酶活性較低[2-3]，許多實驗發現MSCs老化伴隨端粒縮短的現象[4-6]。這種端粒隨線性DNA的復制而進行性耗竭的現象，解釋了體外培養MSCs有限的傳代增殖能力，即所謂的復制性老化或Hayflick界限。針對這種生理缺陷，研究人員試圖通過外源性導入維持端粒完整、穩定性所需的端粒酶，使細胞擺脫Hayflick界限的束縛[7-8]。Zhao等[9]將胎兒皮膚來源的人MSCs（human MSCs，hMSCs）轉染人類端粒逆轉錄酶催化亞基的基因hTRT。hTRT陽性hMSCs能迅速在體外擴增，傳代超過70代也未見老化現象（同一親代未轉染的hMSCs傳代約40次出現老化），并具有良好的多向分化潛能和正常核型；細胞形態、表面抗原分析結果與hTRT陰性hMSCs一致，未表達造血干細胞和內皮細胞特異抗原，接種動物體內6個月后未發現致瘤性。表明hTRT可維持hMSCs染色體端粒完整，進而阻止細胞衰老進程。這不僅說明細胞老化與端粒縮短有關，而且提供了一種補償端粒縮短所致老化的方法。
但對hTRT陽性hMSCs的致瘤性仍存在爭議，部分實驗表明有致瘤潛能[10-11]。這種差異可能是逆轉錄病毒不同所致，可加入空載體逆轉錄病毒作為對照觀察；也可能是各實驗異位基因hTRT的表達程度不同所致，可設法使hMSCs表達不同程度的hTRT，比較各種腫瘤基因和抑癌基因的變化情況；也可能與樣本量有關。故hTRT陽性hMSCs的致瘤性仍需更大樣本和更長時間觀察明確。但該方法還有許多需要深入研究的內容，如：如何控制hTRT異位表達的程度和時間；盡管轉導的hTRT致瘤性尚不能確定，但轉導后的MSCs能否與同樣具有端粒酶活性的惡性腫瘤細胞一樣永生，以及二者之間的差別如何。下一步研究可通過將已分化細胞沉默的hTRT基因誘導再活化，以避免逆轉錄病毒轉染潛在的安全性問題。
1.2 全局基因改變
細胞老化機制是復雜的過程，“年輕”細胞和“老化”細胞在生理生化等方面（如形態學、細胞質成分、增殖分化能力等）均發生了不同程度改變。端粒處于染色體末端的固定位置，而染色體很多位點調節著細胞周期、分裂、增殖、代謝等過程，僅染色體末端端粒這一部位的改變并不能完全解釋細胞老化過程。這促使研究者們尚需繼續深入研究MSCs老化發生的機制。
最初對細胞老化的研究主要局限于形態學、細胞化學；如今各種分子生物學技術，尤其是基因組學迅速發展，使得對細胞老化的認識進入新階段。對于“年輕”細胞和“老化”細胞的比較，通常首先對二者進行基因水平上的高通量分析，從總體上比較二者基因表達量改變情況，以便發現和細胞衰老有關的基因[12-14]。眾所周知，生物性狀受遺傳和環境共同影響，但不同的體外培養環境對老化細胞的基因改變是否有影響？
近來，Schallmoser等[15]詳細比較了不同分離方式、培養基、傳代方法對人BMSCs（human BMSCs，hBMSCs）復制性衰老相關基因（有關分化、凋亡、死亡、有絲分裂和增殖等）表達變化的影響，基因微陣列芯片分析發現：各種體外條件下，各組hBMSCs的全局基因改變明顯，但復制性衰老相關基因變化情況十分相似，與分離、培養、擴增條件無關。說明作為內在因素的基因調控環節參與了細胞老化的發生，并在細胞老化過程中起決定性作用，體外培養環境僅影響（加速或減緩）這一老化進程，但不能更改這種趨勢。該實驗的意義在于，使我們從基因水平去檢測干細胞是否存在老化，從而為種子細胞臨床應用的質量控制和安全監測服務。目前尚有很多基因功能不為所知，對于衰老相關基因的探索更少。但由此給我們以下啟示：各組衰老細胞中有關調節細胞生長、分裂、代謝而又變化相似的基因可作為基因水平上細胞老化潛在的分子標志物。最近研究又發現，在正常與衰老細胞間有多種新基因存在明顯差異，其中部分基因與細胞老化有直接或間接關系[16-17]。盡管越來越多衰老相關基因被發現，但目前尚難確定衰老特異性基因。要確定這些差異性基因與細胞老化的關系，需要明確其功能[18-19]。
1.3 表觀遺傳學改變
在細胞分化過程中，基因的選擇性表達產生了不同細胞生物學行為，基因組也發生了很多修飾變化，僅研究細胞增殖分化過程中全基因組量的差異，不能很好反映其功能變化。近年來，表觀遺傳學發展迅速，其中一個非常重要的部分是DNA甲基化修飾。DNA甲基化修飾作為一種重要的表觀遺傳學修飾，能夠通過影響染色質結構、DNA構象、穩定性等方式調控基因表達。針對DNA甲基化與MSCs老化關系的研究也逐漸增多，研究發現MSCs分裂增殖發生老化并伴有特殊的老化相關DNA甲基化（senescence-associated DNA-methylation，SA-DNAm）改變[20-22]。這些都支持細胞復制性老化是一種受特定表觀遺傳學修飾調控的生長發育過程，也間接說明內在性因素在細胞老化中起決定作用。Koch等[23]比較了hMSCs在普通長期培養、γ電離照射誘導老化、誘導永生化以及重組誘導多能干細胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）狀態下SA-DNAm的改變情況。結果發現普通長期培養SA-DNAm改變明顯；而γ電離照射誘導老化未見端粒縮短和SA-DNAm改變，說明γ電離照射誘導的老化與正常復制性老化機制不同；逆轉錄病毒導入端粒酶和SV40-Tag，雖然可使hMSCs永生化，但這種方式不能逆轉SA-DNAm的改變，長期傳代過程中發生了分化能力下降或消失，說明盡管可通過逆轉錄表達端粒酶，維持其端粒長度，達到永生，但不能完全干涉SA-DNAm的變化，細胞在長期培養中仍存在一定功能改變；而iPSCs不僅能永生化，而且未發生SA-DNAm改變，其性質和胚胎干細胞相似，在適宜條件下傳代無老化跡象及功能下降，說明iPSCs可能在逆轉SA-DNAm改變，使細胞擺脫老化并維持其功能中扮演重要角色。SA-DNAm可能為今后逆轉MSCs老化提供重要靶點，而iPSCs不涉及倫理問題，為研究細胞老化提供了較理想的研究對象和方式。近年通過逆轉細胞表觀遺傳學改變而延遲老化，取得了一定進展[24]。
1.4 年齡因素
年齡因素相關的細胞老化盡管受一定生理環境應激影響，但其本質上更能體現作為內在因素的基因調控對MSCs老化的影響。老化細胞主要表現為增殖分化能力下降，但是MSCs老化是否與供體年齡相關仍存在爭議。
Justesen等[25]根據MSCs來源不同將其分為年輕組（來源于18～42歲供體）、健康老年組（66～78歲）、骨質疏松組（58～76歲），結論為各組MSCs數量及成脂、成骨分化無明顯差異，不支持年齡與細胞老化相關。Yamada等[26]將來源于3、4、5、8、12、24周齡的鼠MSCs分為6組進行比較，結果類似，同樣不支持年齡與細胞老化相關。但Justesen等和Yamada等的研究對年齡分組范圍較窄，各年齡段之間生理區別不明顯。Stolzing等[12]根據MSCs來源年齡不同，將其分為年輕組（＜18歲）、成年組（19～40歲）、老年組（＞ 40歲），結論為隨年齡增大MSCs數量降低，增殖能力、多向分化潛能降低，β-半乳糖苷酶陽性細胞增多，結果支持年齡與細胞老化相關。Alt等[27]（年輕組＜ 20歲、成年組30～40歲、老年組＞ 50歲）和Zaim等[28]（年輕組0～12歲、成年組25～50歲、老年組＞ 60歲）的研究結果也支持年齡與細胞老化相關。以上3個研究根據正常人體生理變化特點進行年齡分段，能有效凸顯年齡所致的生理差異。
人體在20歲前各項發育及生理代謝都很迅速，而中年達到平穩，老年進入衰退。這些均有可能導致人體內環境發生變化，尤其處于交界處的年齡組間比較，這種改變可能會很小，以致無法發現差異。所以擴大年齡分組范圍、增大各年齡組間的區分度以及包括20歲之前的年輕組，才能更好體現年齡的意義。很多類似實驗未完全考慮這些因素，年齡范圍較窄，不能很好區分年齡的生理性差異，可能是導致年齡相關的hBMSCs數量、增殖、分化潛能等結論差異的主要原因，其他原因還有性別、分離方法和種屬來源差異等[26]。因此充分考慮生理差異的影響十分必要，有利于得出符合實際、一致的結論，以更好揭示其中的本質差異。
2 MSCs老化的外在因素及其改善方法
2.1 低氧與氧化應激
低氧誘導因子1（hypoxia-inducible factor 1，HIF-1）在缺血、低氧條件下對調節細胞生命周期、維持內環境穩態有重要作用，而且它在腫瘤生長過程中也起重要作用[29]。MSCs與腫瘤細胞有一定相似性。hBMSCs生存在生理性低氧環境（1%～7%）[30]，大量實驗研究表明低氧條件更有利于MSCs增殖傳代[1, 31]。然而低氧如何延緩MSCs老化，進而增強其增殖分化能力的機制尚不清楚。Jin等[32]研究發現，低氧相對于常氧能明顯抑制hBMSCs老化，并且和p16基因表達下調密切相關。進一步比較發現，p16基因表達下調與促分裂素原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號通路中的細胞外信號調節激酶（extracellular signal regulated kinase，ERK）的磷酸化水平下調有直接關系。而在常氧條件下使用抗氧化劑可成功誘導HIF-1α產生，但并不能降低ERK的磷酸化水平，表明ERK磷酸化不是HIF-1α直接作用的結果。Tsai等[33]研究表明，低氧通過抑制p21基因的表達來促進hBMSCs生長，延緩老化；進一步研究發現，低氧條件下HIF-1α和堿螺旋-環-螺旋結構的轉錄因子（TWIST，有促進腫瘤轉移的作用）水平明顯升高，二者均能抑制p21基因，表明HIF-1α-TWIST通過抑制p21基因介導了低氧的這種效應。而且在長期低氧培養條件下未發現細胞染色體異常及致瘤性，表明低氧能夠更好維持正常干細胞性質。由此可見，低氧可通過多種途徑延緩細胞老化，促進細胞增殖分化，HIF-1α在此過程中僅起部分作用。有關低氧延緩細胞老化的機制尚需進一步研究。
上述研究表明，低氧對延緩MSCs老化的作用是肯定的，但組織工程研究中對MSCs的培養是否均需在低氧條件下進行呢？最近，Pattappa等[34]的研究比較了2%、5%、20%O2濃度對hBMSCs傳代的影響，結果發現低氧較常氧條件更能延長hBMSCs老化時間，更有利于維持干細胞特性。但低氧與常氧條件誘導hBMSCs分化為軟骨組織無明顯差異，且只有常氧條件才能誘導其成骨分化，低氧有抑制作用；其他實驗也有類似結果[35-36]。表明在組織工程應用中，需要根據不同分化方向選擇氧濃度。
由上可知，氧濃度對細胞老化有很大影響。氧自由基的過氧化殺傷主要是破壞細胞膜結構和功能，以及核酸、蛋白質等細胞重要結構，而線粒體的呼吸鏈是產生氧自由基的主要場所，被認為是產生氧化應激的主要來源之一。正常體內亦有一系列抗氧化自由基保護機制（如過氧化物歧化酶），最終由于這種保護機制失衡，導致過氧化損傷積聚，進而導致機體發生一系列生理改變。很多實驗表明，氧化應激在細胞老化中扮演重要角色[37-40]，抗氧化劑有利于延緩MSCs老化[41]，但具體作用機制尚不清楚。最近研究發現，氧化應激可導致端粒縮短，激活特定p53轉錄反應，或p38、MAPK等途徑調控細胞老化[42-44]。說明氧化應激通過復雜的機制影響細胞老化，而不是單純的呼吸鏈損傷所致。Zhang等[45]研究線粒體氧化物歧化酶（Mn superoxide dismutase，MnSOD）和谷胱甘肽1（glutathione peroxidase 1，Gpx-1）基因缺失小鼠，發現缺失這兩種抗氧化保護酶能導致氧化應激損傷，但不影響鼠的壽命。然而，鼠的體內抗氧化機制是否與人相同，以及二者對氧化應激的敏感性是否有差異，均有待考證。可能對鼠細胞來說，MnSOD和Gpx-1缺失不足以明顯加速老化，但并不代表氧化應激無法影響鼠的壽命。Zhang等是以線粒體缺失這兩種酶來研究鼠的整體壽命，無法消除其他器官組織的抗氧化代償作用。Ho等[46]研究發現，人胎盤多能干細胞（placenta-derived multipotent cells，PDMCs）老化過程中，其分化能力下降主要是由H2O2途徑調節，而分裂增殖能力下降主要是由p21-PKC途徑調節，與H2O2積聚無明顯關系。以上結果并不能很好解釋氧化應激學說與細胞老化之間的關系，但氧化應激遠期一定會對機體產生損害。氧化應激與加速老化的關系仍需進一步研究，良好的生物模型是深入研究的前提。
2.2 生長因子
各種生長因子對于MSCs的生長、傳代必不可少，傳統的血清培養基成分復雜，很難了解其中某種生長因子扮演的角色，以及他們之間的相互影響，因此有必要采用人工培養基來研究各種生長因子的作用。Ito[47]實驗發現TGF-β1和TGF-β2通過增加細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑的水平（p16、p21、p53）抑制G1期進而加速老化。相對于對照組[FGF-2（-）]，實驗組[FGF-2（+）]通過抑制TGF-β2途徑，能夠明顯延緩hMSCs老化。Takahashi等[48]研究發現，hBMSCs在低血清（low serum，LS） +特定成分生長基質中比傳統血清培養基（DMEM + FBS）擴增更加迅速，但在LS生長基質中細胞倍增幾次后即進入老化、生長停滯階段。進一步研究表明，在LS生長基質中p16ink4a表達水平隨傳代增加而升高，在加速細胞老化進程中起重要作用，這一過程中PDGF-β、bFGF通過激活MAPK促進p16ink4a表達，而且p16ink4a蛋白的表達依賴LS生長基質，并且是可逆的。這一實驗結果表明，一些生長因子可促進細胞生長，但過量后又可能通過p16ink4a加速細胞老化。此實驗的意義在于，可通過改變培養基中生長因子成分和含量來抑制細胞老化的信號途徑，進而延長其培養周期。可以設想，通過選擇性抑制外源性PDGF-B或bFGF誘導的p16ink4a通路，可以實現不加速細胞老化又促進其增殖的目的。傳統血清培養基的有效成分不明確，所以建立含特定成分的培養系統來促進hMSCs增殖、延遲老化，是另一可行性方法。
其他培養基成分，如作為細胞代謝必需的葡萄糖等，均可影響干細胞的老化速度[49-50]。總之，細胞培養環境對獲得理想組織工程種子細胞亦至關重要。在細胞內在因素決定的Hayflick界線尚很難突破的情況下，可通過改變體外培養環境，達到組織工程種子細胞的最佳狀態。
3 小結與展望
細胞的老化機制目前尚不明確，Hayflick 界限的存在使得生理情況下細胞老化無法避免。基因工程結合轉導人端粒酶在改善細胞老化，甚至使MSCs永生化中有重要前景；供體年齡的影響在組織工程中也要考慮；分子生物學的迅速發展將為細胞老化內在機制研究提供極大幫助；iPSCs領域所取得的突破或許是走出當前研究困境的有效途徑之一。各培養條件對細胞生長有很大影響，探索如何通過改變培養條件延緩細胞老化、促進增殖，能夠為臨床應用奠定良好基礎。隨著分子生物學技術的發展和老化機制研究的深入，通過改造細胞來獲得組織工程理想的種子細胞將成為可能。