引用本文： 傅月荷, 呂青. 生物來源水凝膠在組織工程中的應用與進展. 中國修復重建外科雜志, 2014, 28(8): 1030-1036. doi: 10.7507/1002-1892.20140225 復制
“組織工程”概念提出至今已有20余年，國內外學者們仍在不斷研究設計理想的支架材料。傳統二維支架材料會影響細胞的生物學行為[1-2]。水凝膠是一類具有化學或物理交聯結構、可吸收并保持大量水分但不溶于水的三維支架材料[3]，其具有獨特優勢，已廣泛應用于組織工程支架材料研究。水凝膠質地柔軟，富有彈性，與活體軟組織質感相近[4]；在液態時可注射植入體內，然后迅速充盈填充不規則組織缺損并形成不可流動的半固態水凝膠，操作簡便，也避免了手術植入帶來的創傷、感染及瘢痕形成等風險[5]。此外，水凝膠的三維空間網絡結構和天然細胞外基質（extracellular matrix，ECM）相似，可通過調節孔隙率、孔徑大小、增大內表面積等途徑，促進細胞植入、黏附與生長[5]；它富含水分（可高達99%），有利于氧氣、營養物質和細胞代謝產物運輸[1]，對周圍組織的摩擦和機械刺激小[3]。Tan等[5]發現，在成膠前加入種子細胞，可使細胞均勻分布于整個支架中，提高接種效率。
水凝膠主要分為合成水凝膠與生物來源水凝膠兩大類[6]。合成水凝膠缺乏細胞識別信號，生物活性低，在生理條件下往往無法降解，或降解產物有毒，嚴重影響材料的生物相容性及安全性[5, 7]。生物來源水凝膠來源于組織ECM，具有良好的生物相容性及生物活性。本文對幾種常用的生物來源水凝膠特性及其在組織工程研究中的應用進展作一綜述。
1 單一成分水凝膠
1.1 膠原蛋白
膠原蛋白是ECM主要成分，也是哺乳動物組織中含量最豐富的蛋白質，其基本結構是由3條多肽鏈彼此纏繞形成的三螺旋結構[5, 7]。膠原蛋白分子含有多種細胞信號結合位點的多肽序列，能被細胞合成分泌的酶（如膠原酶及絲氨酸蛋白酶等）降解[8]，生物相容性好，且免疫原性低，是應用最早、最廣泛的生物來源支架材料。Park等[9]通過細胞-支架復合培養發現，與二維支架材料相比，三維膠原蛋白水凝膠能顯著提高人臍血干細胞神經營養因子及NGF表達水平，表明膠原蛋白水凝膠有望成為組織工程神經的支架材料。但隨著研究的不斷深入，人們發現物理交聯形成的膠原蛋白水凝膠機械性能弱，降解速度快，且動物來源的膠原蛋白可能引起免疫反應[10]。因此，學者們進行了長期的探索改進，目前方法主要包括添加交聯劑（戊二醛、碳化二亞胺、京尼平等）、改變交聯環境（UV、電子束和γ射線等），或混合其他成分（聚乳酸羥基乙酸、透明質酸等）等。研究認為，多肽鏈的交聯可以提高膠原蛋白水凝膠力學性能，減慢降解速度，而抗原表位的結合可降低水凝膠抗原性[10-11]。Zhang等[10]采用γ射線照射方法制備的膠原蛋白水凝膠能促進成纖維細胞增殖，具有更好的熱穩定性，且可通過調節照射劑量來控制水凝膠的降解速度和力學性能，同時γ射線照射還起到滅菌作用。
近年來，還有學者嘗試將膠原蛋白水凝膠作為種子細胞或生長因子的運載工具，即在成膠前加入并充分混勻，成膠后細胞能夠均勻分布于凝膠中，生長因子可達到緩釋效果[12-13]。此外，Xiao 等[14]采用一種新穎的“壓縮成形”技術，將膠原水凝膠壓縮成白色半透明、具有一定機械強度的致密膜狀材料，用于兔角膜的修復重建，植入后定期裂隙燈觀察顯示，角膜表面未出現水腫、炎癥及新生血管，組織學觀察僅見少量淋巴細胞，說明該材料生物相容性好，有望成為良好的角膜修復材料。目前，膠原蛋白水凝膠已被廣泛應用于皮膚、脂肪、角膜、肌腱、韌帶、肝和心臟等組織修復重建研究[9, 12, 14]，其中作為角膜、皮膚的修復材料已進入臨床試驗階段[11, 15]。相信隨著各種技術手段及方法的發展，膠原蛋白水凝膠的臨床適用性也將大大提高。
1.2 透明質酸
透明質酸是一種高分子量的非硫酸化葡糖胺聚糖，由多個重復雙糖單位（D-葡糖醛酸和N-乙酰-D-葡糖胺通過交替的β-1，4和β-1，3糖苷鍵連接形成）組成，在體內以鹽的形式存在，主要分布于人和動物的皮膚、軟骨、臍帶、滑液、玻璃體中[16]。由于透明質酸富含官能團OH-和COOH-，因而可在溫和條件下通過化學修飾（甲基丙烯酸縮水甘油酯）、光交聯（紫外/γ射線）及化學交聯（酰肼衍生物、二乙烯基砜等）形成水凝膠材料[5, 7, 17]，而材料的機械強度和物理性能取決于修飾和交聯程度[17]。
Guvendiren等[18]在肝纖維化機制的研究中采用分步交聯技術設計出一種剛度可調的水凝膠，他們在成膠前的透明質酸中先后添加甲基丙烯酸酐和精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列進行化學修飾，然后經二硫蘇糖醇交聯形成剛度較低的水凝膠，最后再經紫外光照射交聯形成剛度較高的水凝膠，結果發現肝星狀細胞在兩種材料上的生物學行為不同，后者能夠促使細胞表達α-平滑肌肌動蛋白及Ⅰ型膠原蛋白，并向肌成纖維細胞分化，表明該水凝膠的力學強度能夠模擬體內肝纖維化過程的力學要求。Duan等[19]采用3-D生物打印技術將接種了人瓣膜間質細胞的混合透明質酸水凝膠制成人心臟瓣膜瓣環結構，細胞在材料表面和內部都能維持良好生長狀態，且不斷分泌膠原蛋白及糖胺聚糖等重塑ECM，因此他們認為隨著瓣膜瓣環模型設計的進一步精確優化，3-D生物打印的透明質酸水凝膠有望成為理想的組織工程心臟瓣膜置換材料。
然而，透明質酸常含有可能致病或引起免疫應答的雜質和內毒素，在一定程度上限制了其應用[7]。盡管如此，透明質酸作為ECM的主要成分之一，具備良好的生物相容性[4-5]；另外，它能被細胞內或血清中的透明質酸酶自然降解[5]，且能高效結合水分，黏彈性高，已成功應用于臨床醫學（如角膜移植手術、黏度補充療法治療骨關節炎等）及美容醫學（皮膚修復、軟組織充填等）[16-17]，目前在組織工程領域主要應用于心臟瓣膜、軟骨、神經及皮膚等的修復重建[4, 16]。
1.3 殼聚糖
殼聚糖（2-氨基-2-脫氧-β-D-葡聚糖） 是甲殼素（幾丁質）在堿性條件下脫乙酰化得到的天然線性高分子。甲殼素來源廣泛，主要存在于低等生物，如菌類、藻類、節支動物外殼和軟體動物的內殼等。這種聚陽離子多糖含有葡糖胺和N-乙酰基葡糖胺，與ECM中的葡糖氨基葡聚糖分子結構相似[5]。殼聚糖水凝膠的制備主要有兩種方法：① 離子交聯法：該方法簡便溫和但可逆，制得的凝膠機械性能弱[20]。② 共價交聯法：殼聚糖上的親水活性基團可與京尼平、甲醛、戊二醛等發生交聯，形成永久網絡結構，大大提高了凝膠的機械性能[21]。
Wang等[22]在體外棕色脂肪來源干細胞（brown adipose-derived stem cells，BADSCs）的培養中發現，殼聚糖能明顯提高細胞的心肌分化能力；隨后他們在SD大鼠的心肌梗死模型中，分別注射殼聚糖水凝膠及BADSCs、單純BADSCs、殼聚糖水凝膠及PBS進行修復，結果顯示，接種了BADSCs的殼聚糖水凝膠中細胞活力最佳，心肌分化能力最強，心功能恢復最快，新生微血管密度最高，梗死灶面積最小，梗死區纖維化面積也最小。以上結果均表明殼聚糖水凝膠能增強移植細胞活力，促進BADSCs分化，有利于損傷心肌修復再生，從而為心肌梗死提供了一種有效治療手段。
然而，未改性的殼聚糖由于晶體結構緊密，無法溶于中性溶液和大多數有機溶劑，故應用受到極大限制[23]。有學者通過增加殼聚糖的脫乙酰化或對殼聚糖分子進行酰基化、羧基化、烷基化、氧化、交聯和接枝等改性，制備出各種可溶性的殼聚糖衍生物[23-24]。殼聚糖可促進傷口愈合，具有抑菌作用，在生理pH值下分子表面呈正電荷，可促進細胞黏附和分化，其末端活性基團還可耦合生物活性蛋白[21, 24]。此外，殼聚糖能夠被幾丁聚糖酶和溶菌酶等降解，具有良好的生物相容性、低免疫原性、無毒且廉價易得[21]，目前主要應用于神經、肝、骨、軟骨、皮膚及心臟血管等的再生研究[22, 24]。
1.4 藻酸鹽
藻酸鹽是一種由β-D-甘露糖醛酸（M）和α-L-古洛糖醛酸（G）單體組成的親水性線性多糖，主要來源于褐色海藻和細菌[4-5]。藻酸鹽的G單體與二價陽離子（Ca2+、Mg2+等）間形成離子橋后即可快速形成水凝膠[5]。藻酸鹽水凝膠機械性能相對較好[25]，同時具備成膠條件溫和、生物相容性好、毒性低、來源廣、成本低等優點，已被廣泛應用于生物醫學領域[26-28]。但它并非理想的組織工程支架材料，首先，其來源及生產過程的不同常導致相對分子質量大小差異較大（10～1 000 ×103），且許多藻酸鹽的相對分子質量高于腎臟的清除率閾值，很難從體內排出[4, 7]；其次，藻酸鹽無法被酶降解，只能通過與周圍環境中的離子交換才能分解，該過程具有不可控性[5, 7]。為了促進藻酸鹽水凝膠的降解，有學者采用γ射線照射來降低藻酸鹽相對分子質量（從300 ×103降至25 ×103），使長鏈變短，從而促進其溶解清除[7]。Bouhadir等[29]將藻酸鹽進行了高碘酸鈉氧化處理，形成的藻酸鹽水凝膠在體外緩沖液中（pH7.4，37℃）孵育9 d即可降解。此外，藻酸鹽本身缺乏各種生物活性分子，無法與細胞發生相互作用[1, 5]。因此，有學者用生物活性物質（層粘連蛋白、凝集素、膠原蛋白等）對藻酸鹽進行修飾，以提供細胞黏附、增殖與分化的識別位點[4, 7]。雖然這些問題在一定程度上限制了藻酸鹽的應用，但隨著生產工藝不斷改進、降解機制進一步明確及修飾活化的應用，最終可能為組織工程提供良好的支架材料。
1.5 絲素蛋白
絲素蛋白是桑蠶合成的一種天然蛋白質，價廉易得，富含甘氨酸、丙氨酸和絲氨酸等20種氨基酸[4]，具有良好的生物相容性及可降解性[30]。其用作手術縫線已有幾百年歷史，近年被美國食品藥品監督管理局（FDA）批準用于軟組織修復。絲素分子可在一定條件下從無規則卷曲轉化為β構象，提高了分子的結晶程度，此即為絲素蛋白成膠機制[31]。絲素蛋白水凝膠對于氣體、低分子物質及某些高分子物質具有選擇透過性，是制備人工皮膚、隱形眼鏡、藥物緩釋載體及組織工程支架材料的良好選擇[32]。傳統的絲素蛋白水凝膠制備方法耗時長，且低pH值不適合細胞生長，鹽提取法在一定程度上裂解了絲素蛋白分子，因而得到的凝膠機械性能往往達不到生物材料使用要求。為了縮短絲素蛋白成膠時間，改善其力學性能，需對絲素蛋白進行改性，如共混、化學交聯、γ射線交聯、超聲波誘導等[30-31]。Chao等[30]采用能保持絲素蛋白完整性的去垢劑法提取絲素蛋白，然后采用超聲波誘導法促使絲素分子間形成物理交聯，得到了大量β折疊結構，最終可快速制備穩定的水凝膠材料；更為重要的是，通過改變超聲波輸出功率與持續時間，以及溫度和絲素溶液濃度，可以控制成膠時間（數分鐘到數小時）及凝膠的機械性能。盡管已有很多改進方法，但絲素蛋白水凝膠仍存在生理條件下成膠緩慢及機械性能弱的缺點，還有待進一步深入研究。目前該水凝膠在組織工程領域主要應用于關節軟骨修復。
2 多成分水凝膠
人體組織中細胞與ECM間是動態平衡、相互影響、相互依存的關系[33]：一方面，細胞通過分泌各種酶降解ECM，同時合成分泌新的物質來動態改造微環境，以滿足自身生存需要；另一方面，細胞的黏附、移行、增殖、分化及基因表達等一系列生物學行為又受到ECM的調控[33]。ECM是一個分子復合體，除了水、電解質外，還含有多種骨架成分及生物活性分子[33-34]。雖然不同組織的ECM成分相似，但它們也具有自身獨特的分子結構、組成和分布特點，即存在組織特異性[34-36]。而特定組織的生物活性成分、空間構象、排列取向、表面微觀結構等，都可能影響細胞分化和再生（如骨、軟骨、神經等）。而上述單一純化的支架材料無法完全模擬不同組織ECM成分和結構。此外，隨著干細胞研究的深入，更加強調了ECM生物化學微環境對前體干細胞有效分化和成熟的重要性。因此，只有精確復制特定組織的ECM，才能保證細胞定向分化和成熟，從而得到理想再生組織。目前，組織工程支架材料研究的趨勢是設計成分和/或結構仿生、具有組織特異性的材料，為種子細胞提供與天然組織相似的微環境[35-36]，主要包括：基質膠、ECM提取物和異種/同種脫細胞基質。
2.1 基質膠
基質膠是成熟的商業化產品，提取自鼠EHS（Engelbreth-Holm-Swarm）肉瘤，主要含層粘連蛋白-Ⅲ、Ⅳ型膠原和巢蛋白等[37]。Kleinman等[38]首次報道了基質膠提取方法，它在37℃下可形成纖維網絡狀凝膠，曾在脂肪組織再生研究中廣受關注。體內動物實驗表明，在基質膠中添加刺激血管增殖的因子（如FGF-2等），可促進血管化的脂肪組織形成[37, 39]。Piasecki等[40]將從鼠脂肪墊中分離純化的成熟脂肪細胞與基質膠混合，注射至鼠皮下，3個月后取材發現，體積仍能達到原移植物的80.2%，且脂肪細胞壽命顯著延長。但其應用由于以下原因而受到限制[37, 39, 41-42]：① 基質膠屬于腫瘤來源的異種材料，需考慮道德倫理、免疫原性及安全性問題，可能無法直接用于臨床；② 基質膠本身不具有誘導分化功能；③ 活性成分之一的層粘連蛋白-Ⅲ型膠原只在早期胚胎發育過程中起重要作用，而影響成熟組織器官的是其他亞型。因此，目前基質膠主要作為組織工程支架研究的對照材料[43]，離可應用于人體的理想支架材料尚相距甚遠。
2.2 ECM提取物
該材料尚無統一名稱，目前常稱為富含基膜成分的ECM提取物[39, 41]。學者們通過高濃度尿素抽提及反復透析純化方法，得到了多種軟組織（脂肪、真皮、肌肉、軟骨等）的ECM提取物，并通過調節pH值（4.0）或溫度（37℃）制成了水凝膠材料，應用于脂肪組織再生的研究[38-39, 41-42]。他們對水凝膠的各種性質進行了深入研究[38, 41-42]：掃描電鏡顯示兩種條件下（調節pH值或溫度）形成的水凝膠均與天然ECM的微觀結構相似。凝膠成分分析表明，這種ECM提取方法不但有效去除了細胞內蛋白及DNA等成分，還保留了豐富的層粘連蛋白、纖連蛋白、FGF等活性分子。通過對比脂肪及真皮來源的ECM提取物，發現兩者成分種類及含量各不相同，表明保留了組織來源的特異性。體外實驗結果顯示，與真皮來源水凝膠及基質膠相比，脂肪MSCs在脂肪來源水凝膠中更易黏附聚集，能更迅速分化增殖，形成大量富含脂滴的成熟脂肪細胞。3種水凝膠分別植入SD大鼠后的體內實驗結果也表明，脂肪來源ECM水凝膠能夠更好誘導脂肪細胞分化，進一步證實了不同組織來源的ECM提取物具有特異性。另外，真皮及脂肪來源ECM水凝膠均能明顯促進血管化的脂肪組織形成，且兩者差異無統計學意義，可能與兩種材料中均含FGF-1 和FGF-2有關。
Abberton等[39]通過類似方法制備了不同物種（人、豬、小鼠、大鼠）的肌肉來源水凝膠，用于研究脂肪組織再生。結果顯示，不同種屬來源肌肉制備的ECM提取物，成分和含量存在顯著差異，即種屬特異性。細胞實驗中，肌肉來源水凝膠能夠不斷刺激脂肪MSCs的成脂分化；動物實驗中，也能夠明顯促進血管化的脂肪組織再生。
目前ECM提取物相關研究較少，根據現有研究結果提示脂肪來源水凝膠更接近脂肪組織的物理和化學微環境，本身含大量生物活性成分，能夠促進脂肪MSCs分化，植入體內后在未添加外源性生長因子條件下即可刺激血管化的脂肪組織再生。因此，ECM提取物有望成為良好的軟組織支架材料，最終替代或補充現有臨床上軟組織缺損修復方法。
2.3 異種/同種脫細胞基質
一直以來，異種/同種組織脫細胞基質材料備受組織工程研究者青睞，幾乎所有組織器官的脫細胞基質材料均有研究報道。脫細胞基質是通過各種物理化學方法去除具有免疫原性的細胞成分，盡量保留基質成分。傳統制備方法得到的是二維膜狀材料或三維海綿材料，缺乏模擬細胞自然生長的三維空間網絡結構。脫細胞基質水凝膠是近10年來研究較多、成分和結構更符合仿生學的支架材料，具有無可比擬的優勢和潛力[44]。目前，已報道多種組織的脫細胞基質水凝膠，如真皮、脂肪、肌肉、小腸黏膜下層、膀胱、心肌、心包、腦、胎盤、肝臟、肌腱等[35-36, 45-51]。
Wolf等[45]分別制備了豬真皮及膀胱脫細胞基質水凝膠，對比研究發現，兩者的微觀結構、力學性能、降解時間等均存在差異，細胞接種培養也表現出不同的生物學行為，提示材料的特性受組織來源影響。Medberry等[50]對比了豬腦、脊髓和膀胱的脫細胞基質水凝膠，發現這3種水凝膠的成分存在顯著差異；體外將N1E-115小鼠神經母細胞瘤細胞分別與3種水凝膠復合培養，活死細胞染色顯示腦及脊髓的脫細胞基質水凝膠能促進細胞伸出軸突，但腦脫細胞基質水凝膠濃度與細胞軸突長度成正相關，進一步表明材料具有組織特異性；細胞接種培養7 d后，3種水凝膠中的細胞均可見大量單極或雙極軸突延長，為體內軸突再生修復提供了可能。Okada等[48]在小鼠急性心肌梗死模型中，將富含bFGF的豬小腸黏膜下層脫細胞基質水凝膠直接注射至心肌缺血部位，6周后取材行組織學染色觀察，結果表明該水凝膠可縮小梗死面積并誘導血管再生。Tottey等[44]比較了不同年齡段豬小腸黏膜下層脫細胞基質水凝膠，發現其機械性能、結構和生物學特性存在明顯差異，提示在選擇材料來源時需要考慮年齡因素。DeQuach等[51]將豬骨骼肌脫細胞基質水凝膠與單一成分的膠原蛋白水凝膠進行比較，結果顯示前者更能促進平滑肌細胞和成肌細胞的浸潤與增殖，且在外周動脈疾病的治療中，能促進小動脈和毛細血管密度增加，同時改善相關的肌肉萎縮。Singelyn等[35, 46]將成膠前的豬心室肌脫細胞基質水凝膠注射植入大鼠心肌內，原位迅速成膠，組織學染色觀察到內皮細胞和平滑肌細胞的遷移，11 d后梗死區有明顯的小動脈形成；進一步實驗研究發現，該水凝膠可增加心肌梗死區內內源性心肌細胞再生，并維持心臟功能，并且不會誘發心律失常，有望成為治療心肌梗死的新方法。
要獲取大量自體小腸黏膜下層、膀胱、心肌等組織，無法避免自身損傷，因而研究中大部分均為異種/同種異體脫細胞基質，容易引起免疫反應，存在攜帶、傳播疾病的風險，還可能存在倫理問題。目前研究較多的自體脫細胞基質水凝膠主要來源于心包和脂肪。Seif-Naraghi等[49]取接受心胸外科手術患者的心包組織（大小為4～5 cm2），脫細胞溶解后直接注射至大鼠左心室心肌內，45 min后即成膠，2周后注射部位出現新生小動脈，并有骨髓衍生肝干細胞的遷移生長，提示心包可作為治療心肌梗死的自體水凝膠材料來源。脂肪是人體含量最多的組織類型，來源豐富，通過抽脂術即可獲取。Young等[47]將人抽脂術獲得的脂肪進行脫細胞處理，得到的白色基質粉末在室溫下用胃蛋白酶充分溶解，調節pH值為7.4，置于37℃、5%CO2細胞培養箱中形成凝膠，注射至裸鼠皮下，能快速在生理條件下形成水凝膠。經脫細胞脫脂鑒定結果表明，該方法不但脫細胞完全，而且保留了基質中的膠原、糖胺聚糖及多肽等多種成分；接種細胞培養1、7、14 d，活死細胞染色及DNA定量分析顯示，該水凝膠能支持人脂肪MSCs的黏附生長。由此可見，自體脂肪脫細胞基質水凝膠可能成為自體軟組織填充的理想材料。此外，人胎盤也可作為自體脫細胞基質水凝膠的組織來源，胎盤富含ECM及基膜成分，可通過豐富血管網采用灌注法脫細胞，同時其獲取還不存在供區損傷[52]。
3 總結與展望
目前組織工程支架材料種類繁多，生物來源水凝膠以其獨特優勢應用日趨廣泛，但仍存在以下問題及挑戰：① 細胞生長環境是動態變化的，細胞改造ECM的分子機制及兩者之間的動態平衡有待進一步明確，從而指導設計出更加合理的支架材料[1, 6-7]。② 脫細胞基質水凝膠制備第一步為通過各種理化方法去除所有細胞和核物質，而不同種屬不同組織的脫細胞效果存在差異，因此有待探索高效合理的脫細胞方法[53]。③ 生物來源水凝膠往往機械性能弱、降解快，目前主要采用交聯或添加合成成分來解決這一不足，但常用的化學交聯劑存在細胞毒性，因此需尋找安全無毒的交聯劑。④ 再生組織的血管化仍是生物來源水凝膠在組織工程研究中面臨的關鍵問題之一[20]。有學者在凝膠中加入血管生成因子，取得了一定效果，但如何根據組織特異性添加血管生成因子，如何設計動態可持續釋放的凝膠體系，有待進一步明確。⑤ 目前生物來源水凝膠材料的滅菌方法可行性及效果均欠佳，需要進一步研究。⑥ 目前生物來源水凝膠的原料主要來自異種/同種異體組織，可能存在種屬/個體差異、免疫原性及疾病傳播風險，如應用于臨床，還需解決安全穩定的產業化來源問題。
盡管生物來源水凝膠材料的研究和應用還面臨諸多困難，但隨著組織工程技術發展，有望獲得理想的生物來源水凝膠材料，并最終應用于臨床。
“組織工程”概念提出至今已有20余年，國內外學者們仍在不斷研究設計理想的支架材料。傳統二維支架材料會影響細胞的生物學行為[1-2]。水凝膠是一類具有化學或物理交聯結構、可吸收并保持大量水分但不溶于水的三維支架材料[3]，其具有獨特優勢，已廣泛應用于組織工程支架材料研究。水凝膠質地柔軟，富有彈性，與活體軟組織質感相近[4]；在液態時可注射植入體內，然后迅速充盈填充不規則組織缺損并形成不可流動的半固態水凝膠，操作簡便，也避免了手術植入帶來的創傷、感染及瘢痕形成等風險[5]。此外，水凝膠的三維空間網絡結構和天然細胞外基質（extracellular matrix，ECM）相似，可通過調節孔隙率、孔徑大小、增大內表面積等途徑，促進細胞植入、黏附與生長[5]；它富含水分（可高達99%），有利于氧氣、營養物質和細胞代謝產物運輸[1]，對周圍組織的摩擦和機械刺激小[3]。Tan等[5]發現，在成膠前加入種子細胞，可使細胞均勻分布于整個支架中，提高接種效率。
水凝膠主要分為合成水凝膠與生物來源水凝膠兩大類[6]。合成水凝膠缺乏細胞識別信號，生物活性低，在生理條件下往往無法降解，或降解產物有毒，嚴重影響材料的生物相容性及安全性[5, 7]。生物來源水凝膠來源于組織ECM，具有良好的生物相容性及生物活性。本文對幾種常用的生物來源水凝膠特性及其在組織工程研究中的應用進展作一綜述。
1 單一成分水凝膠
1.1 膠原蛋白
膠原蛋白是ECM主要成分，也是哺乳動物組織中含量最豐富的蛋白質，其基本結構是由3條多肽鏈彼此纏繞形成的三螺旋結構[5, 7]。膠原蛋白分子含有多種細胞信號結合位點的多肽序列，能被細胞合成分泌的酶（如膠原酶及絲氨酸蛋白酶等）降解[8]，生物相容性好，且免疫原性低，是應用最早、最廣泛的生物來源支架材料。Park等[9]通過細胞-支架復合培養發現，與二維支架材料相比，三維膠原蛋白水凝膠能顯著提高人臍血干細胞神經營養因子及NGF表達水平，表明膠原蛋白水凝膠有望成為組織工程神經的支架材料。但隨著研究的不斷深入，人們發現物理交聯形成的膠原蛋白水凝膠機械性能弱，降解速度快，且動物來源的膠原蛋白可能引起免疫反應[10]。因此，學者們進行了長期的探索改進，目前方法主要包括添加交聯劑（戊二醛、碳化二亞胺、京尼平等）、改變交聯環境（UV、電子束和γ射線等），或混合其他成分（聚乳酸羥基乙酸、透明質酸等）等。研究認為，多肽鏈的交聯可以提高膠原蛋白水凝膠力學性能，減慢降解速度，而抗原表位的結合可降低水凝膠抗原性[10-11]。Zhang等[10]采用γ射線照射方法制備的膠原蛋白水凝膠能促進成纖維細胞增殖，具有更好的熱穩定性，且可通過調節照射劑量來控制水凝膠的降解速度和力學性能，同時γ射線照射還起到滅菌作用。
近年來，還有學者嘗試將膠原蛋白水凝膠作為種子細胞或生長因子的運載工具，即在成膠前加入并充分混勻，成膠后細胞能夠均勻分布于凝膠中，生長因子可達到緩釋效果[12-13]。此外，Xiao 等[14]采用一種新穎的“壓縮成形”技術，將膠原水凝膠壓縮成白色半透明、具有一定機械強度的致密膜狀材料，用于兔角膜的修復重建，植入后定期裂隙燈觀察顯示，角膜表面未出現水腫、炎癥及新生血管，組織學觀察僅見少量淋巴細胞，說明該材料生物相容性好，有望成為良好的角膜修復材料。目前，膠原蛋白水凝膠已被廣泛應用于皮膚、脂肪、角膜、肌腱、韌帶、肝和心臟等組織修復重建研究[9, 12, 14]，其中作為角膜、皮膚的修復材料已進入臨床試驗階段[11, 15]。相信隨著各種技術手段及方法的發展，膠原蛋白水凝膠的臨床適用性也將大大提高。
1.2 透明質酸
透明質酸是一種高分子量的非硫酸化葡糖胺聚糖，由多個重復雙糖單位（D-葡糖醛酸和N-乙酰-D-葡糖胺通過交替的β-1，4和β-1，3糖苷鍵連接形成）組成，在體內以鹽的形式存在，主要分布于人和動物的皮膚、軟骨、臍帶、滑液、玻璃體中[16]。由于透明質酸富含官能團OH-和COOH-，因而可在溫和條件下通過化學修飾（甲基丙烯酸縮水甘油酯）、光交聯（紫外/γ射線）及化學交聯（酰肼衍生物、二乙烯基砜等）形成水凝膠材料[5, 7, 17]，而材料的機械強度和物理性能取決于修飾和交聯程度[17]。
Guvendiren等[18]在肝纖維化機制的研究中采用分步交聯技術設計出一種剛度可調的水凝膠，他們在成膠前的透明質酸中先后添加甲基丙烯酸酐和精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列進行化學修飾，然后經二硫蘇糖醇交聯形成剛度較低的水凝膠，最后再經紫外光照射交聯形成剛度較高的水凝膠，結果發現肝星狀細胞在兩種材料上的生物學行為不同，后者能夠促使細胞表達α-平滑肌肌動蛋白及Ⅰ型膠原蛋白，并向肌成纖維細胞分化，表明該水凝膠的力學強度能夠模擬體內肝纖維化過程的力學要求。Duan等[19]采用3-D生物打印技術將接種了人瓣膜間質細胞的混合透明質酸水凝膠制成人心臟瓣膜瓣環結構，細胞在材料表面和內部都能維持良好生長狀態，且不斷分泌膠原蛋白及糖胺聚糖等重塑ECM，因此他們認為隨著瓣膜瓣環模型設計的進一步精確優化，3-D生物打印的透明質酸水凝膠有望成為理想的組織工程心臟瓣膜置換材料。
然而，透明質酸常含有可能致病或引起免疫應答的雜質和內毒素，在一定程度上限制了其應用[7]。盡管如此，透明質酸作為ECM的主要成分之一，具備良好的生物相容性[4-5]；另外，它能被細胞內或血清中的透明質酸酶自然降解[5]，且能高效結合水分，黏彈性高，已成功應用于臨床醫學（如角膜移植手術、黏度補充療法治療骨關節炎等）及美容醫學（皮膚修復、軟組織充填等）[16-17]，目前在組織工程領域主要應用于心臟瓣膜、軟骨、神經及皮膚等的修復重建[4, 16]。
1.3 殼聚糖
殼聚糖（2-氨基-2-脫氧-β-D-葡聚糖） 是甲殼素（幾丁質）在堿性條件下脫乙酰化得到的天然線性高分子。甲殼素來源廣泛，主要存在于低等生物，如菌類、藻類、節支動物外殼和軟體動物的內殼等。這種聚陽離子多糖含有葡糖胺和N-乙酰基葡糖胺，與ECM中的葡糖氨基葡聚糖分子結構相似[5]。殼聚糖水凝膠的制備主要有兩種方法：① 離子交聯法：該方法簡便溫和但可逆，制得的凝膠機械性能弱[20]。② 共價交聯法：殼聚糖上的親水活性基團可與京尼平、甲醛、戊二醛等發生交聯，形成永久網絡結構，大大提高了凝膠的機械性能[21]。
Wang等[22]在體外棕色脂肪來源干細胞（brown adipose-derived stem cells，BADSCs）的培養中發現，殼聚糖能明顯提高細胞的心肌分化能力；隨后他們在SD大鼠的心肌梗死模型中，分別注射殼聚糖水凝膠及BADSCs、單純BADSCs、殼聚糖水凝膠及PBS進行修復，結果顯示，接種了BADSCs的殼聚糖水凝膠中細胞活力最佳，心肌分化能力最強，心功能恢復最快，新生微血管密度最高，梗死灶面積最小，梗死區纖維化面積也最小。以上結果均表明殼聚糖水凝膠能增強移植細胞活力，促進BADSCs分化，有利于損傷心肌修復再生，從而為心肌梗死提供了一種有效治療手段。
然而，未改性的殼聚糖由于晶體結構緊密，無法溶于中性溶液和大多數有機溶劑，故應用受到極大限制[23]。有學者通過增加殼聚糖的脫乙酰化或對殼聚糖分子進行酰基化、羧基化、烷基化、氧化、交聯和接枝等改性，制備出各種可溶性的殼聚糖衍生物[23-24]。殼聚糖可促進傷口愈合，具有抑菌作用，在生理pH值下分子表面呈正電荷，可促進細胞黏附和分化，其末端活性基團還可耦合生物活性蛋白[21, 24]。此外，殼聚糖能夠被幾丁聚糖酶和溶菌酶等降解，具有良好的生物相容性、低免疫原性、無毒且廉價易得[21]，目前主要應用于神經、肝、骨、軟骨、皮膚及心臟血管等的再生研究[22, 24]。
1.4 藻酸鹽
藻酸鹽是一種由β-D-甘露糖醛酸（M）和α-L-古洛糖醛酸（G）單體組成的親水性線性多糖，主要來源于褐色海藻和細菌[4-5]。藻酸鹽的G單體與二價陽離子（Ca2+、Mg2+等）間形成離子橋后即可快速形成水凝膠[5]。藻酸鹽水凝膠機械性能相對較好[25]，同時具備成膠條件溫和、生物相容性好、毒性低、來源廣、成本低等優點，已被廣泛應用于生物醫學領域[26-28]。但它并非理想的組織工程支架材料，首先，其來源及生產過程的不同常導致相對分子質量大小差異較大（10～1 000 ×103），且許多藻酸鹽的相對分子質量高于腎臟的清除率閾值，很難從體內排出[4, 7]；其次，藻酸鹽無法被酶降解，只能通過與周圍環境中的離子交換才能分解，該過程具有不可控性[5, 7]。為了促進藻酸鹽水凝膠的降解，有學者采用γ射線照射來降低藻酸鹽相對分子質量（從300 ×103降至25 ×103），使長鏈變短，從而促進其溶解清除[7]。Bouhadir等[29]將藻酸鹽進行了高碘酸鈉氧化處理，形成的藻酸鹽水凝膠在體外緩沖液中（pH7.4，37℃）孵育9 d即可降解。此外，藻酸鹽本身缺乏各種生物活性分子，無法與細胞發生相互作用[1, 5]。因此，有學者用生物活性物質（層粘連蛋白、凝集素、膠原蛋白等）對藻酸鹽進行修飾，以提供細胞黏附、增殖與分化的識別位點[4, 7]。雖然這些問題在一定程度上限制了藻酸鹽的應用，但隨著生產工藝不斷改進、降解機制進一步明確及修飾活化的應用，最終可能為組織工程提供良好的支架材料。
1.5 絲素蛋白
絲素蛋白是桑蠶合成的一種天然蛋白質，價廉易得，富含甘氨酸、丙氨酸和絲氨酸等20種氨基酸[4]，具有良好的生物相容性及可降解性[30]。其用作手術縫線已有幾百年歷史，近年被美國食品藥品監督管理局（FDA）批準用于軟組織修復。絲素分子可在一定條件下從無規則卷曲轉化為β構象，提高了分子的結晶程度，此即為絲素蛋白成膠機制[31]。絲素蛋白水凝膠對于氣體、低分子物質及某些高分子物質具有選擇透過性，是制備人工皮膚、隱形眼鏡、藥物緩釋載體及組織工程支架材料的良好選擇[32]。傳統的絲素蛋白水凝膠制備方法耗時長，且低pH值不適合細胞生長，鹽提取法在一定程度上裂解了絲素蛋白分子，因而得到的凝膠機械性能往往達不到生物材料使用要求。為了縮短絲素蛋白成膠時間，改善其力學性能，需對絲素蛋白進行改性，如共混、化學交聯、γ射線交聯、超聲波誘導等[30-31]。Chao等[30]采用能保持絲素蛋白完整性的去垢劑法提取絲素蛋白，然后采用超聲波誘導法促使絲素分子間形成物理交聯，得到了大量β折疊結構，最終可快速制備穩定的水凝膠材料；更為重要的是，通過改變超聲波輸出功率與持續時間，以及溫度和絲素溶液濃度，可以控制成膠時間（數分鐘到數小時）及凝膠的機械性能。盡管已有很多改進方法，但絲素蛋白水凝膠仍存在生理條件下成膠緩慢及機械性能弱的缺點，還有待進一步深入研究。目前該水凝膠在組織工程領域主要應用于關節軟骨修復。
2 多成分水凝膠
人體組織中細胞與ECM間是動態平衡、相互影響、相互依存的關系[33]：一方面，細胞通過分泌各種酶降解ECM，同時合成分泌新的物質來動態改造微環境，以滿足自身生存需要；另一方面，細胞的黏附、移行、增殖、分化及基因表達等一系列生物學行為又受到ECM的調控[33]。ECM是一個分子復合體，除了水、電解質外，還含有多種骨架成分及生物活性分子[33-34]。雖然不同組織的ECM成分相似，但它們也具有自身獨特的分子結構、組成和分布特點，即存在組織特異性[34-36]。而特定組織的生物活性成分、空間構象、排列取向、表面微觀結構等，都可能影響細胞分化和再生（如骨、軟骨、神經等）。而上述單一純化的支架材料無法完全模擬不同組織ECM成分和結構。此外，隨著干細胞研究的深入，更加強調了ECM生物化學微環境對前體干細胞有效分化和成熟的重要性。因此，只有精確復制特定組織的ECM，才能保證細胞定向分化和成熟，從而得到理想再生組織。目前，組織工程支架材料研究的趨勢是設計成分和/或結構仿生、具有組織特異性的材料，為種子細胞提供與天然組織相似的微環境[35-36]，主要包括：基質膠、ECM提取物和異種/同種脫細胞基質。
2.1 基質膠
基質膠是成熟的商業化產品，提取自鼠EHS（Engelbreth-Holm-Swarm）肉瘤，主要含層粘連蛋白-Ⅲ、Ⅳ型膠原和巢蛋白等[37]。Kleinman等[38]首次報道了基質膠提取方法，它在37℃下可形成纖維網絡狀凝膠，曾在脂肪組織再生研究中廣受關注。體內動物實驗表明，在基質膠中添加刺激血管增殖的因子（如FGF-2等），可促進血管化的脂肪組織形成[37, 39]。Piasecki等[40]將從鼠脂肪墊中分離純化的成熟脂肪細胞與基質膠混合，注射至鼠皮下，3個月后取材發現，體積仍能達到原移植物的80.2%，且脂肪細胞壽命顯著延長。但其應用由于以下原因而受到限制[37, 39, 41-42]：① 基質膠屬于腫瘤來源的異種材料，需考慮道德倫理、免疫原性及安全性問題，可能無法直接用于臨床；② 基質膠本身不具有誘導分化功能；③ 活性成分之一的層粘連蛋白-Ⅲ型膠原只在早期胚胎發育過程中起重要作用，而影響成熟組織器官的是其他亞型。因此，目前基質膠主要作為組織工程支架研究的對照材料[43]，離可應用于人體的理想支架材料尚相距甚遠。
2.2 ECM提取物
該材料尚無統一名稱，目前常稱為富含基膜成分的ECM提取物[39, 41]。學者們通過高濃度尿素抽提及反復透析純化方法，得到了多種軟組織（脂肪、真皮、肌肉、軟骨等）的ECM提取物，并通過調節pH值（4.0）或溫度（37℃）制成了水凝膠材料，應用于脂肪組織再生的研究[38-39, 41-42]。他們對水凝膠的各種性質進行了深入研究[38, 41-42]：掃描電鏡顯示兩種條件下（調節pH值或溫度）形成的水凝膠均與天然ECM的微觀結構相似。凝膠成分分析表明，這種ECM提取方法不但有效去除了細胞內蛋白及DNA等成分，還保留了豐富的層粘連蛋白、纖連蛋白、FGF等活性分子。通過對比脂肪及真皮來源的ECM提取物，發現兩者成分種類及含量各不相同，表明保留了組織來源的特異性。體外實驗結果顯示，與真皮來源水凝膠及基質膠相比，脂肪MSCs在脂肪來源水凝膠中更易黏附聚集，能更迅速分化增殖，形成大量富含脂滴的成熟脂肪細胞。3種水凝膠分別植入SD大鼠后的體內實驗結果也表明，脂肪來源ECM水凝膠能夠更好誘導脂肪細胞分化，進一步證實了不同組織來源的ECM提取物具有特異性。另外，真皮及脂肪來源ECM水凝膠均能明顯促進血管化的脂肪組織形成，且兩者差異無統計學意義，可能與兩種材料中均含FGF-1 和FGF-2有關。
Abberton等[39]通過類似方法制備了不同物種（人、豬、小鼠、大鼠）的肌肉來源水凝膠，用于研究脂肪組織再生。結果顯示，不同種屬來源肌肉制備的ECM提取物，成分和含量存在顯著差異，即種屬特異性。細胞實驗中，肌肉來源水凝膠能夠不斷刺激脂肪MSCs的成脂分化；動物實驗中，也能夠明顯促進血管化的脂肪組織再生。
目前ECM提取物相關研究較少，根據現有研究結果提示脂肪來源水凝膠更接近脂肪組織的物理和化學微環境，本身含大量生物活性成分，能夠促進脂肪MSCs分化，植入體內后在未添加外源性生長因子條件下即可刺激血管化的脂肪組織再生。因此，ECM提取物有望成為良好的軟組織支架材料，最終替代或補充現有臨床上軟組織缺損修復方法。
2.3 異種/同種脫細胞基質
一直以來，異種/同種組織脫細胞基質材料備受組織工程研究者青睞，幾乎所有組織器官的脫細胞基質材料均有研究報道。脫細胞基質是通過各種物理化學方法去除具有免疫原性的細胞成分，盡量保留基質成分。傳統制備方法得到的是二維膜狀材料或三維海綿材料，缺乏模擬細胞自然生長的三維空間網絡結構。脫細胞基質水凝膠是近10年來研究較多、成分和結構更符合仿生學的支架材料，具有無可比擬的優勢和潛力[44]。目前，已報道多種組織的脫細胞基質水凝膠，如真皮、脂肪、肌肉、小腸黏膜下層、膀胱、心肌、心包、腦、胎盤、肝臟、肌腱等[35-36, 45-51]。
Wolf等[45]分別制備了豬真皮及膀胱脫細胞基質水凝膠，對比研究發現，兩者的微觀結構、力學性能、降解時間等均存在差異，細胞接種培養也表現出不同的生物學行為，提示材料的特性受組織來源影響。Medberry等[50]對比了豬腦、脊髓和膀胱的脫細胞基質水凝膠，發現這3種水凝膠的成分存在顯著差異；體外將N1E-115小鼠神經母細胞瘤細胞分別與3種水凝膠復合培養，活死細胞染色顯示腦及脊髓的脫細胞基質水凝膠能促進細胞伸出軸突，但腦脫細胞基質水凝膠濃度與細胞軸突長度成正相關，進一步表明材料具有組織特異性；細胞接種培養7 d后，3種水凝膠中的細胞均可見大量單極或雙極軸突延長，為體內軸突再生修復提供了可能。Okada等[48]在小鼠急性心肌梗死模型中，將富含bFGF的豬小腸黏膜下層脫細胞基質水凝膠直接注射至心肌缺血部位，6周后取材行組織學染色觀察，結果表明該水凝膠可縮小梗死面積并誘導血管再生。Tottey等[44]比較了不同年齡段豬小腸黏膜下層脫細胞基質水凝膠，發現其機械性能、結構和生物學特性存在明顯差異，提示在選擇材料來源時需要考慮年齡因素。DeQuach等[51]將豬骨骼肌脫細胞基質水凝膠與單一成分的膠原蛋白水凝膠進行比較，結果顯示前者更能促進平滑肌細胞和成肌細胞的浸潤與增殖，且在外周動脈疾病的治療中，能促進小動脈和毛細血管密度增加，同時改善相關的肌肉萎縮。Singelyn等[35, 46]將成膠前的豬心室肌脫細胞基質水凝膠注射植入大鼠心肌內，原位迅速成膠，組織學染色觀察到內皮細胞和平滑肌細胞的遷移，11 d后梗死區有明顯的小動脈形成；進一步實驗研究發現，該水凝膠可增加心肌梗死區內內源性心肌細胞再生，并維持心臟功能，并且不會誘發心律失常，有望成為治療心肌梗死的新方法。
要獲取大量自體小腸黏膜下層、膀胱、心肌等組織，無法避免自身損傷，因而研究中大部分均為異種/同種異體脫細胞基質，容易引起免疫反應，存在攜帶、傳播疾病的風險，還可能存在倫理問題。目前研究較多的自體脫細胞基質水凝膠主要來源于心包和脂肪。Seif-Naraghi等[49]取接受心胸外科手術患者的心包組織（大小為4～5 cm2），脫細胞溶解后直接注射至大鼠左心室心肌內，45 min后即成膠，2周后注射部位出現新生小動脈，并有骨髓衍生肝干細胞的遷移生長，提示心包可作為治療心肌梗死的自體水凝膠材料來源。脂肪是人體含量最多的組織類型，來源豐富，通過抽脂術即可獲取。Young等[47]將人抽脂術獲得的脂肪進行脫細胞處理，得到的白色基質粉末在室溫下用胃蛋白酶充分溶解，調節pH值為7.4，置于37℃、5%CO2細胞培養箱中形成凝膠，注射至裸鼠皮下，能快速在生理條件下形成水凝膠。經脫細胞脫脂鑒定結果表明，該方法不但脫細胞完全，而且保留了基質中的膠原、糖胺聚糖及多肽等多種成分；接種細胞培養1、7、14 d，活死細胞染色及DNA定量分析顯示，該水凝膠能支持人脂肪MSCs的黏附生長。由此可見，自體脂肪脫細胞基質水凝膠可能成為自體軟組織填充的理想材料。此外，人胎盤也可作為自體脫細胞基質水凝膠的組織來源，胎盤富含ECM及基膜成分，可通過豐富血管網采用灌注法脫細胞，同時其獲取還不存在供區損傷[52]。
3 總結與展望
目前組織工程支架材料種類繁多，生物來源水凝膠以其獨特優勢應用日趨廣泛，但仍存在以下問題及挑戰：① 細胞生長環境是動態變化的，細胞改造ECM的分子機制及兩者之間的動態平衡有待進一步明確，從而指導設計出更加合理的支架材料[1, 6-7]。② 脫細胞基質水凝膠制備第一步為通過各種理化方法去除所有細胞和核物質，而不同種屬不同組織的脫細胞效果存在差異，因此有待探索高效合理的脫細胞方法[53]。③ 生物來源水凝膠往往機械性能弱、降解快，目前主要采用交聯或添加合成成分來解決這一不足，但常用的化學交聯劑存在細胞毒性，因此需尋找安全無毒的交聯劑。④ 再生組織的血管化仍是生物來源水凝膠在組織工程研究中面臨的關鍵問題之一[20]。有學者在凝膠中加入血管生成因子，取得了一定效果，但如何根據組織特異性添加血管生成因子，如何設計動態可持續釋放的凝膠體系，有待進一步明確。⑤ 目前生物來源水凝膠材料的滅菌方法可行性及效果均欠佳，需要進一步研究。⑥ 目前生物來源水凝膠的原料主要來自異種/同種異體組織，可能存在種屬/個體差異、免疫原性及疾病傳播風險，如應用于臨床，還需解決安全穩定的產業化來源問題。
盡管生物來源水凝膠材料的研究和應用還面臨諸多困難，但隨著組織工程技術發展，有望獲得理想的生物來源水凝膠材料，并最終應用于臨床。