引用本文： 高天喜, 常會敏, 范敏杰, 盧曉云, 王正輝, 張向紅, 井曉紅, 史艷霞, 李智慧. 聚羥基脂肪酸酯的生物修飾及其生物相容性研究. 中國修復重建外科雜志, 2014, 28(8): 1023-1029. doi: 10.7507/1002-1892.20140224 復制
聚羥基脂肪酸酯（polyhydroxyalkanoates，PHAs）是一類存在于微生物細胞中的天然生物材料，由微生物在不平衡條件下發酵產生。它是一種強疏水材料，其表面疏水性會影響材料與細胞之間的生物相容性，因此學者們常采用紫外線、等離子、臭氧等表面修飾方法對其進行表面改性，但這些方法均會改變材料原有性能[1-4]。相對于PHAs家族的其他成員，聚羥基丁酸戊酸酯[poly（3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate），PHBV]和聚羥基丁酸己酸酯[poly（3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyhexanoate），PHBHHx]具有更好的生物相容性、機械強度和降解速率可控[5-8]。精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（Arg-Gly-Asp，RGD）肽屬于細胞信號黏附肽，能有效提高細胞與生物材料間的黏附。有研究將RGD肽引入PHBV三維支架中，在不干擾原有生物素結合性能的情況下，提高了材料的細胞識別性和生物相容性[9]。還有研究將PHA表面顆粒結合蛋白（polyhydroxyalkanoates granule binding protein，PhaP）（兩親性蛋白）與RGD肽（PhaP-RGD）融合并修飾PHA，結果顯示材料與成纖維細胞的生物相容性顯著提高[10]。目前，關于PhaP-RGD融合蛋白修飾的PHBV和PHBHHx對人軟骨細胞的影響罕見報道。為此，本實驗通過制備PHBV和PHBHHx生物膜材料，并進行PhaP-RGD融合蛋白修飾，然后將人鼻中隔軟骨細胞分別接種于修飾后的材料上進行體外培養，觀察細胞生長情況，旨在明確經PhaP-RGD融合蛋白修飾能否提高PHBV和PHBHHx與軟骨細胞之間的生物相容性。
1 材料與方法
1.1 實驗材料及主要試劑、儀器
PHBV（寧波天安生物材料有限公司）；PHBHHx（清華大學陳國教授惠贈）； PhaP-RGD質粒由西安交通大學生命科學與技術學院構建；E.coli BL21 （DE3）菌株由西安交通大學生命科學與技術學院王一理教授惠贈。人鼻中隔軟骨由西安交通大學醫學院第二附屬醫院耳鼻咽喉-頭頸外科行功能性鼻內鏡術患者自愿捐贈。
FBS（Invitrogen公司，美國）；H-DMEM培養液（HyClone公司，美國）；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷 （isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside，ITPG）、鎳柱純化試劑盒（大連Takara公司）。接觸角測量儀（承德鼎盛試驗機檢測設備有限公司）；酶標儀（Thermo Scientific公司，美國）；倒置相差顯微鏡（Nikon公司，日本）；掃描電鏡（日本電子公司）。
1.2 人鼻中隔軟骨細胞分離及培養
參照文獻[11-13]方法分離培養人鼻中隔軟骨細胞。取鼻中隔軟骨，無菌生理鹽水沖洗3次，剝除軟骨表面筋膜，眼科剪剪成直徑2 mm碎塊置于培養皿，加入0.05%透明質酸酶5 mL，37℃于低速離心機以離心半徑11 cm、200 r/min消化30 min；加入0.25%胰蛋白酶5 mL，37℃以離心半徑11 cm、200 r/min消化30 min；加入0.2%膠原酶Ⅱ5 mL，37℃以離心半徑11 cm、220 r/min消化2 h。消化停止后篩網過濾，以離心半徑11 cm、1 500 r/min離心5 min；棄上清，以含10%FBS的H-DMEM培養基重懸細胞，置于37℃、5%CO2及飽和濕度培養箱中培養。48 h后更換培養液，以后每2天換液1次。倒置相差顯微鏡下觀察細胞生長情況。1 周后待細胞生長融合達90%，以0.5%胰蛋白酶消化，按1∶2比例傳代。取第2代細胞進行后續實驗。
1.3 生物膜材料制備
1.3.1 PhaP-RGD融合蛋白的表達純化
通過重組大腸桿菌E.coli BL21（DE3）菌株表達PhaP-RGD融合蛋白，具體操作步驟：取含有重組基因PhaP-RGD質粒的E.coli BL21 （DE3）菌株100 μL接種至10 mL LB培養基（含5 mg/mL氨芐青霉素），在恒溫搖床37℃培養12 h；加入100 μL 24 mg/mL ITPG繼續培養5 h，誘導菌種表達融合蛋白。經SDS-PAGE驗證融合蛋白成功表達后，采用鎳柱純化試劑盒純化目標蛋白，并通過SDS-PAGE和Western blot進行驗證。同時以不含質粒的E.coli BL21（DE3）菌株作為對照。
1.3.2 生物膜材料制備
利用溶劑揮發法制備PHBV和PHBHHx生物膜材料。稱取5 g PHBV，溶解于100 mL氯仿中，蓋上保鮮膜，60℃水浴加熱1 h助溶；將充分溶解的溶液均勻鋪至10個直徑9 cm的玻璃培養板中；蓋上保鮮膜防止灰塵落入，針頭扎孔使其自然揮發，24～48 h后得到PHBV生物膜材料。同法制備PHBHHx生物膜材料。掃描電鏡觀察生物膜材料結構及孔徑。
1.3.3 PhaP-RGD融合蛋白修飾
參照文獻[10]方法，將PHBV和PHBHHx生物膜材料浸泡在3.5 mg/ mL PhaP-RGD融合蛋白溶液中，4℃孵育過夜；PBS沖洗材料表面未結合的蛋白。
1.3.4 生物膜材料接觸角測量
取修飾前、后兩種生物膜材料，裁剪成8 mm × 8 mm大小；修飾后的生物膜材料測量前用純水沖洗并用濾紙吸干材料表面水分。將材料用雙面膠固定于接觸角測量儀樣品臺，表面滴加10 μL純水，選擇適當區域測量接觸角。接觸角越小說明材料的親水性越好。
1.4 生物相容性觀測
1.4.1 實驗分組及方法
取修飾前、后兩種生物膜材料，裁剪成8 mm × 8 mm大小，75%乙醇浸泡過夜，紫外線照射正、反面各1 h，PBS沖洗。加入含10%FBS的H-DMEM培養基預培養過夜。吸棄上清及材料表面培養基，取生長狀態良好的第2代人鼻中隔軟骨細胞，以2 ×107個/cm2細胞密度均勻滴加于修飾前、后的PHBV和PHBHHx生物膜材料表面（分別為A1、A2以及B1、B2組），加入含10%FBS的H-DMEM培養基，置于37℃、5%CO2及飽和濕度培養箱中培養。另取軟骨細胞以2 ×107 個/cm2細胞密度接種于48孔板，作為對照（C組）。
1.4.2 檢測指標
① 熒光顯微鏡觀察細胞增殖情況：各組細胞培養3 d，4%多聚甲醛固定30 min，PBS漂洗3次；DAPI染色5 min，PBS漂洗3次；載玻片上滴加2 μL甘油，使生物膜材料固定于載玻片上；熒光顯微鏡下觀察軟骨細胞增殖情況。
② MTT檢測細胞增殖：各組細胞培養后3、7 d，C組每孔加入200 μL MTT溶液（0.5 mg/mL），繼續培養2～4 h；棄培養基，每孔加入200 μL DMSO置搖床上震蕩10 min，酶標儀測定492 nm波長處吸光度（A）值。A1、A2、B1、B2組每孔加入200 μL MTT溶液（0.5 mg/ mL），繼續培養2～4 h；棄培養基；將48孔板中的生物膜材料迅速移至新的48孔板內，長有細胞的一面朝上；A值測量方法同C組。
③ 甲苯胺藍染色觀察：A1、A2、B1、B2組培養7 d 后，取生物膜材料PBS洗2次，4%多聚甲醛固定1 h（4℃）；自來水洗5 min，蒸餾水洗5 min；加1%甲苯胺藍浸染2 h；除去多余染液，光鏡下觀察生物膜材料表面著色情況。以單純修飾后的PHBV和PHBHHx生物膜材料作為對照。
④ 掃描電鏡觀察：A1、A2、B1、B2組培養7 d后，取生物膜材料置于2.5%戊二醛固定液，4℃前固定2 h，0.1 mol/L PBS浸洗10 min，1%四氧化鋨固定液4℃固定2 h，0.1 mol/L PBS浸洗10 min，梯度乙醇脫水，乙酸異戊酯處理10 min，臨界點干燥，噴金，掃描電鏡下觀察超微結構。
1.5 統計學方法
采用SPSS16.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，兩種材料接觸角及各組組內兩時間點間A值比較采用t檢驗；組間A值比較采用方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 人鼻中隔軟骨細胞形態學觀察
倒置相差顯微鏡觀察示，原代軟骨細胞呈圓形，折光性較強（圖 1 a）；2 d后完全貼壁（圖 1 b）；3 d后細胞開始出現伸展，由梭形逐漸變為規則三角形或多角形，細胞質中有圓形致密顆粒（圖 1 c）；第2代軟骨細胞呈多角形（圖 1 d）。
圖1
人鼻中隔軟骨細胞形態學觀察（倒置相差顯微鏡× 4） ? 原代細胞培養2 h ? 原代細胞培養2 d ? 原代細胞培養7 d ? 第2代細胞 ? ?2.2 PhaP-RGD融合蛋白的誘導表達與純化鑒定
SDS-PAGE和Western blot檢測示，經IPTG誘導表達后，含重組基因PhaP-RGD質粒的E.coli BL21 （DE3）菌株的總蛋白中，在相對分子質量為10 ×103～15 ×103之間有大量蛋白條帶表達，與預測蛋白大小（14 ×103）相符，表明成功表達目標蛋白PhaP-RGD（圖 2）。在驗證目標蛋白正確的基礎上，利用鎳柱純化目標蛋白，經SDS-PAGE和Western blot驗證提示，純化后得到條帶均一的目標融合蛋白溶液（圖 3）。
2.3 生物膜材料觀察
2.3.1 掃描電鏡觀察
溶劑揮發法制備的PHBV和PHBHHx生物膜材料表面粗糙；PHBV結構致密，孔徑較小；PHBHHx結構疏松，孔徑較大。見圖 4。
2.3.2 接觸角測量
未經修飾的PHBV、PHBHHx生物膜材料接觸角分別為（102.03 ± 0.46）、（98.76 ± 0.55）°；修飾后接觸角分別為（6.91 ± 0.30）、（10.70 ± 0.39）°，較修飾前顯著減小，差異均有統計學意義（t=390.877，P=0.000；t=953.277，P=0.000）。
2.4 生物相容性觀察
2.4.1 軟骨細胞增殖情況
培養3 d，DAPI染色示，與C、A1、A2組相比，B1、B2組細胞數較多，其中B2組最顯著；C、A1、A2組軟骨細胞數相似。見圖 5。
圖5
培養3 d熒光顯微鏡觀察各組細胞增殖情況（DAPI ×10） ? A1組 ? A2組 ? B1組 ? B2組 ? C組 ? ?MTT法檢測示，組內比較：各組7 d A值均較3 d顯著提高（P＜ 0.05）；組間比較：3 d時，B2組A值明顯高于其他組，比較差異均有統計學意義（P＜ 0.05）；7 d時，B1、B2組高于A1、A2、C組，差異均有統計學意義（P＜ 0.05）；B2組高于B1組，A1組高于A2組，差異均有統計學意義（P＜ 0.05）。見表 1。
表1
培養3、7 d各組A值比較（n=3，2.4.2 甲苯胺藍染色
培養7 d，鏡下見單純PHBV和PHBHHx生物膜材料均未見藍色異染； A1、A2、B1、B2組材料表面均可見藍色異染，其中A1、A2組藍色異染程度相似，B2組較B1組深（圖 6）。
2.4.3 掃描電鏡觀察
培養7 d掃描電鏡觀察示，各組材料上的細胞均呈軟骨細胞正常形態，細胞之間形成連接，開始融合，部分細胞向膜表面的孔隙內生長，甚至跨越孔隙（圖 7）。
3 討論
PHAs家族因與多種細胞有較好的生物相容性和生物可降解性，已作為支架材料廣泛應用于組織工程研究。溶劑揮發法制備膜基質材料是一種常用的高分子材料制備方法[14]，本研究采用該方法成功制備PHBV和PHBHHx生物膜材料，掃描電鏡觀察示材料表面粗糙，呈多孔結構，有利于細胞生長。但由于PHBV和PHBHHx的聚酯材料特性，其表面仍存在較強疏水性，不利于細胞貼附[15]。根據既往研究[9-10]結果，我們選擇PhaP-RGD融合蛋白修飾PHBV和PHBHHx，接觸角測量結果顯示，修飾后兩種材料表面親水性均較修飾前顯著提高，進一步提示采用PhaP-RGD融合蛋白生物修飾是提高PHAs材料表面親水性的有效方法。
軟骨細胞聯合生物支架材料移植治療耳鼻咽喉部軟骨缺損，已成為軟骨缺損修復領域新的研究熱點。理想的組織工程支架材料必須與其負載的軟骨細胞有良好相容性，既無細胞毒性，也不影響細胞功能。學者們嘗試采用PHAs家族中多個成員，包括PHB、PHBV、PHBHHx，作為組織工程骨、軟骨的支架材料[16-19]，其中PHBHHx顯示出與軟骨細胞良好相容性。You等[20]將PHBHHx作為支架材料與BMSCs共培養，結果顯示該材料具有低細胞毒性，并能夠誘導BMSCs向軟骨細胞分化。本研究結果顯示，PHBHHx生物膜材料經PhaP-RGD融合蛋白修飾后，可促進軟骨細胞的貼附生長，且隨培養時間延長，材料表面的軟骨細胞活力及細胞增殖能力也有所提高。而經PhaP-RGD融合蛋白修飾后的PHBV生物膜材料，其與軟骨細胞的生物相容性無顯著提高，分析原因可能是細胞接種過程中因材料表面不平整造成了細胞流失。但也有研究表明生物膜材料表面的親水性與其細胞生物相容性并不成正相關，只有材料表面疏水、親水達到平衡時，材料與細胞間的相容性才達最佳[21]。
Ⅱ型膠原和糖胺多糖是正常軟骨細胞合成分泌的兩大特征性細胞外基質[22-24]。本研究采用甲苯胺藍染色觀察糖胺多糖分泌情況，結果顯示各實驗組材料表面均可見不同程度異染；PhaP-RGD融合蛋白修飾前后PHBV材料表面異染程度差別不明顯，但修飾后的PHBHHx生物膜材料藍染較修飾前深。提示經PhaP-RGD融合蛋白修飾的PHBHHx生物膜材料能更好促進軟骨細胞分泌細胞外基質。但本研究僅進行了糖胺多糖分泌觀察，下一步將采用免疫組織化學染色方法定量檢測 Ⅱ型膠原分泌情況，并分析細胞在支架上軟骨特征性表型維持情況，為后續動物體內植入實驗奠定理論基礎。
綜上述，經PhaP-RGD融合蛋白修飾后，PHBHHx生物膜材料表面親水性增強，并提高了與軟骨細胞的相容性，為下一步作為支架材料構建組織工程軟骨奠定了實驗基礎。
聚羥基脂肪酸酯（polyhydroxyalkanoates，PHAs）是一類存在于微生物細胞中的天然生物材料，由微生物在不平衡條件下發酵產生。它是一種強疏水材料，其表面疏水性會影響材料與細胞之間的生物相容性，因此學者們常采用紫外線、等離子、臭氧等表面修飾方法對其進行表面改性，但這些方法均會改變材料原有性能[1-4]。相對于PHAs家族的其他成員，聚羥基丁酸戊酸酯[poly（3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate），PHBV]和聚羥基丁酸己酸酯[poly（3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyhexanoate），PHBHHx]具有更好的生物相容性、機械強度和降解速率可控[5-8]。精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（Arg-Gly-Asp，RGD）肽屬于細胞信號黏附肽，能有效提高細胞與生物材料間的黏附。有研究將RGD肽引入PHBV三維支架中，在不干擾原有生物素結合性能的情況下，提高了材料的細胞識別性和生物相容性[9]。還有研究將PHA表面顆粒結合蛋白（polyhydroxyalkanoates granule binding protein，PhaP）（兩親性蛋白）與RGD肽（PhaP-RGD）融合并修飾PHA，結果顯示材料與成纖維細胞的生物相容性顯著提高[10]。目前，關于PhaP-RGD融合蛋白修飾的PHBV和PHBHHx對人軟骨細胞的影響罕見報道。為此，本實驗通過制備PHBV和PHBHHx生物膜材料，并進行PhaP-RGD融合蛋白修飾，然后將人鼻中隔軟骨細胞分別接種于修飾后的材料上進行體外培養，觀察細胞生長情況，旨在明確經PhaP-RGD融合蛋白修飾能否提高PHBV和PHBHHx與軟骨細胞之間的生物相容性。
1 材料與方法
1.1 實驗材料及主要試劑、儀器
PHBV（寧波天安生物材料有限公司）；PHBHHx（清華大學陳國教授惠贈）； PhaP-RGD質粒由西安交通大學生命科學與技術學院構建；E.coli BL21 （DE3）菌株由西安交通大學生命科學與技術學院王一理教授惠贈。人鼻中隔軟骨由西安交通大學醫學院第二附屬醫院耳鼻咽喉-頭頸外科行功能性鼻內鏡術患者自愿捐贈。
FBS（Invitrogen公司，美國）；H-DMEM培養液（HyClone公司，美國）；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷 （isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside，ITPG）、鎳柱純化試劑盒（大連Takara公司）。接觸角測量儀（承德鼎盛試驗機檢測設備有限公司）；酶標儀（Thermo Scientific公司，美國）；倒置相差顯微鏡（Nikon公司，日本）；掃描電鏡（日本電子公司）。
1.2 人鼻中隔軟骨細胞分離及培養
參照文獻[11-13]方法分離培養人鼻中隔軟骨細胞。取鼻中隔軟骨，無菌生理鹽水沖洗3次，剝除軟骨表面筋膜，眼科剪剪成直徑2 mm碎塊置于培養皿，加入0.05%透明質酸酶5 mL，37℃于低速離心機以離心半徑11 cm、200 r/min消化30 min；加入0.25%胰蛋白酶5 mL，37℃以離心半徑11 cm、200 r/min消化30 min；加入0.2%膠原酶Ⅱ5 mL，37℃以離心半徑11 cm、220 r/min消化2 h。消化停止后篩網過濾，以離心半徑11 cm、1 500 r/min離心5 min；棄上清，以含10%FBS的H-DMEM培養基重懸細胞，置于37℃、5%CO2及飽和濕度培養箱中培養。48 h后更換培養液，以后每2天換液1次。倒置相差顯微鏡下觀察細胞生長情況。1 周后待細胞生長融合達90%，以0.5%胰蛋白酶消化，按1∶2比例傳代。取第2代細胞進行后續實驗。
1.3 生物膜材料制備
1.3.1 PhaP-RGD融合蛋白的表達純化
通過重組大腸桿菌E.coli BL21（DE3）菌株表達PhaP-RGD融合蛋白，具體操作步驟：取含有重組基因PhaP-RGD質粒的E.coli BL21 （DE3）菌株100 μL接種至10 mL LB培養基（含5 mg/mL氨芐青霉素），在恒溫搖床37℃培養12 h；加入100 μL 24 mg/mL ITPG繼續培養5 h，誘導菌種表達融合蛋白。經SDS-PAGE驗證融合蛋白成功表達后，采用鎳柱純化試劑盒純化目標蛋白，并通過SDS-PAGE和Western blot進行驗證。同時以不含質粒的E.coli BL21（DE3）菌株作為對照。
1.3.2 生物膜材料制備
利用溶劑揮發法制備PHBV和PHBHHx生物膜材料。稱取5 g PHBV，溶解于100 mL氯仿中，蓋上保鮮膜，60℃水浴加熱1 h助溶；將充分溶解的溶液均勻鋪至10個直徑9 cm的玻璃培養板中；蓋上保鮮膜防止灰塵落入，針頭扎孔使其自然揮發，24～48 h后得到PHBV生物膜材料。同法制備PHBHHx生物膜材料。掃描電鏡觀察生物膜材料結構及孔徑。
1.3.3 PhaP-RGD融合蛋白修飾
參照文獻[10]方法，將PHBV和PHBHHx生物膜材料浸泡在3.5 mg/ mL PhaP-RGD融合蛋白溶液中，4℃孵育過夜；PBS沖洗材料表面未結合的蛋白。
1.3.4 生物膜材料接觸角測量
取修飾前、后兩種生物膜材料，裁剪成8 mm × 8 mm大小；修飾后的生物膜材料測量前用純水沖洗并用濾紙吸干材料表面水分。將材料用雙面膠固定于接觸角測量儀樣品臺，表面滴加10 μL純水，選擇適當區域測量接觸角。接觸角越小說明材料的親水性越好。
1.4 生物相容性觀測
1.4.1 實驗分組及方法
取修飾前、后兩種生物膜材料，裁剪成8 mm × 8 mm大小，75%乙醇浸泡過夜，紫外線照射正、反面各1 h，PBS沖洗。加入含10%FBS的H-DMEM培養基預培養過夜。吸棄上清及材料表面培養基，取生長狀態良好的第2代人鼻中隔軟骨細胞，以2 ×107個/cm2細胞密度均勻滴加于修飾前、后的PHBV和PHBHHx生物膜材料表面（分別為A1、A2以及B1、B2組），加入含10%FBS的H-DMEM培養基，置于37℃、5%CO2及飽和濕度培養箱中培養。另取軟骨細胞以2 ×107 個/cm2細胞密度接種于48孔板，作為對照（C組）。
1.4.2 檢測指標
① 熒光顯微鏡觀察細胞增殖情況：各組細胞培養3 d，4%多聚甲醛固定30 min，PBS漂洗3次；DAPI染色5 min，PBS漂洗3次；載玻片上滴加2 μL甘油，使生物膜材料固定于載玻片上；熒光顯微鏡下觀察軟骨細胞增殖情況。
② MTT檢測細胞增殖：各組細胞培養后3、7 d，C組每孔加入200 μL MTT溶液（0.5 mg/mL），繼續培養2～4 h；棄培養基，每孔加入200 μL DMSO置搖床上震蕩10 min，酶標儀測定492 nm波長處吸光度（A）值。A1、A2、B1、B2組每孔加入200 μL MTT溶液（0.5 mg/ mL），繼續培養2～4 h；棄培養基；將48孔板中的生物膜材料迅速移至新的48孔板內，長有細胞的一面朝上；A值測量方法同C組。
③ 甲苯胺藍染色觀察：A1、A2、B1、B2組培養7 d 后，取生物膜材料PBS洗2次，4%多聚甲醛固定1 h（4℃）；自來水洗5 min，蒸餾水洗5 min；加1%甲苯胺藍浸染2 h；除去多余染液，光鏡下觀察生物膜材料表面著色情況。以單純修飾后的PHBV和PHBHHx生物膜材料作為對照。
④ 掃描電鏡觀察：A1、A2、B1、B2組培養7 d后，取生物膜材料置于2.5%戊二醛固定液，4℃前固定2 h，0.1 mol/L PBS浸洗10 min，1%四氧化鋨固定液4℃固定2 h，0.1 mol/L PBS浸洗10 min，梯度乙醇脫水，乙酸異戊酯處理10 min，臨界點干燥，噴金，掃描電鏡下觀察超微結構。
1.5 統計學方法
采用SPSS16.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，兩種材料接觸角及各組組內兩時間點間A值比較采用t檢驗；組間A值比較采用方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 人鼻中隔軟骨細胞形態學觀察
倒置相差顯微鏡觀察示，原代軟骨細胞呈圓形，折光性較強（圖 1 a）；2 d后完全貼壁（圖 1 b）；3 d后細胞開始出現伸展，由梭形逐漸變為規則三角形或多角形，細胞質中有圓形致密顆粒（圖 1 c）；第2代軟骨細胞呈多角形（圖 1 d）。
圖1
人鼻中隔軟骨細胞形態學觀察（倒置相差顯微鏡× 4） ? 原代細胞培養2 h ? 原代細胞培養2 d ? 原代細胞培養7 d ? 第2代細胞 ? ?2.2 PhaP-RGD融合蛋白的誘導表達與純化鑒定
SDS-PAGE和Western blot檢測示，經IPTG誘導表達后，含重組基因PhaP-RGD質粒的E.coli BL21 （DE3）菌株的總蛋白中，在相對分子質量為10 ×103～15 ×103之間有大量蛋白條帶表達，與預測蛋白大小（14 ×103）相符，表明成功表達目標蛋白PhaP-RGD（圖 2）。在驗證目標蛋白正確的基礎上，利用鎳柱純化目標蛋白，經SDS-PAGE和Western blot驗證提示，純化后得到條帶均一的目標融合蛋白溶液（圖 3）。
2.3 生物膜材料觀察
2.3.1 掃描電鏡觀察
溶劑揮發法制備的PHBV和PHBHHx生物膜材料表面粗糙；PHBV結構致密，孔徑較小；PHBHHx結構疏松，孔徑較大。見圖 4。
2.3.2 接觸角測量
未經修飾的PHBV、PHBHHx生物膜材料接觸角分別為（102.03 ± 0.46）、（98.76 ± 0.55）°；修飾后接觸角分別為（6.91 ± 0.30）、（10.70 ± 0.39）°，較修飾前顯著減小，差異均有統計學意義（t=390.877，P=0.000；t=953.277，P=0.000）。
2.4 生物相容性觀察
2.4.1 軟骨細胞增殖情況
培養3 d，DAPI染色示，與C、A1、A2組相比，B1、B2組細胞數較多，其中B2組最顯著；C、A1、A2組軟骨細胞數相似。見圖 5。
圖5
培養3 d熒光顯微鏡觀察各組細胞增殖情況（DAPI ×10） ? A1組 ? A2組 ? B1組 ? B2組 ? C組 ? ?MTT法檢測示，組內比較：各組7 d A值均較3 d顯著提高（P＜ 0.05）；組間比較：3 d時，B2組A值明顯高于其他組，比較差異均有統計學意義（P＜ 0.05）；7 d時，B1、B2組高于A1、A2、C組，差異均有統計學意義（P＜ 0.05）；B2組高于B1組，A1組高于A2組，差異均有統計學意義（P＜ 0.05）。見表 1。
表1
培養3、7 d各組A值比較（n=3，2.4.2 甲苯胺藍染色
培養7 d，鏡下見單純PHBV和PHBHHx生物膜材料均未見藍色異染； A1、A2、B1、B2組材料表面均可見藍色異染，其中A1、A2組藍色異染程度相似，B2組較B1組深（圖 6）。
2.4.3 掃描電鏡觀察
培養7 d掃描電鏡觀察示，各組材料上的細胞均呈軟骨細胞正常形態，細胞之間形成連接，開始融合，部分細胞向膜表面的孔隙內生長，甚至跨越孔隙（圖 7）。
3 討論
PHAs家族因與多種細胞有較好的生物相容性和生物可降解性，已作為支架材料廣泛應用于組織工程研究。溶劑揮發法制備膜基質材料是一種常用的高分子材料制備方法[14]，本研究采用該方法成功制備PHBV和PHBHHx生物膜材料，掃描電鏡觀察示材料表面粗糙，呈多孔結構，有利于細胞生長。但由于PHBV和PHBHHx的聚酯材料特性，其表面仍存在較強疏水性，不利于細胞貼附[15]。根據既往研究[9-10]結果，我們選擇PhaP-RGD融合蛋白修飾PHBV和PHBHHx，接觸角測量結果顯示，修飾后兩種材料表面親水性均較修飾前顯著提高，進一步提示采用PhaP-RGD融合蛋白生物修飾是提高PHAs材料表面親水性的有效方法。
軟骨細胞聯合生物支架材料移植治療耳鼻咽喉部軟骨缺損，已成為軟骨缺損修復領域新的研究熱點。理想的組織工程支架材料必須與其負載的軟骨細胞有良好相容性，既無細胞毒性，也不影響細胞功能。學者們嘗試采用PHAs家族中多個成員，包括PHB、PHBV、PHBHHx，作為組織工程骨、軟骨的支架材料[16-19]，其中PHBHHx顯示出與軟骨細胞良好相容性。You等[20]將PHBHHx作為支架材料與BMSCs共培養，結果顯示該材料具有低細胞毒性，并能夠誘導BMSCs向軟骨細胞分化。本研究結果顯示，PHBHHx生物膜材料經PhaP-RGD融合蛋白修飾后，可促進軟骨細胞的貼附生長，且隨培養時間延長，材料表面的軟骨細胞活力及細胞增殖能力也有所提高。而經PhaP-RGD融合蛋白修飾后的PHBV生物膜材料，其與軟骨細胞的生物相容性無顯著提高，分析原因可能是細胞接種過程中因材料表面不平整造成了細胞流失。但也有研究表明生物膜材料表面的親水性與其細胞生物相容性并不成正相關，只有材料表面疏水、親水達到平衡時，材料與細胞間的相容性才達最佳[21]。
Ⅱ型膠原和糖胺多糖是正常軟骨細胞合成分泌的兩大特征性細胞外基質[22-24]。本研究采用甲苯胺藍染色觀察糖胺多糖分泌情況，結果顯示各實驗組材料表面均可見不同程度異染；PhaP-RGD融合蛋白修飾前后PHBV材料表面異染程度差別不明顯，但修飾后的PHBHHx生物膜材料藍染較修飾前深。提示經PhaP-RGD融合蛋白修飾的PHBHHx生物膜材料能更好促進軟骨細胞分泌細胞外基質。但本研究僅進行了糖胺多糖分泌觀察，下一步將采用免疫組織化學染色方法定量檢測 Ⅱ型膠原分泌情況，并分析細胞在支架上軟骨特征性表型維持情況，為后續動物體內植入實驗奠定理論基礎。
綜上述，經PhaP-RGD融合蛋白修飾后，PHBHHx生物膜材料表面親水性增強，并提高了與軟骨細胞的相容性，為下一步作為支架材料構建組織工程軟骨奠定了實驗基礎。
