引用本文： 呂涵寧, 徐國嬌, 蓋昱辛, 陳禮, 劉舒云, 趙鵬, 盧世璧, 張莉, 郭全義, 楊建華. 軟骨細胞復合人臍帶Wharton膠取向支架的體外評估. 中國修復重建外科雜志, 2014, 28(8): 1017-1022. doi: 10.7507/1002-1892.20140223 復制
關節軟骨無血管、神經支配及淋巴回流，損傷后再生能力有限。組織工程技術的興起為關節軟骨損傷修復帶來了希望。近年有研究發現[1]，臍帶Wharton膠富含透明質酸、糖胺聚糖及膠原等成分，是一種無血管、神經支配及淋巴回流的組織，且臍帶Wharton膠富有彈性以保護臍帶血管，無論在成分、結構和功能上均與軟骨組織類似[2-3]，表明臍帶Wharton膠組織可能是一種較好的軟骨組織工程支架材料來源[4]。本實驗通過制備人臍帶Wharton膠取向支架，體外評估軟骨細胞與支架材料的親和性、生物相容性，以及支架的取向性結構對細胞黏附、生長排列的影響，探討人臍帶Wharton膠取向支架在軟骨組織工程中應用的可行性。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
健康成年新西蘭大白兔8只，雌雄不限，體重2.5～3.0 kg，購于解放軍總醫院醫學實驗動物中心，對動物的處理符合《關于善待動物的指導性意見》。正常臍帶組織由解放軍總醫院婦產科足月健康產婦自愿捐贈。
PKH26細胞熒光標記試劑盒、H-DMEM培養基、Ⅱ型膠原酶、L-脯氨酸、Hoechst33258、Triton X-100溶液、N-羥基琥珀酰亞胺（N-hydroxysul-fosuccinimide sodium salt，NHS）、胰蛋白酶（Sigma公司，美國）；速新眠Ⅱ 號（戊巴比妥鈉注射液；北京軍事醫學科學院）；氯胺酮注射液（華北制藥集團有限責任公司）；標準FBS、非必須氨基酸（nonessential amino acid，NEAA；HyClone公司，美國）；Ⅱ型膠原鼠抗人多克隆抗體（北京世安科興科技開發技術有限公司）；Ⅱ型膠原鼠抗人單克隆抗體（Santa Cruz公司，美國）；辣根過氧化酶標記的山羊抗小鼠 IgG（北京中杉金橋生物技術有限公司）；碳化二亞胺、甲苯胺藍、番紅O（北京化學試劑公司）。
細胞培養板、培養瓶、離心管（Corning costar公司，美國）；Zeiss不銹鋼濾器（上海醫療器械廠）； 噴金鍍膜機（Denton Vacuum Desk-Ⅱ 公司，美國）；85-2型恒溫磁力攪拌器（江蘇常州國華儀器公司）；BB5060型CO2培養箱（Heraeus公司，德國）；BH-2型倒置顯微鏡、Ⅸ70型熒光顯微鏡（Olympus公司，日本）；JSM-6700F 型掃描電鏡（JEOL公司，日本）。
1.2 軟骨細胞分離培養及鑒定
1.2.1 軟骨細胞分離培養及傳代
取新西蘭大白兔，用氯胺酮與速眠新Ⅱ號按1∶1（V/V）比例肌肉注射（0.5 mL/ kg）麻醉，側臥位固定于實驗臺，無菌條件下操作。顯露肩關節后用自制小刀片輕輕旋刮收集淺層軟骨組織，置于超凈工作臺內，D-Hank液沖洗3 次，清除表面血跡；吸盡D-Hank液，加入少許0.2%Ⅱ型膠原酶消化，眼科剪將關節軟骨塊剪成1 mm × 1 mm × 1 mm碎塊，再加入10 倍體積的0.2%Ⅱ型膠原酶，置于37℃、5%CO2培養箱內借助磁力攪拌器作用消化60～90 min，至消化液變渾濁，組織碎塊消失；將渾濁液用吸管移入無菌離心管，以離心半徑13.5 cm、1 500 r/min離心5 min；棄上清，沉淀再用30倍體積的D-Hank液同上法離心3次，軟骨細胞培養液（含2.97 g/L HEPES、0.05 g/L維生素C、0.046 g/L L-脯氨酸、1%ITS、1%NEAA的H-DMEM培養基）清洗1次；最后加入含20%FBS的軟骨細胞培養液置于37℃、5%CO2培養箱內培養[5]。每天倒置顯微鏡下觀察細胞貼壁生長情況，細胞多數貼壁后全量換液，除去未貼壁細胞和雜質，以后每3～4天全量換液。原代細胞融合達80%～90%時傳代培養。取第2代細胞用于實驗。
1.2.2 軟骨細胞鑒定
取生長融合的第2代軟骨細胞，Ⅱ型膠原酶消化后制備細胞爬片，行甲苯胺藍及Ⅱ型膠原免疫組織化學染色鑒定。① 甲苯胺藍染色：將細胞爬片用D-Hank液清洗2次，4%多聚甲醛固定15～20 min，滴加甲苯胺藍染色約10 min，水洗后光鏡下觀察。② Ⅱ型膠原免疫組織化學染色：將細胞爬片用D-Hank液清洗2次，4%多聚甲醛固定15～20 min，固定于載玻片上，0.1%Triton X-100打孔30 min，PBS沖洗；3%H2O2 15 min滅活內源性過氧化氫酶，PBS沖洗；羊血清封閉15 min，晾干；滴加1∶50Ⅱ型膠原鼠抗人單克隆抗體，濕盒內4℃過夜，PBS沖洗；滴加 50 μL辣根過氧化酶標記山羊抗小鼠IgG，室溫下孵育20 min。PBS漂洗5 min × 3次。濾紙拭去組織周圍PBS液，每張切片滴加50 μL DAB溶液顯色5 min，去離子水沖洗，倒置顯微鏡觀察。棕色染色為陽性表達。
1.2.3 細胞活力檢測
取生長融合的第2代軟骨細胞，用Ⅱ型膠原酶消化后接種至6孔板，加入含20%FBS的軟骨細胞培養液，待細胞貼壁融合達50%～60%時，用小鑷子將爬有軟骨細胞的蓋玻片取出，行二乙酰熒光素（fluorescein diacetate，FDA）-碘化丙啶（propidium iodide，PI）雙色熒光檢測法染色，熒光顯微鏡下觀察。活細胞呈綠色，死細胞呈紅色。
1.3 人臍帶Wharton膠取向支架的制備及表征
1.3.1 人臍帶Wharton膠納米級材料制備
取臍帶組織，浸泡于pH2.5酸性氧化電解質水溶液中初步滅菌3次，每次10 min；無菌條件下用眼科剪將臍帶組織從中間剖開，用有齒鑷剝離血管組織（2條動脈、1條靜脈），再剝離臍帶外膜組織，余下的膠組織用無菌蒸餾水沖洗3次，每次5 min；3%H2O2浸泡再次消毒滅菌30 min，無菌蒸餾水漂洗3次，每次30 min，即獲得Wharton膠。將Wharton膠放入粉碎機內，加2倍體積的無菌三蒸水，于- 5℃反復粉碎成含細胞的Wharton膠勻漿；加10倍體積的無菌三蒸水低滲混勻，將低滲含細胞Wharton膠勻漿再放入- 20℃中冷凍，于常溫融化，經3～4次凍融周期，再次使細胞膜破碎。采用梯度離心法，將粉碎混勻的勻漿經離心半徑13.5 cm、2 000 r/min離心20 min；取上清加入含1%Triton X-100、0.25%胰蛋白酶的Tris-HCl緩沖液中，輕輕攪拌，4℃洗脫24 h，經離心半徑13.5 cm、3 000 r/min離心20 min，取上層用DNase和RNase混合液37℃消化過夜；用蒸餾水沖洗48 h，4℃經離心半徑13.5 cm、6 000 r/ min離心15～20 min，反復5次，充分洗去細胞碎片和殘留物，洗至pH7.0；取上層勻漿，4℃經離心半徑13.5 cm、10 000 r/min離心40 min，棄上清，收集沉淀，即無細胞的納米級臍帶Wharton膠懸液，行掃描電鏡觀察。
1.3.2 人臍帶Wharton膠取向支架制備
將收集的人臍帶Wharton膠懸液用無菌PBS清洗，調整成濃度為3%（W/V）的混懸液，充分攪拌均勻，至無氣泡產生后注入聚乙烯圓筒模具中，垂直放置在不銹鋼板上，- 20℃預冷30 min；將凍結的混懸液從模具中取出，置入已預冷的冷凍干燥機升華干燥，48 h后形成支架取出。距光源5～10 cm處在258 nm波長紫外光照射下交聯8 h，再置于含有20 mmol/L NHS與50 mmol/L EDAC的95%（V/V）乙醇溶液中4℃交聯24 h。無菌PBS漂洗并浸泡2 h，無菌三蒸水漂洗，再次凍干，密封袋內貯存密封，60Co輻照消毒，4℃保存備用。
1.3.3 人臍帶Wharton膠取向支架的表征
① 大體觀察支架性狀。② 組織學及免疫組織化學染色觀察：取制備的人臍帶Wharton膠取向支架，OCT包埋，10 μm厚冰凍切片，丙酮固定10 min，分別行HE染色、番紅O染色及Ⅱ型膠原免疫組織化學染色。③ 掃描電鏡觀察：人臍帶Wharton膠取向支架噴金后，掃描電鏡觀察其結構特點，測量100倍視野下支架孔徑大小，測量100個孔徑，取均值。④ 支架吸水率測定：取出完全冷凍干燥的支架稱重記為W1；室溫條件下支架在去離子水中浸泡4 h，充分飽和達吸水平衡后取出，濾紙吸取支架表面多余液體，濕態下支架稱重記為W2；根據以下公式計算支架吸水率：（W2－W1）/W1 ×100%。測3個樣本，取均值。
1.4 細胞-支架復合培養及相關觀測
1.4.1 細胞-支架復合培養
取第2代軟骨細胞，經0.25%胰蛋白酶消化后，在培養瓶中分散成單個細胞懸液，調整細胞密度為1 ×107個/mL。將厚1 mm、直徑4 mm的人臍帶Wharton膠取向支架放入6孔培養板中，然后用1 mL注射器將20 μL細胞懸液（約2 ×105 個細胞）接種于該支架上，使支架完全浸透，然后置入37℃、5%CO2及飽和濕度培養箱中培養4 h，再在每孔加入2 mL軟骨細胞培養液繼續培養。
1.4.2 觀測指標
① 倒置顯微鏡觀察：培養3 d，取出細胞-支架復合物，PBS清洗，2.5%戊二醛4℃固定24 h，倒置顯微鏡下觀察細胞在支架上黏附情況。② 掃描電鏡觀察：培養7 d，取出細胞-支架復合物，PBS清洗、鋨酸固定、梯度乙醇脫水，冷凍干燥，上機噴金，掃描電鏡觀察軟骨細胞在支架上的黏附和分布情況。③ 組織學觀察：培養7 d，取出細胞-支架復合物，經OCT包埋，10 μm厚切片，丙酮固定10 min，分別行甲苯胺藍、番紅O染色，光鏡下觀察。④ 軟骨細胞在支架上的活力評估：培養3、7 d，取出細胞-支架復合物，行FDA-PI染色評估細胞活力；培養7 d取復合物，PBS漂洗，10 μm厚切片，行Hoechst33258染色觀察軟骨細胞在支架上的生長及分布情況。⑤ 體外熒光標記軟骨細胞與支架復合觀察：取第2代軟骨細胞，采用PKH26細胞熒光標記試劑盒進行軟骨細胞熒光標記，將熒光標記的軟骨細胞用含10%FBS的DMEM洗3次，離心收集細胞，調整細胞密度為4 ×107個/mL。同1.4.1方法將熒光標記軟骨細胞接種于臍帶Wharton膠取向支架，培養1 d熒光顯微鏡下觀察。
2 結果
2.1 軟骨細胞形態學觀察及鑒定
2.1.1 軟骨細胞形態學觀察
Ⅱ型膠原酶消化后大量單個細胞在培養基內于8～12 h貼壁，組織塊內細胞于2 d開始爬出、貼壁生長，多呈短梭形或多角形，伸長的突起向周圍展開；細胞核位于胞體中心，為圓形或橢圓形。隨培養時間延長，細胞密度越來越大，3 d時細胞形態呈多角形，似鵝卵石樣，立體感強，折光性好。原代細胞經0.25%胰蛋白酶消化為單個細胞后，細胞傳代一般4 h開始貼壁，8 h大部分貼壁，傳代細胞迅速呈小多角形鋪展開，且增殖迅速，立體感強，生長良好。見圖 1。
圖1
軟骨細胞形態學觀察 ? 原代細胞培養3 d（倒置顯微鏡×100） ? 第1代細胞培養5 d（倒置顯微鏡×100） ? 第2代細胞培養3 d（倒置顯微鏡× 200） ? ?2.1.2 軟骨細胞鑒定
甲苯胺藍染色示，軟骨細胞分泌的基質呈藍色，包繞細胞核，呈陽性；Ⅱ型膠原免疫組織化學染色示，軟骨細胞細胞質和分泌的基質被染成棕色，呈強陽性。見圖 2 a、b。
2.1.3 細胞活力檢測
軟骨細胞爬片FDA-PI染色示，細胞成活率達90%以上。見圖 2 c。
2.2 人臍帶Wharton膠取向支架的表征
① 大體觀察示，制備的人臍帶Wharton膠取向支架呈乳白色，直徑為4 mm。② 掃描電鏡觀察示，支架橫截面具有互相連通且分布均勻的多孔結構，有較高孔隙率，孔隙呈“蜂窩”狀；縱截面有相互交織且均勻一致、垂直取向排列的孔隙，形成平行排列的管狀結構。支架孔徑為（104 ± 30）μm。人臍帶Wharton膠懸液微絲直徑＜ 100 nm，為納米級。見圖 3。③ HE染色、番紅O染色及Ⅱ型膠原免疫組織化學染色均呈陽性。見圖 4。④ 支架吸水率為94.38% ± 0.19%。
2.3 細胞-支架復合物相關觀測
2.3.1 倒置顯微鏡及掃描電鏡觀察
培養3 d，倒置顯微鏡觀察示，細胞在支架孔隙內分布較均勻，呈圓形或橢圓形。培養7 d掃描電鏡觀察示，大量細胞黏附于支架孔隙間，呈圓形或橢圓形，且軟骨細胞分泌了細胞外基質；細胞沿取向孔道伸展排列，相互聚集，增殖旺盛，取向支架引導軟骨細胞垂直取向排列。見圖 5 a～c。
圖5
細胞-支架復合物觀察 ? 培養3 d倒置顯微鏡觀察（× 200） ? 培養7 d掃描電鏡觀察橫截面（×100） ? 培養7 d掃描電鏡觀察縱截面（×100） ? 培養7 d甲苯胺藍染色（× 200） ? 培養7 d番紅O染色（× 200） ? 培養3 d FDA-PI染色（× 200） ? 培養7 d Hoechst33258染色（×100） ? PKH26標記的軟骨細胞與支架復合培養1 d觀察（熒光顯微鏡× 200）
Figure5.
Observation of cell-scaffold complex ? Cells cultured for 3 days (Inverted microscope × 200) ? SEM observation of cross section of cell-scaffold complex cultured for 7 days (×100) ? SEM observation of longitudinal section of cell-scaffold complex cultured for 7 days (×100) ? Toluidine blue staining of cell-scaffold complex cultured for 7 days (× 200) ? Safranin O staining of cell-scaffold complex cultured for 7 days (× 200) ? FDA-PI staining of cell-scaffold complex cultured for 3 days (× 200) ? Hoechst33258 staining of cell-scaffold complex cultured for 7 days (×100) ? PKH26 labelled chondrocytes on cell-scaffold complex cultured for 1 day (Fluorescence microscope × 200)
2.3.2 組織學觀察
培養7 d，甲苯胺藍和番紅O染色均呈陽性，細胞在支架中分布均勻且增殖旺盛，細胞分泌大量細胞外基質；取向支架能引導細胞遷徙和增殖，并能有效保留和促進細胞外基質分泌。見圖 5 d～e。
2.3.3 軟骨細胞在支架上的活力評估
FDA-PI染色示，培養3 d支架上黏附的大部分細胞為活細胞，細胞成活率高達90%以上。培養7 d，Hoechst33258染色示細胞在支架內部分布均勻，增殖旺盛。見圖 5 f、 g。
2.3.4 熒光標記軟骨細胞與支架復合觀察
培養1 d 熒光顯微鏡觀察示，PKH26標記后的軟骨細胞呈紅色在支架上均勻分布，細胞沿支架孔隙分布。見圖 5 h。
3 討論
目前各種原因所致的軟骨損傷患者越來越多，由于軟骨無血管、神經，損傷后很難自愈，且加速損傷關節退變，最終多行人工關節置換術。近年軟骨組織工程的興起，為關節軟骨損傷修復帶來了新希望[6]。軟骨組織工程包括三大要素，即種子細胞、支架材料和細胞因子。本研究基于前期成功脫細胞提取人臍帶Wharton膠細胞外基質的經驗[7]并加以改進，取臍帶采用濕潤粉碎結合化學脫細胞技術脫細胞，利用冷凍干燥及交聯等技術制備人臍帶Wharton膠取向支架，并對支架進行初步表征，結果顯示該支架擁有天然軟骨的生化組成和形態結構特點，實現了軟骨組織工程支架在成分和形態結構上的雙重仿生。
值得注意的是：① 掃描電鏡觀察示，人臍帶Wharton膠懸液微絲為納米級結構。有研究表明[8-9]，具有納米級結構的支架材料非常有利于細胞黏附和增殖，同時對細胞分化也有促進作用。② 制備的取向支架不僅具有成分的仿生性，還具有形態結構的仿生性。研究表明[10-11]，人臍帶Wharton膠不僅具有臍帶組織成分，包括各種生長因子、透明質酸、GAGs以及膠原，流式細胞儀檢測還顯示表達干細胞標志物CD44、CD45、CD105、CD271。既往研究還表明人臍帶Wharton膠取向支架具有免疫原性低，植入兔體內無免疫排斥反應等優點[12]。
軟骨細胞是關節軟骨組織唯一的功能細胞，因此本實驗采用兔關節軟骨細胞復合人臍帶Wharton膠取向支架進行體外評估。對于關節軟骨組織而言，深層關節軟骨膠原纖維具有獨特的垂直于軟骨下骨取向排列，這種取向性影響著軟骨細胞的取向排列。本研究中，軟骨細胞與人臍帶Wharton膠取向支架復合培養3、7 d后，細胞在取向支架孔道內均勻分布，呈柱狀縱向垂直排列；甲苯胺藍和番紅O染色呈陽性。表明取向支架結構引導了軟骨細胞垂直取向排列，并能有效促進細胞外基質分泌[13]。FDA-PI染色和Hoechst33258染色結果顯示，軟骨細胞成活率高達90%以上，且增殖旺盛。表明人臍帶Wharton膠取向支架有利于軟骨細胞黏附和增殖，細胞在支架上成活率高。這種結構特點與關節軟骨非常相似，表明人臍帶Wharton膠取向支架具有良好的親和性和細胞相容性。
綜上述，本研究結果表明人臍帶Wharton膠取向支架具有與正常軟骨細胞外基質類似的組成成分和結構特征，能夠為種子細胞提供良好的生長和分化微環境，可能是一種較好的軟骨組織工程支架材料來源。
關節軟骨無血管、神經支配及淋巴回流，損傷后再生能力有限。組織工程技術的興起為關節軟骨損傷修復帶來了希望。近年有研究發現[1]，臍帶Wharton膠富含透明質酸、糖胺聚糖及膠原等成分，是一種無血管、神經支配及淋巴回流的組織，且臍帶Wharton膠富有彈性以保護臍帶血管，無論在成分、結構和功能上均與軟骨組織類似[2-3]，表明臍帶Wharton膠組織可能是一種較好的軟骨組織工程支架材料來源[4]。本實驗通過制備人臍帶Wharton膠取向支架，體外評估軟骨細胞與支架材料的親和性、生物相容性，以及支架的取向性結構對細胞黏附、生長排列的影響，探討人臍帶Wharton膠取向支架在軟骨組織工程中應用的可行性。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
健康成年新西蘭大白兔8只，雌雄不限，體重2.5～3.0 kg，購于解放軍總醫院醫學實驗動物中心，對動物的處理符合《關于善待動物的指導性意見》。正常臍帶組織由解放軍總醫院婦產科足月健康產婦自愿捐贈。
PKH26細胞熒光標記試劑盒、H-DMEM培養基、Ⅱ型膠原酶、L-脯氨酸、Hoechst33258、Triton X-100溶液、N-羥基琥珀酰亞胺（N-hydroxysul-fosuccinimide sodium salt，NHS）、胰蛋白酶（Sigma公司，美國）；速新眠Ⅱ 號（戊巴比妥鈉注射液；北京軍事醫學科學院）；氯胺酮注射液（華北制藥集團有限責任公司）；標準FBS、非必須氨基酸（nonessential amino acid，NEAA；HyClone公司，美國）；Ⅱ型膠原鼠抗人多克隆抗體（北京世安科興科技開發技術有限公司）；Ⅱ型膠原鼠抗人單克隆抗體（Santa Cruz公司，美國）；辣根過氧化酶標記的山羊抗小鼠 IgG（北京中杉金橋生物技術有限公司）；碳化二亞胺、甲苯胺藍、番紅O（北京化學試劑公司）。
細胞培養板、培養瓶、離心管（Corning costar公司，美國）；Zeiss不銹鋼濾器（上海醫療器械廠）； 噴金鍍膜機（Denton Vacuum Desk-Ⅱ 公司，美國）；85-2型恒溫磁力攪拌器（江蘇常州國華儀器公司）；BB5060型CO2培養箱（Heraeus公司，德國）；BH-2型倒置顯微鏡、Ⅸ70型熒光顯微鏡（Olympus公司，日本）；JSM-6700F 型掃描電鏡（JEOL公司，日本）。
1.2 軟骨細胞分離培養及鑒定
1.2.1 軟骨細胞分離培養及傳代
取新西蘭大白兔，用氯胺酮與速眠新Ⅱ號按1∶1（V/V）比例肌肉注射（0.5 mL/ kg）麻醉，側臥位固定于實驗臺，無菌條件下操作。顯露肩關節后用自制小刀片輕輕旋刮收集淺層軟骨組織，置于超凈工作臺內，D-Hank液沖洗3 次，清除表面血跡；吸盡D-Hank液，加入少許0.2%Ⅱ型膠原酶消化，眼科剪將關節軟骨塊剪成1 mm × 1 mm × 1 mm碎塊，再加入10 倍體積的0.2%Ⅱ型膠原酶，置于37℃、5%CO2培養箱內借助磁力攪拌器作用消化60～90 min，至消化液變渾濁，組織碎塊消失；將渾濁液用吸管移入無菌離心管，以離心半徑13.5 cm、1 500 r/min離心5 min；棄上清，沉淀再用30倍體積的D-Hank液同上法離心3次，軟骨細胞培養液（含2.97 g/L HEPES、0.05 g/L維生素C、0.046 g/L L-脯氨酸、1%ITS、1%NEAA的H-DMEM培養基）清洗1次；最后加入含20%FBS的軟骨細胞培養液置于37℃、5%CO2培養箱內培養[5]。每天倒置顯微鏡下觀察細胞貼壁生長情況，細胞多數貼壁后全量換液，除去未貼壁細胞和雜質，以后每3～4天全量換液。原代細胞融合達80%～90%時傳代培養。取第2代細胞用于實驗。
1.2.2 軟骨細胞鑒定
取生長融合的第2代軟骨細胞，Ⅱ型膠原酶消化后制備細胞爬片，行甲苯胺藍及Ⅱ型膠原免疫組織化學染色鑒定。① 甲苯胺藍染色：將細胞爬片用D-Hank液清洗2次，4%多聚甲醛固定15～20 min，滴加甲苯胺藍染色約10 min，水洗后光鏡下觀察。② Ⅱ型膠原免疫組織化學染色：將細胞爬片用D-Hank液清洗2次，4%多聚甲醛固定15～20 min，固定于載玻片上，0.1%Triton X-100打孔30 min，PBS沖洗；3%H2O2 15 min滅活內源性過氧化氫酶，PBS沖洗；羊血清封閉15 min，晾干；滴加1∶50Ⅱ型膠原鼠抗人單克隆抗體，濕盒內4℃過夜，PBS沖洗；滴加 50 μL辣根過氧化酶標記山羊抗小鼠IgG，室溫下孵育20 min。PBS漂洗5 min × 3次。濾紙拭去組織周圍PBS液，每張切片滴加50 μL DAB溶液顯色5 min，去離子水沖洗，倒置顯微鏡觀察。棕色染色為陽性表達。
1.2.3 細胞活力檢測
取生長融合的第2代軟骨細胞，用Ⅱ型膠原酶消化后接種至6孔板，加入含20%FBS的軟骨細胞培養液，待細胞貼壁融合達50%～60%時，用小鑷子將爬有軟骨細胞的蓋玻片取出，行二乙酰熒光素（fluorescein diacetate，FDA）-碘化丙啶（propidium iodide，PI）雙色熒光檢測法染色，熒光顯微鏡下觀察。活細胞呈綠色，死細胞呈紅色。
1.3 人臍帶Wharton膠取向支架的制備及表征
1.3.1 人臍帶Wharton膠納米級材料制備
取臍帶組織，浸泡于pH2.5酸性氧化電解質水溶液中初步滅菌3次，每次10 min；無菌條件下用眼科剪將臍帶組織從中間剖開，用有齒鑷剝離血管組織（2條動脈、1條靜脈），再剝離臍帶外膜組織，余下的膠組織用無菌蒸餾水沖洗3次，每次5 min；3%H2O2浸泡再次消毒滅菌30 min，無菌蒸餾水漂洗3次，每次30 min，即獲得Wharton膠。將Wharton膠放入粉碎機內，加2倍體積的無菌三蒸水，于- 5℃反復粉碎成含細胞的Wharton膠勻漿；加10倍體積的無菌三蒸水低滲混勻，將低滲含細胞Wharton膠勻漿再放入- 20℃中冷凍，于常溫融化，經3～4次凍融周期，再次使細胞膜破碎。采用梯度離心法，將粉碎混勻的勻漿經離心半徑13.5 cm、2 000 r/min離心20 min；取上清加入含1%Triton X-100、0.25%胰蛋白酶的Tris-HCl緩沖液中，輕輕攪拌，4℃洗脫24 h，經離心半徑13.5 cm、3 000 r/min離心20 min，取上層用DNase和RNase混合液37℃消化過夜；用蒸餾水沖洗48 h，4℃經離心半徑13.5 cm、6 000 r/ min離心15～20 min，反復5次，充分洗去細胞碎片和殘留物，洗至pH7.0；取上層勻漿，4℃經離心半徑13.5 cm、10 000 r/min離心40 min，棄上清，收集沉淀，即無細胞的納米級臍帶Wharton膠懸液，行掃描電鏡觀察。
1.3.2 人臍帶Wharton膠取向支架制備
將收集的人臍帶Wharton膠懸液用無菌PBS清洗，調整成濃度為3%（W/V）的混懸液，充分攪拌均勻，至無氣泡產生后注入聚乙烯圓筒模具中，垂直放置在不銹鋼板上，- 20℃預冷30 min；將凍結的混懸液從模具中取出，置入已預冷的冷凍干燥機升華干燥，48 h后形成支架取出。距光源5～10 cm處在258 nm波長紫外光照射下交聯8 h，再置于含有20 mmol/L NHS與50 mmol/L EDAC的95%（V/V）乙醇溶液中4℃交聯24 h。無菌PBS漂洗并浸泡2 h，無菌三蒸水漂洗，再次凍干，密封袋內貯存密封，60Co輻照消毒，4℃保存備用。
1.3.3 人臍帶Wharton膠取向支架的表征
① 大體觀察支架性狀。② 組織學及免疫組織化學染色觀察：取制備的人臍帶Wharton膠取向支架，OCT包埋，10 μm厚冰凍切片，丙酮固定10 min，分別行HE染色、番紅O染色及Ⅱ型膠原免疫組織化學染色。③ 掃描電鏡觀察：人臍帶Wharton膠取向支架噴金后，掃描電鏡觀察其結構特點，測量100倍視野下支架孔徑大小，測量100個孔徑，取均值。④ 支架吸水率測定：取出完全冷凍干燥的支架稱重記為W1；室溫條件下支架在去離子水中浸泡4 h，充分飽和達吸水平衡后取出，濾紙吸取支架表面多余液體，濕態下支架稱重記為W2；根據以下公式計算支架吸水率：（W2－W1）/W1 ×100%。測3個樣本，取均值。
1.4 細胞-支架復合培養及相關觀測
1.4.1 細胞-支架復合培養
取第2代軟骨細胞，經0.25%胰蛋白酶消化后，在培養瓶中分散成單個細胞懸液，調整細胞密度為1 ×107個/mL。將厚1 mm、直徑4 mm的人臍帶Wharton膠取向支架放入6孔培養板中，然后用1 mL注射器將20 μL細胞懸液（約2 ×105 個細胞）接種于該支架上，使支架完全浸透，然后置入37℃、5%CO2及飽和濕度培養箱中培養4 h，再在每孔加入2 mL軟骨細胞培養液繼續培養。
1.4.2 觀測指標
① 倒置顯微鏡觀察：培養3 d，取出細胞-支架復合物，PBS清洗，2.5%戊二醛4℃固定24 h，倒置顯微鏡下觀察細胞在支架上黏附情況。② 掃描電鏡觀察：培養7 d，取出細胞-支架復合物，PBS清洗、鋨酸固定、梯度乙醇脫水，冷凍干燥，上機噴金，掃描電鏡觀察軟骨細胞在支架上的黏附和分布情況。③ 組織學觀察：培養7 d，取出細胞-支架復合物，經OCT包埋，10 μm厚切片，丙酮固定10 min，分別行甲苯胺藍、番紅O染色，光鏡下觀察。④ 軟骨細胞在支架上的活力評估：培養3、7 d，取出細胞-支架復合物，行FDA-PI染色評估細胞活力；培養7 d取復合物，PBS漂洗，10 μm厚切片，行Hoechst33258染色觀察軟骨細胞在支架上的生長及分布情況。⑤ 體外熒光標記軟骨細胞與支架復合觀察：取第2代軟骨細胞，采用PKH26細胞熒光標記試劑盒進行軟骨細胞熒光標記，將熒光標記的軟骨細胞用含10%FBS的DMEM洗3次，離心收集細胞，調整細胞密度為4 ×107個/mL。同1.4.1方法將熒光標記軟骨細胞接種于臍帶Wharton膠取向支架，培養1 d熒光顯微鏡下觀察。
2 結果
2.1 軟骨細胞形態學觀察及鑒定
2.1.1 軟骨細胞形態學觀察
Ⅱ型膠原酶消化后大量單個細胞在培養基內于8～12 h貼壁，組織塊內細胞于2 d開始爬出、貼壁生長，多呈短梭形或多角形，伸長的突起向周圍展開；細胞核位于胞體中心，為圓形或橢圓形。隨培養時間延長，細胞密度越來越大，3 d時細胞形態呈多角形，似鵝卵石樣，立體感強，折光性好。原代細胞經0.25%胰蛋白酶消化為單個細胞后，細胞傳代一般4 h開始貼壁，8 h大部分貼壁，傳代細胞迅速呈小多角形鋪展開，且增殖迅速，立體感強，生長良好。見圖 1。
圖1
軟骨細胞形態學觀察 ? 原代細胞培養3 d（倒置顯微鏡×100） ? 第1代細胞培養5 d（倒置顯微鏡×100） ? 第2代細胞培養3 d（倒置顯微鏡× 200） ? ?2.1.2 軟骨細胞鑒定
甲苯胺藍染色示，軟骨細胞分泌的基質呈藍色，包繞細胞核，呈陽性；Ⅱ型膠原免疫組織化學染色示，軟骨細胞細胞質和分泌的基質被染成棕色，呈強陽性。見圖 2 a、b。
2.1.3 細胞活力檢測
軟骨細胞爬片FDA-PI染色示，細胞成活率達90%以上。見圖 2 c。
2.2 人臍帶Wharton膠取向支架的表征
① 大體觀察示，制備的人臍帶Wharton膠取向支架呈乳白色，直徑為4 mm。② 掃描電鏡觀察示，支架橫截面具有互相連通且分布均勻的多孔結構，有較高孔隙率，孔隙呈“蜂窩”狀；縱截面有相互交織且均勻一致、垂直取向排列的孔隙，形成平行排列的管狀結構。支架孔徑為（104 ± 30）μm。人臍帶Wharton膠懸液微絲直徑＜ 100 nm，為納米級。見圖 3。③ HE染色、番紅O染色及Ⅱ型膠原免疫組織化學染色均呈陽性。見圖 4。④ 支架吸水率為94.38% ± 0.19%。
2.3 細胞-支架復合物相關觀測
2.3.1 倒置顯微鏡及掃描電鏡觀察
培養3 d，倒置顯微鏡觀察示，細胞在支架孔隙內分布較均勻，呈圓形或橢圓形。培養7 d掃描電鏡觀察示，大量細胞黏附于支架孔隙間，呈圓形或橢圓形，且軟骨細胞分泌了細胞外基質；細胞沿取向孔道伸展排列，相互聚集，增殖旺盛，取向支架引導軟骨細胞垂直取向排列。見圖 5 a～c。
圖5
細胞-支架復合物觀察 ? 培養3 d倒置顯微鏡觀察（× 200） ? 培養7 d掃描電鏡觀察橫截面（×100） ? 培養7 d掃描電鏡觀察縱截面（×100） ? 培養7 d甲苯胺藍染色（× 200） ? 培養7 d番紅O染色（× 200） ? 培養3 d FDA-PI染色（× 200） ? 培養7 d Hoechst33258染色（×100） ? PKH26標記的軟骨細胞與支架復合培養1 d觀察（熒光顯微鏡× 200）
Figure5.
Observation of cell-scaffold complex ? Cells cultured for 3 days (Inverted microscope × 200) ? SEM observation of cross section of cell-scaffold complex cultured for 7 days (×100) ? SEM observation of longitudinal section of cell-scaffold complex cultured for 7 days (×100) ? Toluidine blue staining of cell-scaffold complex cultured for 7 days (× 200) ? Safranin O staining of cell-scaffold complex cultured for 7 days (× 200) ? FDA-PI staining of cell-scaffold complex cultured for 3 days (× 200) ? Hoechst33258 staining of cell-scaffold complex cultured for 7 days (×100) ? PKH26 labelled chondrocytes on cell-scaffold complex cultured for 1 day (Fluorescence microscope × 200)
2.3.2 組織學觀察
培養7 d，甲苯胺藍和番紅O染色均呈陽性，細胞在支架中分布均勻且增殖旺盛，細胞分泌大量細胞外基質；取向支架能引導細胞遷徙和增殖，并能有效保留和促進細胞外基質分泌。見圖 5 d～e。
2.3.3 軟骨細胞在支架上的活力評估
FDA-PI染色示，培養3 d支架上黏附的大部分細胞為活細胞，細胞成活率高達90%以上。培養7 d，Hoechst33258染色示細胞在支架內部分布均勻，增殖旺盛。見圖 5 f、 g。
2.3.4 熒光標記軟骨細胞與支架復合觀察
培養1 d 熒光顯微鏡觀察示，PKH26標記后的軟骨細胞呈紅色在支架上均勻分布，細胞沿支架孔隙分布。見圖 5 h。
3 討論
目前各種原因所致的軟骨損傷患者越來越多，由于軟骨無血管、神經，損傷后很難自愈，且加速損傷關節退變，最終多行人工關節置換術。近年軟骨組織工程的興起，為關節軟骨損傷修復帶來了新希望[6]。軟骨組織工程包括三大要素，即種子細胞、支架材料和細胞因子。本研究基于前期成功脫細胞提取人臍帶Wharton膠細胞外基質的經驗[7]并加以改進，取臍帶采用濕潤粉碎結合化學脫細胞技術脫細胞，利用冷凍干燥及交聯等技術制備人臍帶Wharton膠取向支架，并對支架進行初步表征，結果顯示該支架擁有天然軟骨的生化組成和形態結構特點，實現了軟骨組織工程支架在成分和形態結構上的雙重仿生。
值得注意的是：① 掃描電鏡觀察示，人臍帶Wharton膠懸液微絲為納米級結構。有研究表明[8-9]，具有納米級結構的支架材料非常有利于細胞黏附和增殖，同時對細胞分化也有促進作用。② 制備的取向支架不僅具有成分的仿生性，還具有形態結構的仿生性。研究表明[10-11]，人臍帶Wharton膠不僅具有臍帶組織成分，包括各種生長因子、透明質酸、GAGs以及膠原，流式細胞儀檢測還顯示表達干細胞標志物CD44、CD45、CD105、CD271。既往研究還表明人臍帶Wharton膠取向支架具有免疫原性低，植入兔體內無免疫排斥反應等優點[12]。
軟骨細胞是關節軟骨組織唯一的功能細胞，因此本實驗采用兔關節軟骨細胞復合人臍帶Wharton膠取向支架進行體外評估。對于關節軟骨組織而言，深層關節軟骨膠原纖維具有獨特的垂直于軟骨下骨取向排列，這種取向性影響著軟骨細胞的取向排列。本研究中，軟骨細胞與人臍帶Wharton膠取向支架復合培養3、7 d后，細胞在取向支架孔道內均勻分布，呈柱狀縱向垂直排列；甲苯胺藍和番紅O染色呈陽性。表明取向支架結構引導了軟骨細胞垂直取向排列，并能有效促進細胞外基質分泌[13]。FDA-PI染色和Hoechst33258染色結果顯示，軟骨細胞成活率高達90%以上，且增殖旺盛。表明人臍帶Wharton膠取向支架有利于軟骨細胞黏附和增殖，細胞在支架上成活率高。這種結構特點與關節軟骨非常相似，表明人臍帶Wharton膠取向支架具有良好的親和性和細胞相容性。
綜上述，本研究結果表明人臍帶Wharton膠取向支架具有與正常軟骨細胞外基質類似的組成成分和結構特征，能夠為種子細胞提供良好的生長和分化微環境，可能是一種較好的軟骨組織工程支架材料來源。
