引用本文： 幸嶸, 孔清泉, 項舟, 楊婧, 羅靜聰, 鄧力, 解慧琪. 小鼠干細胞成骨和成軟骨分化特異性微小RNA的初步研究. 中國修復重建外科雜志, 2014, 28(8): 1009-1016. doi: 10.7507/1002-1892.20140222 復制
微小RNA（microRNA，miRNA）是真核生物中一類長度為19～23個核苷酸的小分子非編碼RNA，其對靶基因的調控表現在轉錄后水平上，通過對靶基因mRNA的切割或對其翻譯抑制這兩種機制來下調靶基因的表達。研究表明，miRNA參與調控生物發育、細胞分化、增殖、凋亡和代謝多種功能，全基因組miRNA水平檢測表明，miRNA水平和種類在正常發育和各種疾患中改變明顯[1-3]。而在干細胞定向分化過程中，常發現有組織特異性miRNA表達增加，而干細胞/前體細胞特異性miRNA表達減少，均提示miRNA在維持細胞分化狀態中可能起重要作用[4-6]。轉錄因子直接調控從DNA到mRNA的轉錄過程，這種調控與mRNA濃度有直接關系，且轉錄因子處于信號通路的最底端，整個信號通路決定轉錄因子激活與否。而miRNA的靶基因通常屬于調控信號通路中的基因，能夠影響轉錄因子的效力，并進一步影響轉錄因子所調控基因的表達水平，導致其最終作用效果呈級聯放大[7]。所以miRNA對于信號通路、轉錄因子以及轉錄因子所調控的基因表達均有重要影響，對miRNA的研究也成為當前科研熱點之一。目前通過miRNA基因芯片技術可以測定細胞的miRNA表達譜，為尋找調控細胞分化的特異性miRNA奠定了技術基礎。
本實驗通過對C3H10T1/2標準細胞系進行成骨和成軟骨分化培養，在此基礎上采用miRNA基因芯片技術，分別測定C3H10T1/2細胞及其誘導分化成骨和成軟骨后的細胞miRNA表達譜，對比篩選出2倍變化幅度且平均標準化信號值＞ 2的差異miRNA；再針對篩選出的miRNA進行實時熒光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）驗證，為下一步篩選合適的miRNA進行功能驗證和靶基因研究奠定基礎。
1 材料與方法
1.1 主要試劑及儀器
C3H10T1/2細胞系（上海中國科學院細胞庫）；谷氨酰胺、DMEM培養基、青霉素、鏈霉素（HyClone公司，美國）；胰蛋白酶（Amresco公司，美國）；FBS（GIBCO公司，美國）；EDTA（Invitrogen公司，美國）；胰島素-轉鐵蛋白-硒（insulin-transferrin-selenium，ITS）、地塞米松、維生素C、β-甘油磷酸鈉、DMSO、茜素紅、對硝基苯磷酸二鈉（disodium 4-nitrophenyl phosphate，pNPP）、ALP染色試劑、ALP定量試劑、鈣定量試劑盒、阿利辛藍（Sigma公司，美國）；TGF-β1（PeproTech公司，美國）；Percoll細胞分離液（GE公司，美國）；細胞凋亡檢測試劑盒（BD公司，美國）；SYBR Green試劑（Takara公司，日本）。
miRNA芯片（Agilent公司，美國）；YU2200型超凈工作臺（Jouan公司，法國）；CO2培養箱（SANYO公司，日本）；倒置顯微鏡（Olympus公司，日本）；iQTM5 RT-qPCR儀、Western blot儀、Quantity one 軟件（Bio-Rad公司，美國）。Agilent Mouse miRNA 芯片、GENESPRING12.5軟件、Agilent掃描儀、Feature Extraction軟件（Agilent公司，美國）。
1.2 C3H10T1/2細胞培養及傳代
取C3H10T1/2細胞系，用完全培養液（含10%FBS、50 U/mL青霉素、50 mg/mL鏈霉素的H-DMEM）于37℃、5%CO2培養箱中培養。當細胞生長至90%～95%融合時，吸棄培養基，PBS清洗2次，0.25%胰蛋白酶-0.1%EDTA 37℃消化1 min；輕輕拍打培養皿至細胞全部浮起，加入適量完全培養液終止反應，用移液器反復抽吸，室溫以300 × g離心5 min收集細胞，棄上清，加入完全培養液重懸細胞，按1∶3比例接種于培養皿中傳代。光鏡下觀察細胞形態變化。取第3代細胞進行成骨和成軟骨誘導分化。
1.3 成骨誘導分化相關檢測
1.3.1 成骨誘導分化
取第3代C3H10T1/2細胞以3 000個/cm2密度接種于12孔板，每組以完全培養液繼續培養。當細胞生長至80%～85%融合時，將實驗分為2組，對照組更換為對照培養基（含10%FBS、50 U/mL青霉素、50 mg/mL鏈霉素的H-DMEM），成骨誘導組更換為成骨誘導培養基（含10%FBS、50 U/ mL青霉素、50 mg/mL鏈霉素、100 nmol/L地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸鈉、50 μmol/L維生素C的H-DMEM），每2天換液1次。光鏡下觀察細胞生長情況。
1.3.2 ALP定量檢測
成骨誘導7 d，采用pNPP法行ALP定量檢測。吸棄兩組培養基，用冰預冷的PBS清洗細胞2次，將細胞刮入PBS中，室溫以300 × g離心5 min收集細胞，棄上清，用300～500 μL ddH2O重懸細胞。將細胞懸液置于- 80℃ 30 min，37℃水浴5 min，反復凍融3次。之后4℃以12 000 × g離心30 min，轉移上清備用。將50 μL pNPP儲備液、100 μL二乙醇胺和50 μL待測蛋白樣品混合，37℃水浴30 min后加入200 μL 3 mol/L NaOH終止反應；取出200 μL于96孔板中，用酶標儀于405 nm波長處測定吸光度（A）值。實驗重復3次，取均值。
1.3.3 茜素紅染色
成骨誘導21 d，吸出培養液后，PBS清洗2次，4%多聚甲醛-PBS固定20 min；吸棄固定液后，PBS清洗5 min × 3次；加入1.4%茜素紅（pH4.2）染色20 min；PBS漂洗2次，光鏡下觀察。
1.3.4 RT-qPCR檢測成骨分化相關基因表達
成骨誘導0、7、14、21 d ，RT-qPCR檢測成骨誘導組成骨相關基因Runx2、絲氨酸蛋白酶7（serine protease 7，Sp7）、Ⅰ型膠原、骨橋蛋白（osteopontin，OPN）的表達。引物序列：Runx2上游5'-GACTGTGGTTACCGTCATGGC-3'，下游5'-ACTTGGTTTTTCATAACAGCGGA-3'；Sp7上游5'-ACCCCAAGATGTCTATAAGCCC-3'，下游5'-CG-CTCTAGCTCCTGACAGTTG-3'；Ⅰ型膠原上游5'-CT-GGCGGTTCAGGTCCAAT-3'，下游5'-TTCCAGGCAA-TCCACGAGC-3'；OPN上游5'-AGAGCGGTGAGTCT-AAGGAGT-3'，下游5'-TGCCCTTTCCGTTGTTGTCC-3'；GAPDH上游5'-TGGCCTTCCGTGTTCCTAC-3'，下游5’-GAGTTGCTGTTGAAGTCGCA-3'。反應體系：引物各0.2 μL，SYBR 5 μL，cDNA 0.3 μL，ddH2O 4.5 μL。反應條件：95℃變性10 s，95℃、10 s，60℃、30 s，40個循環；進入熔解曲線檢測步驟，95℃、10 s，60℃、10 s，40℃、30 s。以GAPDH作為內參，按照2-ΔΔCt方法計算各目的基因mRNA相對表達量。實驗重復3次，取均值。
1.3.5 Western
blot檢測成骨分化相關蛋白表達成骨誘導21 d，采用Western blot檢測成骨誘導組和對照組成骨相關蛋白Runx2、Sp7、Ⅰ型膠原、OPN的表達。采用BCA法測定所提取總蛋白質濃度，以提取的蛋白質樣品各30 μg進行SDS-PAGE電泳。轉膜，封閉，先后孵育一抗和二抗，洗膜后暗室內顯影。通過X線片上不同免疫印跡條帶的強弱觀察目的蛋白表達變化趨勢，用Quantity one 軟件讀取條帶灰度值。實驗重復3 次，取均值。
1.4 成軟骨誘導分化相關檢測
1.4.1 成軟骨誘導分化
使用Micromass法進行成軟骨誘導。取第3代C3H10T1/2細胞，用0.25%胰蛋白酶-0.1%EDTA 37℃消化1 min，以離心半徑10 cm、1 000 r/min離心3 min，收集細胞。加入完全培養液重懸細胞，調整濃度至1 ×107個/mL。按10 μL/滴將高密度細胞懸液接種于12孔板內，每組設3個復孔。置于37℃、5%CO2培養箱內培養3 h后，將實驗分為兩組，成軟骨誘導組更換為成軟骨誘導培養基（含10%FBS、50 U/mL青霉素、50 mg/mL鏈霉素、1%ITS、40 μg/mL脯氨酸、100 nmol/L地塞米松、50 μg/mL維生素C、10 ng/mL TGF-β1的H-DMEM）；對照組更換為對照培養基（含10%FBS、50 U/ mL青霉素、50 mg/mL鏈霉素及與成軟骨誘導培養液等量的DMSO的H-DMEM）；每2天換液1次。光鏡下觀察細胞生長情況。
1.4.2 阿利新藍染色
成軟骨誘導0、5、10、15 d，對成軟骨誘導組行阿利新藍染色。吸棄培養液，PBS清洗2次，4%多聚甲醛-PBS固定20 min；吸棄固定液，PBS清洗5 min × 3次；加入阿利新藍染液染色10 min；PBS漂洗2次，光鏡下觀察。
1.4.3 RT-qPCR檢測成軟骨分化相關基因表達
成軟骨誘導0、5、10、15 d，采用RT-qPCR檢測成軟骨誘導組成軟骨相關基因SOX9、Ⅱ型膠原、蛋白多糖（Aggrecan）、透明質酸合成酶（Has2）的表達。引物序列： SOX9上游5'-CGGAACAGACTCACATCTCTCC-3'，下游5'-GCTTGCACGTCGGTTTTGG-3'；Ⅱ型膠原上游5'-CCTCAAGGCAAAGTTGGTCCT-3'，下游5'-C-TCCCGTCTCACCGTCTTTT-3'；Has2上游5'-TGAAC-AAAACGGTAGCACTCTG-3'，下游5'-ACTTTAATCC-CAGGGTAGGTCAG-3'；Aggrecan上游5'-ATTTCCA-CACGCTACACCCTG-3'，下游5'-TGGATGGGGTATC-TGACTGTC-3'；其余步驟同1.3.4方法。
1.4.4 Western
blot檢測成軟骨分化相關蛋白表達成軟骨誘導15 d，Western blot檢測成軟骨誘導組和對照組成軟骨分化相關蛋白SOX9、Ⅱ型膠原、Aggrecan、Has2的表達。實驗步驟同1.3.5。
1.5 篩選及驗證成骨和成軟骨分化過程中的差異miRNAs
分別收集第3代C3H10T1/2細胞（A組）及C3H10T1/2細胞成軟骨誘導分化完成后的細胞（B組）和成骨誘導分化完成后的細胞（C組），每組3個樣本。吸棄培養基，加入少量PBS洗滌1次；吸棄PBS，加入適量Trizol試劑，用移液器進行反復吹打，使細胞充分裂解。然后采用miRNA基因芯片進行檢測。所用芯片為Agilent Mouse miRNA芯片，每個標本使用1張芯片。Agilent掃描儀中選擇相應參數（掃描面積71.0 mm × 21.6 mm，激發波長532 nm和633 nm）掃描，Feature Extraction軟件讀取數據并進行分析，最后應用GENESPRING12.5軟件進行分位數標準化。對比3 組細胞的miRNA表達譜，篩選出在3組內兩兩比較有差異表達的miRNA。對上述篩選得到的備選miRNA進行合并去重，并選取2倍變化幅度、平均標準化信號值＞ 2的差異miRNA進行RT-qPCR驗證。所得RT-qPCR結果中所有數據均以A組為1作均一化處理，為相對表達量。
1.6 統計學方法
采用SPSS13.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，各時間點間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗；兩組間比較采用t檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 成骨誘導分化相關檢測
2.1.1 細胞形態學觀察
成骨誘導過程中細胞呈長梭形，形態變化不明顯；隨誘導時間延長，可見較低透光性區域，為鈣結節形成區域（圖 1）。
圖1
成骨誘導組各時間點細胞形態學觀察（×100） ? 7 d ? 14 d ? 21 d ? ?2.1.2 ALP定量檢測
成骨誘導7 d，對照組ALP表達量極低，為0.18 ± 0.02；成骨誘導組ALP表達量為0.71 ± 0.17，顯著高于對照組，差異有統計學意義（F=29.550，P=0.006）。
2.1.3 茜素紅染色
成骨誘導21 d，成骨誘導組茜素紅染色陽性，成骨效果明顯（圖 2）。
2.1.4 RT-qPCR檢測
成骨誘導7、14、21 d，Runx2、Sp7、Ⅰ型膠原及OPN mRNA相對表達量均顯著高于誘導0 d時，差異均有統計學意義（P＜ 0.05）；除Runx2 mRNA相對表達量14、21 d與7 d比較，以及OPN mRNA相對表達量21 d與14 d比較差異無統計學意義（P＞ 0.05）外，其余各目的基因各時間點間比較差異均有統計學意義（P＜ 0.05）。見圖 3。
2.1.5 Western
blot檢測成骨誘導21 d，成骨誘導組Runx2、Sp7、Ⅰ型膠原及OPN蛋白表達量分別為0.35 ± 0.03、0.33 ± 0.03、0.64 ± 0.09、0.24 ± 0.02，均顯著高于對照組的0.16 ± 0.02、0.16 ± 0.05、0.37 ± 0.02、 0.08 ± 0.01，差異均有統計學意義（P＜ 0.05）。見圖 4。
2.2 成軟骨誘導分化相關檢測
2.2.1 細胞形態學觀察
成軟骨誘導分化過程中，隨誘導時間延長，軟骨團塊逐漸增大（圖 5）。
2.2.2 阿利辛藍染色
隨誘導時間延長，軟骨團塊逐漸增大，阿利辛藍染色逐漸加深，成軟骨效果逐漸增強（圖 6）。
2.2.3 RT-qPCR檢測
成軟骨誘導5 d，SOX9和Aggrecan mRNA相對表達量高于誘導0 d時，差異有統計學意義（P＜ 0.05）；但Ⅱ型膠原和Has2 mRNA相對表達量與0 d時比較差異無統計學意義（P＞ 0.05）。成軟骨誘導10、15 d，各目的基因mRNA相對表達量均高于0 d時，差異有統計學意義（P＜ 0.05）。除SOX9、Ⅱ型膠原、Has2 mRNA相對表達量15 d和10 d比較差異無統計學意義（P＞ 0.05）外，其余各目的基因各時間點間比較差異均有統計學意義（P＜ 0.05）。見圖 7。
2.2.4 Western
blot檢測成軟骨誘導15 d，成軟骨誘導組SOX9、Ⅱ型膠原、Aggrecan、Has2蛋白表達量分別為0.37 ± 0.01、0.39 ± 0.04、0.18 ± 0.03、0.34 ± 0.04，均顯著高于對照組的0.18 ± 0.04、0.23 ± 0.02、0.05 ± 0.01、0.13 ± 0.03，差異均有統計學意義（P＜ 0.05）。見圖 8。
圖8
成軟骨誘導15 d Western blot檢測相關蛋白表達 1～3： 對照組 4～6：成軟骨誘導組
Figure8.
Western blot results of SOX,collagen type Ⅱ,Aggrecan,and Has2 proteins at 15 days after chondrogenic induced 1-3: Control group 4-6: Chondrogenic induced group
2.3 miRNA芯片篩選及驗證
A、C組間，A、B組間以及B、C組間分別有3、47、74個差異表達變化倍數＞ 2的miRNA；篩選出2 倍變化幅度且平均標準化信號值＞ 2的差異miRNA，A、B組有3個，A、C組有10個，見表 1、2。
表1
A、B組2倍變化幅度且平均標準化信號值＞ 2的差異miRNA
Table1.
Specific miRNA more than 2 fold change and 2 average normalized probe signal between group A and group B
表2
A、C組2倍變化幅度且平均標準化信號值＞ 2的差異miRNA
Table2.
Specific miRNA more than 2 fold change and 2 average normalized probe signal between group A and group C
各組之間篩選出來的差異miRNA 行 RT-qPCR 驗證，只有A、B組中篩選出的miR-455-3p存在不一致，其RT-qPCR結果在A、B組間變化程度明顯弱于其芯片結果。其余差異miRNA的RT-qPCR驗證結果在其組間變化趨勢與其芯片結果較為一致。見圖 9。
圖9
RT-qPCR驗證結果與芯片結果比較 ? miR-15b-5p ? miR-19b-3p ? miR-20a-5p ? miR-26a-5p ? miR-27a-3p ? miR-27b-3p ? miR-3096b-3p ? miR-3102-5p ? miR-322-5p ? miR-455-3p ? miR-5126 ? miR-92a-3p ? miR-99a-5p
Figure9.
Comparison of the results between by RT-qPCR and microarray ? miR-15b-5p ? miR-19b-3p ? miR-20a-5p ? miR-26a-5p ? miR-27a-3p ? miR-27b-3p ? miR-3096b-3p ? miR-3102-5p ? miR-322-5p ? miR-455-3p ? miR-5126 ? miR-92a-3p ? miR-99a-5p
3 討論
目前已知MSCs分化為軟骨細胞并進一步分化為成骨細胞有2條通路：① MSCs→軟骨細胞→肥大軟骨細胞→成骨細胞；② MSCs→成纖維細胞→軟骨細胞→成骨細胞分化（軟骨內骨化）。近年來隨著對miRNA研究的逐漸增多，對MSCs分化為成骨或成軟骨細胞的特異miRNA篩選也成為可能。很多研究發現[8-10]，每個miRNA可作用于一個或多個靶基因，也可同時產生抑制和/或促進作用，每個miRNA的靶基因之間也有可能出現重復的靶基因，證明靶基因的作用可能不是由單個miRNA決定，而是受多個miRNA影響。研究發現，同一個miRNA在細胞分化不同時期所起作用也不盡相同，如miRNA-29b在成骨分化初期為負性調控作用，促進成骨細胞分化，而在成骨分化礦化期起正性調控作用[8]。
C3H10T1/2細胞是小鼠的一種MSCs，具有多向分化潛能[11-13]。本研究通過將小鼠C3H10T1/2細胞誘導分化為成骨和成軟骨細胞，對分化前后細胞進行miRNA芯片檢測，篩選尋找在這兩種分化方向中起關鍵作用的miRNA，為進一步研究尋找成骨和成軟骨分化調控機制，并通過對特異miRNA表達的調節促進或阻止成骨和成軟骨分化奠定理論基礎。
3.1 miRNA在成骨分化中的調控作用
研究表明[9-10, 14-19]，在成骨分化過程中，Wnt、BMP、TGF-β是關鍵信號通路。目前有不少研究表明，一些miRNA能通過對不同靶基因作用以及激活不同的信號傳導通路，在成骨分化過程中起調控作用。如經典Wnt 信號通路被認為是MSCs成骨分化中非常重要的調控機制，研究發現miR-29a可通過抑制Wnt信號通路的負性調控基因Dkk1、Kremen2和sFRP2表達，促進細胞成骨分化[9]；此外，Wnt信號表達又可促進miR-29a表達。因此miR-29a和經典Wnt信號通路之間形成了一個正反饋循環，使得miR-29a-Wnt信號通路能更有效促進成骨分化[14]。此外有研究發現miR-335-5p可通過抑制Dkk1提高糖原合成酶激酶-3β磷酸化和增加β-連環蛋白的轉錄活性，進而加強Wnt信號通路[15]。同樣BMP信號通路對于MSCs的成骨分化也具有關鍵作用。Runx2基因在成骨細胞中有著重要作用，可促進膠原蛋白、骨涎蛋白、骨鈣素、OPN等基因的表達，而BMP可以刺激P300介導的Runx2乙酰化，從而上調Runx2的基因表達，同時又抑制Smurf1介導的Runx2下調作用[16]。因此miRNA、BMP和Runx2共同組成了調控細胞成骨分化信號網絡的關鍵部分[17]。已有研究發現一些特定miRNA在成骨分化中起關鍵作用。研究表明miR-20b可通過激活成骨分化中的關鍵轉錄因子Runx2以及抑制PPARγ、Bambi和Crim1等基因表達，最終增強BMP信號通路，誘導成骨分化[10]。miR-125b也可通過調節細胞增殖來阻止BMP-4誘導成骨細胞分化[18]。研究表明TGF-β3可抑制成骨分化，同時miR-29b可阻止TGF-β3對成骨分化的抑制，最終促進細胞成骨分化[8]。此外miR-210也可通過對TGF-β1受體活性的抑制而促進成骨分化[19]。
3.2 miRNA在成軟骨分化中的調控作用
組蛋白去乙酰化酶在非肥大分化的軟骨細胞中特異表達，它通過抑制Runx2以調控軟骨細胞肥大分化。許多研究表明[20-21]，miR-140可以阻止組蛋白去乙酰化酶的表達，從而消除其對Runx2的抑制作用，最終造成軟骨細胞肥大分化。而miR-199a通過直接作用于Smad1轉錄因子，抑制細胞早期的軟骨分化[22]。也有學者發現miR-18a和miR-488調節軟骨分化的啟動子和基質金屬蛋白酶2附和激活子CCN2，從而影響細胞軟骨分化過程[23-24]。有研究人員通過基因芯片技術和熒光素酶檢測發現，miR-145可直接作用其靶基因SOX9，對細胞成軟骨分化起負性調節[25]，也有報道發現miR-145能下調Runx2表達[26]。研究發現miR-199通過對Smad1轉錄因子的調控從而影響C3H10T1/2細胞軟骨分化過程[22]。有學者通過對雞的MSCs miRNA表達譜分析，發現miR-221能夠促進軟骨細胞增殖[27]，也有研究發現miR-221能夠明顯增加軟骨細胞增殖和軟骨特異性基質合成[28]。近年來，很多針對骨關節炎的研究也發現了一些miRNA在軟骨退變導致骨關節炎過程起重要調控作用。如miR-146a在關節軟骨表面的軟骨細胞中大量表達，而在輕度骨關節炎患者關節軟骨中也有大量表達，并且隨軟骨退變加重其表達降低[29]；可能是因為miR-146a下調IRAK1和TRAF6的表達，進而使基質金屬蛋白酶13表達受阻。最近也有學者發現[30]，LEF-1基因是調控軟骨正常分化和成熟的關鍵因素，而miR-449a能直接與之結合，導致Sox9基因表達減少，繼而阻止細胞的軟骨分化。
本實驗成功將小鼠C3H10T1/2細胞誘導分化為成骨和成軟骨細胞，并通過miRNA芯片技術篩選出變化幅度超過2倍且平均標準化信號值＞ 2的miRNA，其中成骨分化的差異miRNAs有10個，包括miR-27a-3p、miR-27b-3p、miR-26a-5p、miR-322-5p、miR-19b-3p、miR-99a-5p、miR-20a-5p、miR-15b-5p、miR-3096b-3p、miR-92a-3p。miR-27已被證實可通過直接作用于靶基因APC，造成β-連環蛋白的積累，最終激活Wnt信號通路，促進 hFOB1.19細胞成骨分化[31]。也有研究發現[32]，miR-26a可通過抑制其靶基因Smad1的表達，從而抑制脂肪來源干細胞的成骨分化。其他miRNA目前尚無研究發現與細胞成骨分化相關，但其中一些miRNA與細胞其他活動相關。如miR-15b通過去靶基因Bcl-2及半胱天冬信號通路，可能在細胞凋亡過程中起關鍵作用[33]。也有研究發現miR-19b抑制其靶細胞轉錄因子NeuroD1的表達，進而調節胰島β細胞功能及其分化過程[34]。篩選出成軟骨分化的差異miRNA有3個，包括miR-3102-5p、miR-455-3p、miR-5126。有研究發現miR-455-3p可能是骨關節炎發病機制中的關鍵因素，它通過抑制TGF-β信號造成關節出現骨關節炎變化[35]。其他兩個miRNA未見其功能報道。
本實驗篩選出的差異miRNA有部分已被證實其功能與細胞成骨或成軟骨分化相關，驗證了本實驗篩選的準確性。但由于細胞種類不同或分化方法不同，其中更多的是功能未證實的全新miRNA，下一步研究可對RT-qPCR驗證成功的miRNA進行功能驗證和靶基因研究，尤其是對無相關功能報道的miRNA進一步研究，以驗證這些miRNA在成骨和成軟骨分化中的作用。
微小RNA（microRNA，miRNA）是真核生物中一類長度為19～23個核苷酸的小分子非編碼RNA，其對靶基因的調控表現在轉錄后水平上，通過對靶基因mRNA的切割或對其翻譯抑制這兩種機制來下調靶基因的表達。研究表明，miRNA參與調控生物發育、細胞分化、增殖、凋亡和代謝多種功能，全基因組miRNA水平檢測表明，miRNA水平和種類在正常發育和各種疾患中改變明顯[1-3]。而在干細胞定向分化過程中，常發現有組織特異性miRNA表達增加，而干細胞/前體細胞特異性miRNA表達減少，均提示miRNA在維持細胞分化狀態中可能起重要作用[4-6]。轉錄因子直接調控從DNA到mRNA的轉錄過程，這種調控與mRNA濃度有直接關系，且轉錄因子處于信號通路的最底端，整個信號通路決定轉錄因子激活與否。而miRNA的靶基因通常屬于調控信號通路中的基因，能夠影響轉錄因子的效力，并進一步影響轉錄因子所調控基因的表達水平，導致其最終作用效果呈級聯放大[7]。所以miRNA對于信號通路、轉錄因子以及轉錄因子所調控的基因表達均有重要影響，對miRNA的研究也成為當前科研熱點之一。目前通過miRNA基因芯片技術可以測定細胞的miRNA表達譜，為尋找調控細胞分化的特異性miRNA奠定了技術基礎。
本實驗通過對C3H10T1/2標準細胞系進行成骨和成軟骨分化培養，在此基礎上采用miRNA基因芯片技術，分別測定C3H10T1/2細胞及其誘導分化成骨和成軟骨后的細胞miRNA表達譜，對比篩選出2倍變化幅度且平均標準化信號值＞ 2的差異miRNA；再針對篩選出的miRNA進行實時熒光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）驗證，為下一步篩選合適的miRNA進行功能驗證和靶基因研究奠定基礎。
1 材料與方法
1.1 主要試劑及儀器
C3H10T1/2細胞系（上海中國科學院細胞庫）；谷氨酰胺、DMEM培養基、青霉素、鏈霉素（HyClone公司，美國）；胰蛋白酶（Amresco公司，美國）；FBS（GIBCO公司，美國）；EDTA（Invitrogen公司，美國）；胰島素-轉鐵蛋白-硒（insulin-transferrin-selenium，ITS）、地塞米松、維生素C、β-甘油磷酸鈉、DMSO、茜素紅、對硝基苯磷酸二鈉（disodium 4-nitrophenyl phosphate，pNPP）、ALP染色試劑、ALP定量試劑、鈣定量試劑盒、阿利辛藍（Sigma公司，美國）；TGF-β1（PeproTech公司，美國）；Percoll細胞分離液（GE公司，美國）；細胞凋亡檢測試劑盒（BD公司，美國）；SYBR Green試劑（Takara公司，日本）。
miRNA芯片（Agilent公司，美國）；YU2200型超凈工作臺（Jouan公司，法國）；CO2培養箱（SANYO公司，日本）；倒置顯微鏡（Olympus公司，日本）；iQTM5 RT-qPCR儀、Western blot儀、Quantity one 軟件（Bio-Rad公司，美國）。Agilent Mouse miRNA 芯片、GENESPRING12.5軟件、Agilent掃描儀、Feature Extraction軟件（Agilent公司，美國）。
1.2 C3H10T1/2細胞培養及傳代
取C3H10T1/2細胞系，用完全培養液（含10%FBS、50 U/mL青霉素、50 mg/mL鏈霉素的H-DMEM）于37℃、5%CO2培養箱中培養。當細胞生長至90%～95%融合時，吸棄培養基，PBS清洗2次，0.25%胰蛋白酶-0.1%EDTA 37℃消化1 min；輕輕拍打培養皿至細胞全部浮起，加入適量完全培養液終止反應，用移液器反復抽吸，室溫以300 × g離心5 min收集細胞，棄上清，加入完全培養液重懸細胞，按1∶3比例接種于培養皿中傳代。光鏡下觀察細胞形態變化。取第3代細胞進行成骨和成軟骨誘導分化。
1.3 成骨誘導分化相關檢測
1.3.1 成骨誘導分化
取第3代C3H10T1/2細胞以3 000個/cm2密度接種于12孔板，每組以完全培養液繼續培養。當細胞生長至80%～85%融合時，將實驗分為2組，對照組更換為對照培養基（含10%FBS、50 U/mL青霉素、50 mg/mL鏈霉素的H-DMEM），成骨誘導組更換為成骨誘導培養基（含10%FBS、50 U/ mL青霉素、50 mg/mL鏈霉素、100 nmol/L地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸鈉、50 μmol/L維生素C的H-DMEM），每2天換液1次。光鏡下觀察細胞生長情況。
1.3.2 ALP定量檢測
成骨誘導7 d，采用pNPP法行ALP定量檢測。吸棄兩組培養基，用冰預冷的PBS清洗細胞2次，將細胞刮入PBS中，室溫以300 × g離心5 min收集細胞，棄上清，用300～500 μL ddH2O重懸細胞。將細胞懸液置于- 80℃ 30 min，37℃水浴5 min，反復凍融3次。之后4℃以12 000 × g離心30 min，轉移上清備用。將50 μL pNPP儲備液、100 μL二乙醇胺和50 μL待測蛋白樣品混合，37℃水浴30 min后加入200 μL 3 mol/L NaOH終止反應；取出200 μL于96孔板中，用酶標儀于405 nm波長處測定吸光度（A）值。實驗重復3次，取均值。
1.3.3 茜素紅染色
成骨誘導21 d，吸出培養液后，PBS清洗2次，4%多聚甲醛-PBS固定20 min；吸棄固定液后，PBS清洗5 min × 3次；加入1.4%茜素紅（pH4.2）染色20 min；PBS漂洗2次，光鏡下觀察。
1.3.4 RT-qPCR檢測成骨分化相關基因表達
成骨誘導0、7、14、21 d ，RT-qPCR檢測成骨誘導組成骨相關基因Runx2、絲氨酸蛋白酶7（serine protease 7，Sp7）、Ⅰ型膠原、骨橋蛋白（osteopontin，OPN）的表達。引物序列：Runx2上游5'-GACTGTGGTTACCGTCATGGC-3'，下游5'-ACTTGGTTTTTCATAACAGCGGA-3'；Sp7上游5'-ACCCCAAGATGTCTATAAGCCC-3'，下游5'-CG-CTCTAGCTCCTGACAGTTG-3'；Ⅰ型膠原上游5'-CT-GGCGGTTCAGGTCCAAT-3'，下游5'-TTCCAGGCAA-TCCACGAGC-3'；OPN上游5'-AGAGCGGTGAGTCT-AAGGAGT-3'，下游5'-TGCCCTTTCCGTTGTTGTCC-3'；GAPDH上游5'-TGGCCTTCCGTGTTCCTAC-3'，下游5’-GAGTTGCTGTTGAAGTCGCA-3'。反應體系：引物各0.2 μL，SYBR 5 μL，cDNA 0.3 μL，ddH2O 4.5 μL。反應條件：95℃變性10 s，95℃、10 s，60℃、30 s，40個循環；進入熔解曲線檢測步驟，95℃、10 s，60℃、10 s，40℃、30 s。以GAPDH作為內參，按照2-ΔΔCt方法計算各目的基因mRNA相對表達量。實驗重復3次，取均值。
1.3.5 Western
blot檢測成骨分化相關蛋白表達成骨誘導21 d，采用Western blot檢測成骨誘導組和對照組成骨相關蛋白Runx2、Sp7、Ⅰ型膠原、OPN的表達。采用BCA法測定所提取總蛋白質濃度，以提取的蛋白質樣品各30 μg進行SDS-PAGE電泳。轉膜，封閉，先后孵育一抗和二抗，洗膜后暗室內顯影。通過X線片上不同免疫印跡條帶的強弱觀察目的蛋白表達變化趨勢，用Quantity one 軟件讀取條帶灰度值。實驗重復3 次，取均值。
1.4 成軟骨誘導分化相關檢測
1.4.1 成軟骨誘導分化
使用Micromass法進行成軟骨誘導。取第3代C3H10T1/2細胞，用0.25%胰蛋白酶-0.1%EDTA 37℃消化1 min，以離心半徑10 cm、1 000 r/min離心3 min，收集細胞。加入完全培養液重懸細胞，調整濃度至1 ×107個/mL。按10 μL/滴將高密度細胞懸液接種于12孔板內，每組設3個復孔。置于37℃、5%CO2培養箱內培養3 h后，將實驗分為兩組，成軟骨誘導組更換為成軟骨誘導培養基（含10%FBS、50 U/mL青霉素、50 mg/mL鏈霉素、1%ITS、40 μg/mL脯氨酸、100 nmol/L地塞米松、50 μg/mL維生素C、10 ng/mL TGF-β1的H-DMEM）；對照組更換為對照培養基（含10%FBS、50 U/ mL青霉素、50 mg/mL鏈霉素及與成軟骨誘導培養液等量的DMSO的H-DMEM）；每2天換液1次。光鏡下觀察細胞生長情況。
1.4.2 阿利新藍染色
成軟骨誘導0、5、10、15 d，對成軟骨誘導組行阿利新藍染色。吸棄培養液，PBS清洗2次，4%多聚甲醛-PBS固定20 min；吸棄固定液，PBS清洗5 min × 3次；加入阿利新藍染液染色10 min；PBS漂洗2次，光鏡下觀察。
1.4.3 RT-qPCR檢測成軟骨分化相關基因表達
成軟骨誘導0、5、10、15 d，采用RT-qPCR檢測成軟骨誘導組成軟骨相關基因SOX9、Ⅱ型膠原、蛋白多糖（Aggrecan）、透明質酸合成酶（Has2）的表達。引物序列： SOX9上游5'-CGGAACAGACTCACATCTCTCC-3'，下游5'-GCTTGCACGTCGGTTTTGG-3'；Ⅱ型膠原上游5'-CCTCAAGGCAAAGTTGGTCCT-3'，下游5'-C-TCCCGTCTCACCGTCTTTT-3'；Has2上游5'-TGAAC-AAAACGGTAGCACTCTG-3'，下游5'-ACTTTAATCC-CAGGGTAGGTCAG-3'；Aggrecan上游5'-ATTTCCA-CACGCTACACCCTG-3'，下游5'-TGGATGGGGTATC-TGACTGTC-3'；其余步驟同1.3.4方法。
1.4.4 Western
blot檢測成軟骨分化相關蛋白表達成軟骨誘導15 d，Western blot檢測成軟骨誘導組和對照組成軟骨分化相關蛋白SOX9、Ⅱ型膠原、Aggrecan、Has2的表達。實驗步驟同1.3.5。
1.5 篩選及驗證成骨和成軟骨分化過程中的差異miRNAs
分別收集第3代C3H10T1/2細胞（A組）及C3H10T1/2細胞成軟骨誘導分化完成后的細胞（B組）和成骨誘導分化完成后的細胞（C組），每組3個樣本。吸棄培養基，加入少量PBS洗滌1次；吸棄PBS，加入適量Trizol試劑，用移液器進行反復吹打，使細胞充分裂解。然后采用miRNA基因芯片進行檢測。所用芯片為Agilent Mouse miRNA芯片，每個標本使用1張芯片。Agilent掃描儀中選擇相應參數（掃描面積71.0 mm × 21.6 mm，激發波長532 nm和633 nm）掃描，Feature Extraction軟件讀取數據并進行分析，最后應用GENESPRING12.5軟件進行分位數標準化。對比3 組細胞的miRNA表達譜，篩選出在3組內兩兩比較有差異表達的miRNA。對上述篩選得到的備選miRNA進行合并去重，并選取2倍變化幅度、平均標準化信號值＞ 2的差異miRNA進行RT-qPCR驗證。所得RT-qPCR結果中所有數據均以A組為1作均一化處理，為相對表達量。
1.6 統計學方法
采用SPSS13.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，各時間點間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗；兩組間比較采用t檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 成骨誘導分化相關檢測
2.1.1 細胞形態學觀察
成骨誘導過程中細胞呈長梭形，形態變化不明顯；隨誘導時間延長，可見較低透光性區域，為鈣結節形成區域（圖 1）。
圖1
成骨誘導組各時間點細胞形態學觀察（×100） ? 7 d ? 14 d ? 21 d ? ?2.1.2 ALP定量檢測
成骨誘導7 d，對照組ALP表達量極低，為0.18 ± 0.02；成骨誘導組ALP表達量為0.71 ± 0.17，顯著高于對照組，差異有統計學意義（F=29.550，P=0.006）。
2.1.3 茜素紅染色
成骨誘導21 d，成骨誘導組茜素紅染色陽性，成骨效果明顯（圖 2）。
2.1.4 RT-qPCR檢測
成骨誘導7、14、21 d，Runx2、Sp7、Ⅰ型膠原及OPN mRNA相對表達量均顯著高于誘導0 d時，差異均有統計學意義（P＜ 0.05）；除Runx2 mRNA相對表達量14、21 d與7 d比較，以及OPN mRNA相對表達量21 d與14 d比較差異無統計學意義（P＞ 0.05）外，其余各目的基因各時間點間比較差異均有統計學意義（P＜ 0.05）。見圖 3。
2.1.5 Western
blot檢測成骨誘導21 d，成骨誘導組Runx2、Sp7、Ⅰ型膠原及OPN蛋白表達量分別為0.35 ± 0.03、0.33 ± 0.03、0.64 ± 0.09、0.24 ± 0.02，均顯著高于對照組的0.16 ± 0.02、0.16 ± 0.05、0.37 ± 0.02、 0.08 ± 0.01，差異均有統計學意義（P＜ 0.05）。見圖 4。
2.2 成軟骨誘導分化相關檢測
2.2.1 細胞形態學觀察
成軟骨誘導分化過程中，隨誘導時間延長，軟骨團塊逐漸增大（圖 5）。
2.2.2 阿利辛藍染色
隨誘導時間延長，軟骨團塊逐漸增大，阿利辛藍染色逐漸加深，成軟骨效果逐漸增強（圖 6）。
2.2.3 RT-qPCR檢測
成軟骨誘導5 d，SOX9和Aggrecan mRNA相對表達量高于誘導0 d時，差異有統計學意義（P＜ 0.05）；但Ⅱ型膠原和Has2 mRNA相對表達量與0 d時比較差異無統計學意義（P＞ 0.05）。成軟骨誘導10、15 d，各目的基因mRNA相對表達量均高于0 d時，差異有統計學意義（P＜ 0.05）。除SOX9、Ⅱ型膠原、Has2 mRNA相對表達量15 d和10 d比較差異無統計學意義（P＞ 0.05）外，其余各目的基因各時間點間比較差異均有統計學意義（P＜ 0.05）。見圖 7。
2.2.4 Western
blot檢測成軟骨誘導15 d，成軟骨誘導組SOX9、Ⅱ型膠原、Aggrecan、Has2蛋白表達量分別為0.37 ± 0.01、0.39 ± 0.04、0.18 ± 0.03、0.34 ± 0.04，均顯著高于對照組的0.18 ± 0.04、0.23 ± 0.02、0.05 ± 0.01、0.13 ± 0.03，差異均有統計學意義（P＜ 0.05）。見圖 8。
圖8
成軟骨誘導15 d Western blot檢測相關蛋白表達 1～3： 對照組 4～6：成軟骨誘導組
Figure8.
Western blot results of SOX,collagen type Ⅱ,Aggrecan,and Has2 proteins at 15 days after chondrogenic induced 1-3: Control group 4-6: Chondrogenic induced group
2.3 miRNA芯片篩選及驗證
A、C組間，A、B組間以及B、C組間分別有3、47、74個差異表達變化倍數＞ 2的miRNA；篩選出2 倍變化幅度且平均標準化信號值＞ 2的差異miRNA，A、B組有3個，A、C組有10個，見表 1、2。
表1
A、B組2倍變化幅度且平均標準化信號值＞ 2的差異miRNA
Table1.
Specific miRNA more than 2 fold change and 2 average normalized probe signal between group A and group B
表2
A、C組2倍變化幅度且平均標準化信號值＞ 2的差異miRNA
Table2.
Specific miRNA more than 2 fold change and 2 average normalized probe signal between group A and group C
各組之間篩選出來的差異miRNA 行 RT-qPCR 驗證，只有A、B組中篩選出的miR-455-3p存在不一致，其RT-qPCR結果在A、B組間變化程度明顯弱于其芯片結果。其余差異miRNA的RT-qPCR驗證結果在其組間變化趨勢與其芯片結果較為一致。見圖 9。
圖9
RT-qPCR驗證結果與芯片結果比較 ? miR-15b-5p ? miR-19b-3p ? miR-20a-5p ? miR-26a-5p ? miR-27a-3p ? miR-27b-3p ? miR-3096b-3p ? miR-3102-5p ? miR-322-5p ? miR-455-3p ? miR-5126 ? miR-92a-3p ? miR-99a-5p
Figure9.
Comparison of the results between by RT-qPCR and microarray ? miR-15b-5p ? miR-19b-3p ? miR-20a-5p ? miR-26a-5p ? miR-27a-3p ? miR-27b-3p ? miR-3096b-3p ? miR-3102-5p ? miR-322-5p ? miR-455-3p ? miR-5126 ? miR-92a-3p ? miR-99a-5p
3 討論
目前已知MSCs分化為軟骨細胞并進一步分化為成骨細胞有2條通路：① MSCs→軟骨細胞→肥大軟骨細胞→成骨細胞；② MSCs→成纖維細胞→軟骨細胞→成骨細胞分化（軟骨內骨化）。近年來隨著對miRNA研究的逐漸增多，對MSCs分化為成骨或成軟骨細胞的特異miRNA篩選也成為可能。很多研究發現[8-10]，每個miRNA可作用于一個或多個靶基因，也可同時產生抑制和/或促進作用，每個miRNA的靶基因之間也有可能出現重復的靶基因，證明靶基因的作用可能不是由單個miRNA決定，而是受多個miRNA影響。研究發現，同一個miRNA在細胞分化不同時期所起作用也不盡相同，如miRNA-29b在成骨分化初期為負性調控作用，促進成骨細胞分化，而在成骨分化礦化期起正性調控作用[8]。
C3H10T1/2細胞是小鼠的一種MSCs，具有多向分化潛能[11-13]。本研究通過將小鼠C3H10T1/2細胞誘導分化為成骨和成軟骨細胞，對分化前后細胞進行miRNA芯片檢測，篩選尋找在這兩種分化方向中起關鍵作用的miRNA，為進一步研究尋找成骨和成軟骨分化調控機制，并通過對特異miRNA表達的調節促進或阻止成骨和成軟骨分化奠定理論基礎。
3.1 miRNA在成骨分化中的調控作用
研究表明[9-10, 14-19]，在成骨分化過程中，Wnt、BMP、TGF-β是關鍵信號通路。目前有不少研究表明，一些miRNA能通過對不同靶基因作用以及激活不同的信號傳導通路，在成骨分化過程中起調控作用。如經典Wnt 信號通路被認為是MSCs成骨分化中非常重要的調控機制，研究發現miR-29a可通過抑制Wnt信號通路的負性調控基因Dkk1、Kremen2和sFRP2表達，促進細胞成骨分化[9]；此外，Wnt信號表達又可促進miR-29a表達。因此miR-29a和經典Wnt信號通路之間形成了一個正反饋循環，使得miR-29a-Wnt信號通路能更有效促進成骨分化[14]。此外有研究發現miR-335-5p可通過抑制Dkk1提高糖原合成酶激酶-3β磷酸化和增加β-連環蛋白的轉錄活性，進而加強Wnt信號通路[15]。同樣BMP信號通路對于MSCs的成骨分化也具有關鍵作用。Runx2基因在成骨細胞中有著重要作用，可促進膠原蛋白、骨涎蛋白、骨鈣素、OPN等基因的表達，而BMP可以刺激P300介導的Runx2乙酰化，從而上調Runx2的基因表達，同時又抑制Smurf1介導的Runx2下調作用[16]。因此miRNA、BMP和Runx2共同組成了調控細胞成骨分化信號網絡的關鍵部分[17]。已有研究發現一些特定miRNA在成骨分化中起關鍵作用。研究表明miR-20b可通過激活成骨分化中的關鍵轉錄因子Runx2以及抑制PPARγ、Bambi和Crim1等基因表達，最終增強BMP信號通路，誘導成骨分化[10]。miR-125b也可通過調節細胞增殖來阻止BMP-4誘導成骨細胞分化[18]。研究表明TGF-β3可抑制成骨分化，同時miR-29b可阻止TGF-β3對成骨分化的抑制，最終促進細胞成骨分化[8]。此外miR-210也可通過對TGF-β1受體活性的抑制而促進成骨分化[19]。
3.2 miRNA在成軟骨分化中的調控作用
組蛋白去乙酰化酶在非肥大分化的軟骨細胞中特異表達，它通過抑制Runx2以調控軟骨細胞肥大分化。許多研究表明[20-21]，miR-140可以阻止組蛋白去乙酰化酶的表達，從而消除其對Runx2的抑制作用，最終造成軟骨細胞肥大分化。而miR-199a通過直接作用于Smad1轉錄因子，抑制細胞早期的軟骨分化[22]。也有學者發現miR-18a和miR-488調節軟骨分化的啟動子和基質金屬蛋白酶2附和激活子CCN2，從而影響細胞軟骨分化過程[23-24]。有研究人員通過基因芯片技術和熒光素酶檢測發現，miR-145可直接作用其靶基因SOX9，對細胞成軟骨分化起負性調節[25]，也有報道發現miR-145能下調Runx2表達[26]。研究發現miR-199通過對Smad1轉錄因子的調控從而影響C3H10T1/2細胞軟骨分化過程[22]。有學者通過對雞的MSCs miRNA表達譜分析，發現miR-221能夠促進軟骨細胞增殖[27]，也有研究發現miR-221能夠明顯增加軟骨細胞增殖和軟骨特異性基質合成[28]。近年來，很多針對骨關節炎的研究也發現了一些miRNA在軟骨退變導致骨關節炎過程起重要調控作用。如miR-146a在關節軟骨表面的軟骨細胞中大量表達，而在輕度骨關節炎患者關節軟骨中也有大量表達，并且隨軟骨退變加重其表達降低[29]；可能是因為miR-146a下調IRAK1和TRAF6的表達，進而使基質金屬蛋白酶13表達受阻。最近也有學者發現[30]，LEF-1基因是調控軟骨正常分化和成熟的關鍵因素，而miR-449a能直接與之結合，導致Sox9基因表達減少，繼而阻止細胞的軟骨分化。
本實驗成功將小鼠C3H10T1/2細胞誘導分化為成骨和成軟骨細胞，并通過miRNA芯片技術篩選出變化幅度超過2倍且平均標準化信號值＞ 2的miRNA，其中成骨分化的差異miRNAs有10個，包括miR-27a-3p、miR-27b-3p、miR-26a-5p、miR-322-5p、miR-19b-3p、miR-99a-5p、miR-20a-5p、miR-15b-5p、miR-3096b-3p、miR-92a-3p。miR-27已被證實可通過直接作用于靶基因APC，造成β-連環蛋白的積累，最終激活Wnt信號通路，促進 hFOB1.19細胞成骨分化[31]。也有研究發現[32]，miR-26a可通過抑制其靶基因Smad1的表達，從而抑制脂肪來源干細胞的成骨分化。其他miRNA目前尚無研究發現與細胞成骨分化相關，但其中一些miRNA與細胞其他活動相關。如miR-15b通過去靶基因Bcl-2及半胱天冬信號通路，可能在細胞凋亡過程中起關鍵作用[33]。也有研究發現miR-19b抑制其靶細胞轉錄因子NeuroD1的表達，進而調節胰島β細胞功能及其分化過程[34]。篩選出成軟骨分化的差異miRNA有3個，包括miR-3102-5p、miR-455-3p、miR-5126。有研究發現miR-455-3p可能是骨關節炎發病機制中的關鍵因素，它通過抑制TGF-β信號造成關節出現骨關節炎變化[35]。其他兩個miRNA未見其功能報道。
本實驗篩選出的差異miRNA有部分已被證實其功能與細胞成骨或成軟骨分化相關，驗證了本實驗篩選的準確性。但由于細胞種類不同或分化方法不同，其中更多的是功能未證實的全新miRNA，下一步研究可對RT-qPCR驗證成功的miRNA進行功能驗證和靶基因研究，尤其是對無相關功能報道的miRNA進一步研究，以驗證這些miRNA在成骨和成軟骨分化中的作用。
