引用本文： 劉衛華, 劉漪淪, 劉海榮, 羅永慧, 徐金眉. Pax6基因轉染對脂肪來源間充質干細胞的誘導分化研究. 中國修復重建外科雜志, 2014, 28(8): 1004-1008. doi: 10.7507/1002-1892.20140221 復制
組織工程角膜為解決角膜供體緊缺提供了重要途徑[1-3]。尋找安全、來源充足的角膜上皮種子細胞仍是現階段研究重點。近年來，脂肪來源間充質干細胞（adipose-derived mesenchymal stem cells，ADMSCs）作為種子細胞逐漸受到關注。它具有取材簡便、來源充足、免疫原性弱、易培養等優勢[4-5]。Pax6是眼發育相關的調控轉錄因子，在調控眼角膜分化方面起著重要作用；研究發現，胚胎干細胞在Pax6基因誘導下，能夠定向分化為角膜上皮樣細胞，能有效修復堿燒傷角膜[6]。本研究擬以小鼠ADMSCs作為種子細胞，以脂質體介導Pax6基因真核表達質粒進行轉染，探索其對ADMSCs成角膜上皮樣細胞誘導分化的作用及機制，以期為組織工程角膜研究提供有效上皮細胞來源。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
健康5～6周齡C57BL/6小鼠6只，雌雄不限，體重18～22 g，由四川省醫學動物實驗中心提供。
L-DMEM培養基、FBS、胰蛋白酶、DMSO、Ⅰ型膠原酶、G418（GIBCO公司，美國）；CD29-FITC、CD44-PE、CD105-PE、CD34-FITC、CD45-PE抗體（Sigma公司，美國）；兔源Pax6多克隆抗體（上海愛柏生物科技有限公司）；羊源細胞角蛋白12（cytokeratin 12，CK-12）多克隆抗體（Santa Cruz公司，美國）；羊抗兔二抗、兔抗羊二抗（Jackson公司，美國）；pcDNA3.1-Pax6重組質粒、pcDNA3.1空質粒（廣州復能基因有限公司），其中插入的Pax6基因采用GenBank中NM_013627，開放閱讀框長度為1 311 bp；無內毒素質粒抽提試劑盒（Omega公司，美國）；陽離子脂質體轉染試劑Lipofectamine? 2000、Opti-MEM? 培養基（ThermoFisher Scientific公司，美國）；細胞總RNA提取試劑盒（Qiagen公司，德國）；逆轉錄試劑盒（PrimeScript?RT reagent Kit）、SYBR?GreenⅠ定量試劑（TaKaRa大連寶生物工程公司）。
DS-Ri1倒置熒光顯微鏡（Nikon公司，日本）；AccuriTM C6流式細胞儀（BD公司，美國）；NanoDrop 2000核酸檢測儀（ThermoFisher Scientific公司，美國）；LAS-3000化學發光成像系統（FUJIFILM公司，日本）；CFX96TM實時熒光定量PCR儀（Bio-Rad公司，美國）。
1.2 ADMSCs分離培養及鑒定
取6只C57BL/6小鼠，10%水合氯醛腹腔注射（6 μL/g）麻醉后頸椎脫臼法處死，75%乙醇浸泡消毒15 min；于超凈臺內無菌切取小鼠雙側腹股溝脂肪，去除肉眼所見的纖維組織后，PBS洗滌3次，充分剪碎至約1 mm × 1 mm × 1 mm大小，加入2倍體積0.075%Ⅰ型膠原酶，37℃恒溫水浴箱振蕩消化50 min至外觀呈糜狀；以等量含10%FBS的DMEM培養基終止消化，200目濾網過濾去除大塊未消化脂肪碎塊；以離心半徑15 cm、1 300 r/min離心10 min，棄上清；加入PBS重懸，同上法離心，反復2次；計數后以1 ×108個/L密度接種于細胞培養瓶中，30 min后采用差速貼壁法[7-8]將培養基轉移至另一新的培養瓶繼續培養。24 h換液，以后每3天更換培養基，細胞融合約90%時傳代培養。倒置顯微鏡觀察細胞形態學變化。
取第3代細胞以0.25%胰蛋白酶消化后，PBS洗滌3次，制備密度為1 ×1010個/L的細胞懸液，分成每管100 μL，分別加入20 μL CD29-FITC、CD44-PE、CD105-PE、CD34-FITC、CD45-PE抗體工作液，室溫孵育30 min。同種熒光標記的IgG作為相應陰性對照，流式細胞儀檢測分析。
1.3 細胞轉染與G418篩選
實驗設未轉染組（A組）、pcDNA3.1空質粒組（B組）和pcDNA3.1-Pax6重組質粒組（C組）。取生長狀態良好的第3代ADMSCs，以0.5 ×105個/孔接種于24孔板，每組設3個復孔，用含10%FBS的DMEM培養基培養24 h后，按照Lipofectamine?2000說明書進行轉染。其中A組不加質粒，B、C組分別加入pcDNA3.1空質粒和pcDNA3.1-Pax6重組質粒；其余轉染步驟均相同。取EP管2個，其中一管加入25 μL Opti-MEM? 培養基和500 ng DNA，另一管加入25 μL Opti-MEM?培養基和1.25 μL Lipofectamine?2000，分別混勻，20℃靜置5 min，將兩管內容物混勻，20℃靜置20 min后加入培養孔中，5 h后換液。48 h后，B、C組細胞以初始濃度為800 μg/mL的G418培養基換液篩選細胞（G418所用濃度均根據說明書進行預實驗篩選確定），每日倒置顯微鏡下觀察細胞存活情況與形態變化；7 d后當細胞停止死亡并有少量新分裂增殖的干細胞生長時，改為400 μg/mL的G418培養基維持篩選，14 d后根據鏡下細胞克隆形態特點將其分類、挑選傳代，取第3代細胞用于進一步檢測。A組細胞不進行G418篩選，繼續常規培養傳代，并用于進一步檢測。
1.4 Western blot檢測細胞Pax6及CK-12蛋白表達
經上述處理獲得的各組細胞分別以4 ×105個/ 孔接種于6孔板，24 h后以0.25%胰蛋白酶消化，收集細胞于離心管；預冷PBS洗2次，棄上清，加入細胞裂解液，冰上孵育30 min，期間震蕩3次；以離心半徑15 cm、13 000 r/min離心30 min，取上清行Pax6及CK-12蛋白定量。每個樣本取30 μg總蛋白，在12.5%分離膠作用下行SDS-PAGE電泳117 V、110 min，轉膜50 V、90 min，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h；分別以兔源Pax6多克隆抗體以及羊源CK-12多克隆抗體4℃孵育過夜，TBST洗膜3次，20 min/次，分別加入羊抗兔二抗以及兔抗羊二抗孵育2 h，TBST洗膜3次，20 min/次；ECL反應液孵育4 min，透明薄膜密封，以LAS-3000化學發光成像系統進行曝光檢測。
1.5 實時熒光定量 PCR檢測CK-12 mRNA表達
按細胞總RNA提取試劑盒說明書提取細胞總RNA，采用NanoDrop2000核酸檢測儀提取細胞總RNA，采用PrimeScript?RT reagent Kit進行逆轉錄，每10微升反應體系含400 ng總RNA，37℃逆轉錄15 min、85℃逆轉錄酶失活反應5 s，制備足量cDNA于- 20℃保存備用。以β-actin基因作為內參，采用相對定量法測定CK-12 mRNA表達。采用CFX96TM實時熒光定量PCR儀，SYBR?GreenⅠ定量試劑進行定量擴增。總反應體系為10 μL，包含上、下游引物各0.4μL，ROX Reference Dye 0.2 μL，cDNA 0.5 μL，滅菌蒸餾水3.5 μL以及5 μL SYBR Premix Ex TaqTMⅡ（含TaKaRa Ex Taq HS、dNTP Mixture、Mg2+、SYBR GreenⅠ）。反應條件：95℃、30 s，95℃、5 s，60℃、30 s，共40個循環。引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成，引物序列：CK-12上游：5'-CGAGAGTGG-TATGAAACA-3'，下游：5'-TGGGCTCTCATTTCATTG-3'；β-actin上游：5'-GATGACGATATCGCTGCGCTG-3'，下游：5'-GTACGACCAGAGGCATACAGG-3'。各組均設3個復孔。內參基因和目的基因的擴增效率均為90%～110%，熔解曲線均為單一峰值，基線平穩。采用2-ΔΔCt法[9]計算目的基因相對表達量。
1.6 統計學方法
采用SAS9.2統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 ADMSCs形態學觀察與表型鑒定
原代細胞接種后3～5 d，呈梭形、三角形或不規則形；12～14 d 細胞融合達80%；傳代后細胞貼壁和生長速度加快，7～10 d細胞融合達80%左右，第3代細胞形態趨于一致，呈梭形，類似成纖維細胞。見圖 1。流式細胞儀檢測示，第3代ADMSCs CD29陽性表達率為98.82%，CD44為99.67%，CD105為96.22%，CD34為0.15%，CD45為0.19%。
圖1
ADMSCs形態學觀察（倒置顯微鏡×100） ? 原代細胞培養5 d ? 第3代細胞培養3 d ? ?2.2 G418篩選轉染后ADMSCs形態學觀察
A組細胞形態無改變。B、C組細胞轉染后采用G418篩選，大部分細胞逐漸凋亡，14 d可見細胞呈克隆樣生長，其中B組細胞形態未發生改變，C組呈現兩類不同形態的細胞克隆，一類克隆細胞呈“鋪路石”狀，立體感增強，增殖較快，形態類似角膜上皮細胞，命名為篩選克隆1；另一類克隆細胞形狀較大，似網狀，有3～7個細胞突起，增殖較緩慢，命名為篩選克隆2。見圖 2。
2.3 Western blot檢測細胞Pax6及CK-12蛋白表達
C組篩選克隆1、篩選克隆2均有Pax6蛋白表達，而A、B組無Pax6蛋白表達，提示Pax6基因轉染成功；見圖 3。僅C組篩選克隆1有CK-12蛋白表達，其余3組均為陰性；見圖 4。
2.4 實時熒光定量 PCR檢測CK-12 mRNA表達
C組篩選克隆1的CK-12 mRNA相對表達量為8.64 ± 0.73，高于篩選克隆2（0.55 ± 0.42）、B組（1.36 ± 0.40）和A組（1.00 ± 0.00），差異有統計學意義（P＜ 0.05）；A、B組及C組篩選克隆1比較差異均無統計學意義（P＞ 0.05）。見圖 5。
3 討論
近年來，人們在誘導MSCs分化為角膜上皮樣細胞方面進行了大量嘗試，并獲得成功。徐舒怡等[10]采用臍帶MSCs種植于去上皮的豬角膜基質上，移植于兔眼，MSCs成功分化為角膜上皮樣細胞；姜廷帥等[11]采用大鼠BMSCs經體外與角膜基質細胞共培養誘導分化，檢測到角膜上皮細胞特異標志物CK-12表達。這些研究主要通過改變生存微環境來誘導MSCs分化為角膜上皮樣細胞。本研究希望通過轉錄因子基因轉染，誘導ADMSCs體外分化為角膜上皮樣細胞，以進一步探索誘導分化的內在分子機制。研究結果發現，陽離子脂質體介導pcDNA3.1-Pax6重組質粒成功轉染ADMSCs，并能夠誘導其形態、功能發生變化。C組篩選克隆1細胞陽性表達Pax6，形態由梭形成纖維細胞狀變為“鋪路石”狀，接近角膜上皮細胞；進一步檢測角膜上皮細胞特異性標志分子CK-12 mRNA和蛋白表達均呈陽性，提示Pax6作為轉錄因子發揮調控作用，能夠誘導ADMSCs向角膜上皮樣細胞分化。
Pax6是與角膜、晶狀體、神經視網膜等發育密切相關的轉錄因子[12-14]，其編碼產物屬于DNA結合蛋白家族，其結構中除含配對盒結構域外，尚有另一DNA結合區，即同源結構域。二者在功能上均屬于高度保守的轉錄因子，通過識別、結合特定DNA序列而調節靶基因表達，并具有潛在DNA激活功能[15]。García-Villegas等[16]研究發現，Pax6是角膜上皮細胞分化過程中最早表達的分子之一，比M型與H型乳酸脫氫酶表達更早，因此推測其為角膜上皮樣細胞分化的驅動因素。Ueno等[6]研究發現，Pax6基因轉染能夠誘導小鼠胚胎干細胞向角膜上皮樣細胞分化，表達CK-12等重要標志物，能夠修復小鼠堿燒傷角膜。本實驗結果表明，Pax6能夠從轉錄水平調控CK-12表達，誘導小鼠ADMSCs分化為角膜上皮樣細胞。提示Pax6在干細胞向角膜上皮樣細胞誘導分化中可能起驅動作用，但具體調控機制和相關分子網絡尚需進一步研究。
在篩選出的Pax6陽性表達細胞克隆中，同時存在另一類細胞克隆，其形態似網狀伸展，有3～7個細胞突起，與對照組、空質粒組細胞一樣，CK-12 mRNA和蛋白表達均為陰性。文獻報道[6, 17]，Pax6對干細胞的誘導分化，除了能分化為角膜上皮樣細胞外，還可能誘導分化為神經細胞。因此，通過Pax6單基因轉染誘導能夠促使MSCs向角膜上皮樣細胞分化，但卻不是單向分化。目前研究者傾向于采用多基因或多個化學小分子聯合誘導來達到多向分化的目的[18-19]，并強調微環境對干細胞分化的影響[20-21]。我們認為，進一步研究Pax6轉錄因子在MSCs多向分化中的調控機制和分子網絡，將有助于尋找高效誘導獲取角膜上皮樣細胞的方法；下一步我們亦將嘗試基因轉染與微環境調節相結合的方式，探索MSCs向角膜上皮樣細胞分化的機制。
組織工程角膜為解決角膜供體緊缺提供了重要途徑[1-3]。尋找安全、來源充足的角膜上皮種子細胞仍是現階段研究重點。近年來，脂肪來源間充質干細胞（adipose-derived mesenchymal stem cells，ADMSCs）作為種子細胞逐漸受到關注。它具有取材簡便、來源充足、免疫原性弱、易培養等優勢[4-5]。Pax6是眼發育相關的調控轉錄因子，在調控眼角膜分化方面起著重要作用；研究發現，胚胎干細胞在Pax6基因誘導下，能夠定向分化為角膜上皮樣細胞，能有效修復堿燒傷角膜[6]。本研究擬以小鼠ADMSCs作為種子細胞，以脂質體介導Pax6基因真核表達質粒進行轉染，探索其對ADMSCs成角膜上皮樣細胞誘導分化的作用及機制，以期為組織工程角膜研究提供有效上皮細胞來源。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
健康5～6周齡C57BL/6小鼠6只，雌雄不限，體重18～22 g，由四川省醫學動物實驗中心提供。
L-DMEM培養基、FBS、胰蛋白酶、DMSO、Ⅰ型膠原酶、G418（GIBCO公司，美國）；CD29-FITC、CD44-PE、CD105-PE、CD34-FITC、CD45-PE抗體（Sigma公司，美國）；兔源Pax6多克隆抗體（上海愛柏生物科技有限公司）；羊源細胞角蛋白12（cytokeratin 12，CK-12）多克隆抗體（Santa Cruz公司，美國）；羊抗兔二抗、兔抗羊二抗（Jackson公司，美國）；pcDNA3.1-Pax6重組質粒、pcDNA3.1空質粒（廣州復能基因有限公司），其中插入的Pax6基因采用GenBank中NM_013627，開放閱讀框長度為1 311 bp；無內毒素質粒抽提試劑盒（Omega公司，美國）；陽離子脂質體轉染試劑Lipofectamine? 2000、Opti-MEM? 培養基（ThermoFisher Scientific公司，美國）；細胞總RNA提取試劑盒（Qiagen公司，德國）；逆轉錄試劑盒（PrimeScript?RT reagent Kit）、SYBR?GreenⅠ定量試劑（TaKaRa大連寶生物工程公司）。
DS-Ri1倒置熒光顯微鏡（Nikon公司，日本）；AccuriTM C6流式細胞儀（BD公司，美國）；NanoDrop 2000核酸檢測儀（ThermoFisher Scientific公司，美國）；LAS-3000化學發光成像系統（FUJIFILM公司，日本）；CFX96TM實時熒光定量PCR儀（Bio-Rad公司，美國）。
1.2 ADMSCs分離培養及鑒定
取6只C57BL/6小鼠，10%水合氯醛腹腔注射（6 μL/g）麻醉后頸椎脫臼法處死，75%乙醇浸泡消毒15 min；于超凈臺內無菌切取小鼠雙側腹股溝脂肪，去除肉眼所見的纖維組織后，PBS洗滌3次，充分剪碎至約1 mm × 1 mm × 1 mm大小，加入2倍體積0.075%Ⅰ型膠原酶，37℃恒溫水浴箱振蕩消化50 min至外觀呈糜狀；以等量含10%FBS的DMEM培養基終止消化，200目濾網過濾去除大塊未消化脂肪碎塊；以離心半徑15 cm、1 300 r/min離心10 min，棄上清；加入PBS重懸，同上法離心，反復2次；計數后以1 ×108個/L密度接種于細胞培養瓶中，30 min后采用差速貼壁法[7-8]將培養基轉移至另一新的培養瓶繼續培養。24 h換液，以后每3天更換培養基，細胞融合約90%時傳代培養。倒置顯微鏡觀察細胞形態學變化。
取第3代細胞以0.25%胰蛋白酶消化后，PBS洗滌3次，制備密度為1 ×1010個/L的細胞懸液，分成每管100 μL，分別加入20 μL CD29-FITC、CD44-PE、CD105-PE、CD34-FITC、CD45-PE抗體工作液，室溫孵育30 min。同種熒光標記的IgG作為相應陰性對照，流式細胞儀檢測分析。
1.3 細胞轉染與G418篩選
實驗設未轉染組（A組）、pcDNA3.1空質粒組（B組）和pcDNA3.1-Pax6重組質粒組（C組）。取生長狀態良好的第3代ADMSCs，以0.5 ×105個/孔接種于24孔板，每組設3個復孔，用含10%FBS的DMEM培養基培養24 h后，按照Lipofectamine?2000說明書進行轉染。其中A組不加質粒，B、C組分別加入pcDNA3.1空質粒和pcDNA3.1-Pax6重組質粒；其余轉染步驟均相同。取EP管2個，其中一管加入25 μL Opti-MEM? 培養基和500 ng DNA，另一管加入25 μL Opti-MEM?培養基和1.25 μL Lipofectamine?2000，分別混勻，20℃靜置5 min，將兩管內容物混勻，20℃靜置20 min后加入培養孔中，5 h后換液。48 h后，B、C組細胞以初始濃度為800 μg/mL的G418培養基換液篩選細胞（G418所用濃度均根據說明書進行預實驗篩選確定），每日倒置顯微鏡下觀察細胞存活情況與形態變化；7 d后當細胞停止死亡并有少量新分裂增殖的干細胞生長時，改為400 μg/mL的G418培養基維持篩選，14 d后根據鏡下細胞克隆形態特點將其分類、挑選傳代，取第3代細胞用于進一步檢測。A組細胞不進行G418篩選，繼續常規培養傳代，并用于進一步檢測。
1.4 Western blot檢測細胞Pax6及CK-12蛋白表達
經上述處理獲得的各組細胞分別以4 ×105個/ 孔接種于6孔板，24 h后以0.25%胰蛋白酶消化，收集細胞于離心管；預冷PBS洗2次，棄上清，加入細胞裂解液，冰上孵育30 min，期間震蕩3次；以離心半徑15 cm、13 000 r/min離心30 min，取上清行Pax6及CK-12蛋白定量。每個樣本取30 μg總蛋白，在12.5%分離膠作用下行SDS-PAGE電泳117 V、110 min，轉膜50 V、90 min，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h；分別以兔源Pax6多克隆抗體以及羊源CK-12多克隆抗體4℃孵育過夜，TBST洗膜3次，20 min/次，分別加入羊抗兔二抗以及兔抗羊二抗孵育2 h，TBST洗膜3次，20 min/次；ECL反應液孵育4 min，透明薄膜密封，以LAS-3000化學發光成像系統進行曝光檢測。
1.5 實時熒光定量 PCR檢測CK-12 mRNA表達
按細胞總RNA提取試劑盒說明書提取細胞總RNA，采用NanoDrop2000核酸檢測儀提取細胞總RNA，采用PrimeScript?RT reagent Kit進行逆轉錄，每10微升反應體系含400 ng總RNA，37℃逆轉錄15 min、85℃逆轉錄酶失活反應5 s，制備足量cDNA于- 20℃保存備用。以β-actin基因作為內參，采用相對定量法測定CK-12 mRNA表達。采用CFX96TM實時熒光定量PCR儀，SYBR?GreenⅠ定量試劑進行定量擴增。總反應體系為10 μL，包含上、下游引物各0.4μL，ROX Reference Dye 0.2 μL，cDNA 0.5 μL，滅菌蒸餾水3.5 μL以及5 μL SYBR Premix Ex TaqTMⅡ（含TaKaRa Ex Taq HS、dNTP Mixture、Mg2+、SYBR GreenⅠ）。反應條件：95℃、30 s，95℃、5 s，60℃、30 s，共40個循環。引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成，引物序列：CK-12上游：5'-CGAGAGTGG-TATGAAACA-3'，下游：5'-TGGGCTCTCATTTCATTG-3'；β-actin上游：5'-GATGACGATATCGCTGCGCTG-3'，下游：5'-GTACGACCAGAGGCATACAGG-3'。各組均設3個復孔。內參基因和目的基因的擴增效率均為90%～110%，熔解曲線均為單一峰值，基線平穩。采用2-ΔΔCt法[9]計算目的基因相對表達量。
1.6 統計學方法
采用SAS9.2統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 ADMSCs形態學觀察與表型鑒定
原代細胞接種后3～5 d，呈梭形、三角形或不規則形；12～14 d 細胞融合達80%；傳代后細胞貼壁和生長速度加快，7～10 d細胞融合達80%左右，第3代細胞形態趨于一致，呈梭形，類似成纖維細胞。見圖 1。流式細胞儀檢測示，第3代ADMSCs CD29陽性表達率為98.82%，CD44為99.67%，CD105為96.22%，CD34為0.15%，CD45為0.19%。
圖1
ADMSCs形態學觀察（倒置顯微鏡×100） ? 原代細胞培養5 d ? 第3代細胞培養3 d ? ?2.2 G418篩選轉染后ADMSCs形態學觀察
A組細胞形態無改變。B、C組細胞轉染后采用G418篩選，大部分細胞逐漸凋亡，14 d可見細胞呈克隆樣生長，其中B組細胞形態未發生改變，C組呈現兩類不同形態的細胞克隆，一類克隆細胞呈“鋪路石”狀，立體感增強，增殖較快，形態類似角膜上皮細胞，命名為篩選克隆1；另一類克隆細胞形狀較大，似網狀，有3～7個細胞突起，增殖較緩慢，命名為篩選克隆2。見圖 2。
2.3 Western blot檢測細胞Pax6及CK-12蛋白表達
C組篩選克隆1、篩選克隆2均有Pax6蛋白表達，而A、B組無Pax6蛋白表達，提示Pax6基因轉染成功；見圖 3。僅C組篩選克隆1有CK-12蛋白表達，其余3組均為陰性；見圖 4。
2.4 實時熒光定量 PCR檢測CK-12 mRNA表達
C組篩選克隆1的CK-12 mRNA相對表達量為8.64 ± 0.73，高于篩選克隆2（0.55 ± 0.42）、B組（1.36 ± 0.40）和A組（1.00 ± 0.00），差異有統計學意義（P＜ 0.05）；A、B組及C組篩選克隆1比較差異均無統計學意義（P＞ 0.05）。見圖 5。
3 討論
近年來，人們在誘導MSCs分化為角膜上皮樣細胞方面進行了大量嘗試，并獲得成功。徐舒怡等[10]采用臍帶MSCs種植于去上皮的豬角膜基質上，移植于兔眼，MSCs成功分化為角膜上皮樣細胞；姜廷帥等[11]采用大鼠BMSCs經體外與角膜基質細胞共培養誘導分化，檢測到角膜上皮細胞特異標志物CK-12表達。這些研究主要通過改變生存微環境來誘導MSCs分化為角膜上皮樣細胞。本研究希望通過轉錄因子基因轉染，誘導ADMSCs體外分化為角膜上皮樣細胞，以進一步探索誘導分化的內在分子機制。研究結果發現，陽離子脂質體介導pcDNA3.1-Pax6重組質粒成功轉染ADMSCs，并能夠誘導其形態、功能發生變化。C組篩選克隆1細胞陽性表達Pax6，形態由梭形成纖維細胞狀變為“鋪路石”狀，接近角膜上皮細胞；進一步檢測角膜上皮細胞特異性標志分子CK-12 mRNA和蛋白表達均呈陽性，提示Pax6作為轉錄因子發揮調控作用，能夠誘導ADMSCs向角膜上皮樣細胞分化。
Pax6是與角膜、晶狀體、神經視網膜等發育密切相關的轉錄因子[12-14]，其編碼產物屬于DNA結合蛋白家族，其結構中除含配對盒結構域外，尚有另一DNA結合區，即同源結構域。二者在功能上均屬于高度保守的轉錄因子，通過識別、結合特定DNA序列而調節靶基因表達，并具有潛在DNA激活功能[15]。García-Villegas等[16]研究發現，Pax6是角膜上皮細胞分化過程中最早表達的分子之一，比M型與H型乳酸脫氫酶表達更早，因此推測其為角膜上皮樣細胞分化的驅動因素。Ueno等[6]研究發現，Pax6基因轉染能夠誘導小鼠胚胎干細胞向角膜上皮樣細胞分化，表達CK-12等重要標志物，能夠修復小鼠堿燒傷角膜。本實驗結果表明，Pax6能夠從轉錄水平調控CK-12表達，誘導小鼠ADMSCs分化為角膜上皮樣細胞。提示Pax6在干細胞向角膜上皮樣細胞誘導分化中可能起驅動作用，但具體調控機制和相關分子網絡尚需進一步研究。
在篩選出的Pax6陽性表達細胞克隆中，同時存在另一類細胞克隆，其形態似網狀伸展，有3～7個細胞突起，與對照組、空質粒組細胞一樣，CK-12 mRNA和蛋白表達均為陰性。文獻報道[6, 17]，Pax6對干細胞的誘導分化，除了能分化為角膜上皮樣細胞外，還可能誘導分化為神經細胞。因此，通過Pax6單基因轉染誘導能夠促使MSCs向角膜上皮樣細胞分化，但卻不是單向分化。目前研究者傾向于采用多基因或多個化學小分子聯合誘導來達到多向分化的目的[18-19]，并強調微環境對干細胞分化的影響[20-21]。我們認為，進一步研究Pax6轉錄因子在MSCs多向分化中的調控機制和分子網絡，將有助于尋找高效誘導獲取角膜上皮樣細胞的方法；下一步我們亦將嘗試基因轉染與微環境調節相結合的方式，探索MSCs向角膜上皮樣細胞分化的機制。
