引用本文： 郭興鋒, 侯春林, 竇源東, 林曄, 雷德橋. 幾丁糖電紡膜預防腦脊液漏遠期效果的實驗研究. 中國修復重建外科雜志, 2014, 28(8): 993-997. doi: 10.7507/1002-1892.20140219 復制
在神經外科修復缺損的硬膜對于維持解剖結構完整性和保護腦組織具有重要意義。目前，臨床使用的硬膜修復材料均未達到理想標準，如生物膠原空間網狀結構不明顯[1]，不利于成纖維細胞支撐與附著；絲素蛋白膜在制作工藝上有不少缺陷[2]；羊膜取材方法難以控制；高分子聚合材料有一定生物學毒性。且以上材料基本為復合材料[3]，生產工藝復雜，成本高。為了降低成本，我們期望尋找單一材料的修復材料。幾丁糖具備良好組織相容性[4]，可被機體降解吸收[5]。目前，本課題組已成功制備了幾丁糖膜，但仍與理想硬膜修復材料有較大差距，主要問題包括與組織貼服不佳，脆性較大，術中難以固定，縫合強度不足等[6-7]。為此，我們改變制備方法，采用電紡技術制備幾丁糖電紡膜，體外生物力學試驗表明其具有強度大、厚度薄、柔韌性好等優點，動物實驗表明其預防腦脊液漏即刻效果確切[8]。本研究旨在觀察幾丁糖電紡膜預防腦脊液漏的遠期效果，為其在臨床推廣應用奠定實驗基礎。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
健康成年新西蘭家兔25只，雌雄不限，體重2.3～ 3.1 kg，由第二軍醫大學動物實驗中心提供。幾丁糖電紡膜（本課題組研制），纖維絲直徑約300 nm，厚度約0.13 mm，制成1 cm × 1 cm大小。兔抗EGF受體（EGF receptor，EGFR）、抗bFGF、辣根過氧化物酶（上海楷洋生物工程有限公司）。BX41顯微鏡（Olympus公司，日本）；Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件（Media Cybernetics公司，美國）。
1.2 動物模型制備及分組
取新西蘭家兔25只，耳緣靜脈注射3%戊巴比妥鈉（30 mg/kg）麻醉。取頭部正中切口，縱形切開頭皮，逐層分離至顱骨骨膜，微型磨鉆在雙側顱骨頂部制備直徑約1.2 cm的對稱圓形骨窗，于手術顯微鏡下制備0.8 cm × 0.8 cm大小硬膜缺損。右側硬膜缺損區采用幾丁糖電紡膜修復（實驗組），四角用5-0縫線間斷縫合固定；左側缺損不修復，作為對照組。見圖 1。術后實驗動物單籠飼養。
圖1
動物模型制備示意圖 ? 雙側開對稱骨窗，剪去硬膜組織 ? 幾丁糖電紡膜植入右側硬膜缺損區 ? ?1.3 觀測指標
1.3.1 大體觀察
術后2～16周，每周處死1只動物，觀察切口愈合情況，并按原切口入路，觀察骨窗周圍局部炎性反應和幾丁糖電紡膜吸收情況。
1.3.2 組織學觀察
術后3、6 周各隨機處死5只動物，切取骨窗、幾丁糖電紡膜周圍1 cm × 1 cm皮膚標本，10%中性甲醛固定，切片，片厚 5 μm。取部分切片常規行HE及Masson染色，觀察骨窗及幾丁糖電紡膜周圍組織病理學改變以及膠原化情況。各時間點兩組每個標本取1張HE染色切片，于100倍鏡下各取5個視野，采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件行炎性細胞計數，取均值。
1.3.3 免疫組織化學染色觀察
取部分切片常規脫蠟至水，依次滴加一抗及二抗，充分沖洗、復染、脫水、透明，封片。光鏡下觀察骨窗及幾丁糖電紡膜周圍組織bFGF和EGFR表達情況。
1.4 統計學方法
采用SPSS16.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用配對t檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 大體觀察
術后實驗動物均存活至實驗結束，切口愈合良好，皮膚及皮下均無紅腫、滲出、化膿等炎性反應。實驗組：術后4周即可見新生纖維組織膜均勻包裹幾丁糖電紡膜，交界處無明顯炎性反應，從正中線切開包裹組織，見幾丁糖電紡膜周圍無粘連，容易取出；幾丁糖電紡膜下方形成一層新生纖維膜，嚴密封閉腦組織，無腦脊液漏，切除新生纖維膜可見膜下腦組織，且二者無粘連；隨時間延長幾丁糖電紡膜逐漸被吸收縮小，至16周時完全降解吸收，新生纖維膜完全重建缺損區硬膜。對照組：骨窗周圍組織為厚薄不均的增生瘢痕。見圖 2。
2.2 組織學觀察
HE及Masson染色顯示，術后3周，實驗組炎性細胞浸潤較少，大量毛細血管及肉芽組織增生，大量膠原纖維增生，排列整齊；對照組大量炎性細胞浸潤，肉芽組織及毛細血管增生較少，膠原纖維排列紊亂。6周，實驗組炎性細胞浸潤較3周時明顯減少，毛細血管數量亦減少，膠原纖維大量增生，排列整齊，幾丁糖電紡膜與周圍膠原纖維有較清晰界限，無明顯粘連；對照組仍見較多炎性細胞浸潤，肉芽組織大量增生，膠原纖維較少，且排列無明顯規律。見圖 3、4。
圖4
術后各時間點兩組Masson染色觀察（×100） ? 實驗組術后3周 ? 對照組術后3周 ? 實驗組術后6周 ? 對照組術后6周 ? ?術后3周實驗組及對照組炎性細胞計數分別為（3 774.7 ± 146.5）、（4 003.8 ± 81.1）個/視野，比較差異有統計學意義（t= -3.618，P=0.022）；6周分別為（1 287.2 ± 88.6）、（1 543.0 ± 105.2）個/視野，比較差異有統計學意義（t= -3.343，P=0.029）。
2.3 免疫組織化學染色觀察
術后3、6周，兩組均可見EGFR及bFGF表達，且實驗組均為高表達，對照組均為低表達。見圖 5。
3 討論
硬膜缺損可采用硬膜修補材料進行修復，以預防腦脊液漏。理想的硬膜修補材料[9-11]必須具備：① 物理性能與人硬膜相似，具有一定彈性、韌性，并能縫合，能有效恢復硬膜下腔完整性。② 具有良好的生物相容性。③ 作為支架利于成纖維細胞生長和移動，從而促進硬膜再生；新硬膜形成后，材料被逐漸吸收。④ 不增加術后感染和顱內血腫發生幾率。⑤ 對周圍神經組織無損害，無疾病傳播風險。⑥ 易于消毒儲存，經濟易得，使用簡便。
幾丁糖原料豐富，來自蝦殼、蟹殼等，具有價格低廉、容易取得的特點。本課題組以單一幾丁糖為原料，通過靜電紡絲技術，制備了幾丁糖電紡膜。修補新西蘭家兔硬膜后，大體觀察發現幾丁糖電紡膜與周圍組織及腦組織無粘連，無明顯炎性反應，其下方有新生纖維膜，16周時幾丁糖電紡膜膜完全降解吸收。既往研究表明，幾丁糖具有抗炎作用[12]，本研究組織學觀察示，術后3、6周實驗組炎性細胞浸潤程度均低于對照組，且炎性細胞計數顯著低于對照組，進一步表明幾丁糖電紡膜具有一定抗炎作用。Masson染色示，實驗組膠原纖維分布均勻，界限清晰，而對照組膠原纖維紊亂無序，表明幾丁糖電紡膜可促進周圍損傷組織膠原化。免疫組織化學染色提示，術后3、6周實驗組bFGF表達均較對照組高，提示實驗組成纖維細胞生長活躍，促進周圍損傷組織較早修復，從而減少了瘢痕粘連的形成。這與文獻報道幾丁糖能促進bFGF表達，促進成纖維細胞早期成熟，縮短組織愈合時間，減少瘢痕組織過度增生結果一致[13-14]；實驗組EGFR表達也高于對照組，說明實驗組毛細血管增生活躍，提示幾丁糖電紡膜能促進血管內皮細胞生長[5]，促進損傷組織愈合。
研究表明[15]，幾丁糖具有一定超微結構，將其制備成膜狀植于可能發生粘連的損傷組織間隙，能起到阻隔作用，有效間隔新生組織，防止纖維細胞相互滲透生長。幾丁糖膜一般在數月內可被機體降解吸收，此時創傷組織已完全愈合。本研究大體觀察也發現，術后幾丁糖電紡膜下方新生了一層纖維膜，完整封堵了腦脊液，保護了腦組織；16周時幾丁糖電紡膜被完全吸收，新生纖維膜完全替代硬膜，完整封閉骨窗，硬膜重建完成。所以，下一步我們將建立模型，通過組織學、電鏡等觀察該新生纖維膜微觀結構，深入研究比較其與正常硬膜的差異。
綜上述，幾丁糖電紡膜基本達到了理想硬膜修補材料的標準，但將其應用于臨床還需明確生物相容性、體內代謝方式以及對周圍神經組織（腦組織）是否有損害等。
在神經外科修復缺損的硬膜對于維持解剖結構完整性和保護腦組織具有重要意義。目前，臨床使用的硬膜修復材料均未達到理想標準，如生物膠原空間網狀結構不明顯[1]，不利于成纖維細胞支撐與附著；絲素蛋白膜在制作工藝上有不少缺陷[2]；羊膜取材方法難以控制；高分子聚合材料有一定生物學毒性。且以上材料基本為復合材料[3]，生產工藝復雜，成本高。為了降低成本，我們期望尋找單一材料的修復材料。幾丁糖具備良好組織相容性[4]，可被機體降解吸收[5]。目前，本課題組已成功制備了幾丁糖膜，但仍與理想硬膜修復材料有較大差距，主要問題包括與組織貼服不佳，脆性較大，術中難以固定，縫合強度不足等[6-7]。為此，我們改變制備方法，采用電紡技術制備幾丁糖電紡膜，體外生物力學試驗表明其具有強度大、厚度薄、柔韌性好等優點，動物實驗表明其預防腦脊液漏即刻效果確切[8]。本研究旨在觀察幾丁糖電紡膜預防腦脊液漏的遠期效果，為其在臨床推廣應用奠定實驗基礎。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
健康成年新西蘭家兔25只，雌雄不限，體重2.3～ 3.1 kg，由第二軍醫大學動物實驗中心提供。幾丁糖電紡膜（本課題組研制），纖維絲直徑約300 nm，厚度約0.13 mm，制成1 cm × 1 cm大小。兔抗EGF受體（EGF receptor，EGFR）、抗bFGF、辣根過氧化物酶（上海楷洋生物工程有限公司）。BX41顯微鏡（Olympus公司，日本）；Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件（Media Cybernetics公司，美國）。
1.2 動物模型制備及分組
取新西蘭家兔25只，耳緣靜脈注射3%戊巴比妥鈉（30 mg/kg）麻醉。取頭部正中切口，縱形切開頭皮，逐層分離至顱骨骨膜，微型磨鉆在雙側顱骨頂部制備直徑約1.2 cm的對稱圓形骨窗，于手術顯微鏡下制備0.8 cm × 0.8 cm大小硬膜缺損。右側硬膜缺損區采用幾丁糖電紡膜修復（實驗組），四角用5-0縫線間斷縫合固定；左側缺損不修復，作為對照組。見圖 1。術后實驗動物單籠飼養。
圖1
動物模型制備示意圖 ? 雙側開對稱骨窗，剪去硬膜組織 ? 幾丁糖電紡膜植入右側硬膜缺損區 ? ?1.3 觀測指標
1.3.1 大體觀察
術后2～16周，每周處死1只動物，觀察切口愈合情況，并按原切口入路，觀察骨窗周圍局部炎性反應和幾丁糖電紡膜吸收情況。
1.3.2 組織學觀察
術后3、6 周各隨機處死5只動物，切取骨窗、幾丁糖電紡膜周圍1 cm × 1 cm皮膚標本，10%中性甲醛固定，切片，片厚 5 μm。取部分切片常規行HE及Masson染色，觀察骨窗及幾丁糖電紡膜周圍組織病理學改變以及膠原化情況。各時間點兩組每個標本取1張HE染色切片，于100倍鏡下各取5個視野，采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件行炎性細胞計數，取均值。
1.3.3 免疫組織化學染色觀察
取部分切片常規脫蠟至水，依次滴加一抗及二抗，充分沖洗、復染、脫水、透明，封片。光鏡下觀察骨窗及幾丁糖電紡膜周圍組織bFGF和EGFR表達情況。
1.4 統計學方法
采用SPSS16.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用配對t檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 大體觀察
術后實驗動物均存活至實驗結束，切口愈合良好，皮膚及皮下均無紅腫、滲出、化膿等炎性反應。實驗組：術后4周即可見新生纖維組織膜均勻包裹幾丁糖電紡膜，交界處無明顯炎性反應，從正中線切開包裹組織，見幾丁糖電紡膜周圍無粘連，容易取出；幾丁糖電紡膜下方形成一層新生纖維膜，嚴密封閉腦組織，無腦脊液漏，切除新生纖維膜可見膜下腦組織，且二者無粘連；隨時間延長幾丁糖電紡膜逐漸被吸收縮小，至16周時完全降解吸收，新生纖維膜完全重建缺損區硬膜。對照組：骨窗周圍組織為厚薄不均的增生瘢痕。見圖 2。
2.2 組織學觀察
HE及Masson染色顯示，術后3周，實驗組炎性細胞浸潤較少，大量毛細血管及肉芽組織增生，大量膠原纖維增生，排列整齊；對照組大量炎性細胞浸潤，肉芽組織及毛細血管增生較少，膠原纖維排列紊亂。6周，實驗組炎性細胞浸潤較3周時明顯減少，毛細血管數量亦減少，膠原纖維大量增生，排列整齊，幾丁糖電紡膜與周圍膠原纖維有較清晰界限，無明顯粘連；對照組仍見較多炎性細胞浸潤，肉芽組織大量增生，膠原纖維較少，且排列無明顯規律。見圖 3、4。
圖4
術后各時間點兩組Masson染色觀察（×100） ? 實驗組術后3周 ? 對照組術后3周 ? 實驗組術后6周 ? 對照組術后6周 ? ?術后3周實驗組及對照組炎性細胞計數分別為（3 774.7 ± 146.5）、（4 003.8 ± 81.1）個/視野，比較差異有統計學意義（t= -3.618，P=0.022）；6周分別為（1 287.2 ± 88.6）、（1 543.0 ± 105.2）個/視野，比較差異有統計學意義（t= -3.343，P=0.029）。
2.3 免疫組織化學染色觀察
術后3、6周，兩組均可見EGFR及bFGF表達，且實驗組均為高表達，對照組均為低表達。見圖 5。
3 討論
硬膜缺損可采用硬膜修補材料進行修復，以預防腦脊液漏。理想的硬膜修補材料[9-11]必須具備：① 物理性能與人硬膜相似，具有一定彈性、韌性，并能縫合，能有效恢復硬膜下腔完整性。② 具有良好的生物相容性。③ 作為支架利于成纖維細胞生長和移動，從而促進硬膜再生；新硬膜形成后，材料被逐漸吸收。④ 不增加術后感染和顱內血腫發生幾率。⑤ 對周圍神經組織無損害，無疾病傳播風險。⑥ 易于消毒儲存，經濟易得，使用簡便。
幾丁糖原料豐富，來自蝦殼、蟹殼等，具有價格低廉、容易取得的特點。本課題組以單一幾丁糖為原料，通過靜電紡絲技術，制備了幾丁糖電紡膜。修補新西蘭家兔硬膜后，大體觀察發現幾丁糖電紡膜與周圍組織及腦組織無粘連，無明顯炎性反應，其下方有新生纖維膜，16周時幾丁糖電紡膜膜完全降解吸收。既往研究表明，幾丁糖具有抗炎作用[12]，本研究組織學觀察示，術后3、6周實驗組炎性細胞浸潤程度均低于對照組，且炎性細胞計數顯著低于對照組，進一步表明幾丁糖電紡膜具有一定抗炎作用。Masson染色示，實驗組膠原纖維分布均勻，界限清晰，而對照組膠原纖維紊亂無序，表明幾丁糖電紡膜可促進周圍損傷組織膠原化。免疫組織化學染色提示，術后3、6周實驗組bFGF表達均較對照組高，提示實驗組成纖維細胞生長活躍，促進周圍損傷組織較早修復，從而減少了瘢痕粘連的形成。這與文獻報道幾丁糖能促進bFGF表達，促進成纖維細胞早期成熟，縮短組織愈合時間，減少瘢痕組織過度增生結果一致[13-14]；實驗組EGFR表達也高于對照組，說明實驗組毛細血管增生活躍，提示幾丁糖電紡膜能促進血管內皮細胞生長[5]，促進損傷組織愈合。
研究表明[15]，幾丁糖具有一定超微結構，將其制備成膜狀植于可能發生粘連的損傷組織間隙，能起到阻隔作用，有效間隔新生組織，防止纖維細胞相互滲透生長。幾丁糖膜一般在數月內可被機體降解吸收，此時創傷組織已完全愈合。本研究大體觀察也發現，術后幾丁糖電紡膜下方新生了一層纖維膜，完整封堵了腦脊液，保護了腦組織；16周時幾丁糖電紡膜被完全吸收，新生纖維膜完全替代硬膜，完整封閉骨窗，硬膜重建完成。所以，下一步我們將建立模型，通過組織學、電鏡等觀察該新生纖維膜微觀結構，深入研究比較其與正常硬膜的差異。
綜上述，幾丁糖電紡膜基本達到了理想硬膜修補材料的標準，但將其應用于臨床還需明確生物相容性、體內代謝方式以及對周圍神經組織（腦組織）是否有損害等。
