引用本文： 蔡喜雨, 張鑫鑫, 姜曉銳, 江汕, 裴國獻. 雪旺細胞對BMSCs來源內皮細胞分泌一氧化氮的作用研究. 中國修復重建外科雜志, 2014, 28(8): 998-1003. doi: 10.7507/1002-1892.20140220 復制
組織工程骨在成骨過程中受多種因素影響，其中支架材料中新生血管及時生成尤為重要。長入支架材料的血管可為種子細胞提供營養和氧，并轉運細胞代謝產物，以確保種子細胞在支架材料中存活和進一步增殖[1-2]。然而新生骨成熟時還需有神經作用，神經可參與骨代謝、分泌和造血過程[3-5]。在臨床實踐中我們發現，中樞神經損傷患者其遠端成骨效率強于無中樞神經損傷患者，提示神經也是影響組織工程骨成骨的重要因素。同時神經與血管也相互作用。神經纖維是由雪旺細胞（Schwann cells，SCs）構成的髓鞘包繞神經細胞軸突構成，SCs可分泌多種神經營養因子，其中腦源性神經營養因子（brain derived neurophic factor，BDNF）在體外可促進人臍靜脈內皮細胞遷移和管狀結構形成，其促血管新生作用與VEGF相當[6]。同時血管內皮細胞分泌的VEGF具有神經營養作用，并能刺激軸突生長、增強細胞存活及外周神經系統中SCs增殖。內皮細胞是構成血管內膜的重要細胞，內皮細胞所分泌的一氧化氮（nitric oxide，NO）能夠調節血管張力、保護內皮細胞免受損傷、抑制血小板聚集、調節炎性細胞黏附，是舒張與收縮血管的重要物質[7]。本研究旨在觀察生理性成骨過程中SCs對BMSCs來源內皮細胞分泌NO的作用，為進一步探究組織工程骨成骨過程中神經因素如何通過血管因素起作用奠定實驗基礎。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
1日齡SD乳鼠3只，2周齡SD大鼠2只，雌雄不限，均由南方醫科大學實驗動物中心提供。
SD大鼠BMSCs培養液（Cyagen公司，美國）；阿糖胞苷、Ⅰ型膠原酶、明膠、青霉素鈉、鏈霉素（Sigma公司，美國）；Forskolin（Biovision公司，美國）；EGM-2培養基（Lonza公司，美國）；DMEM基礎培養基（HyClone公司，美國）；胰蛋白酶、FBS （GIBCO公司，美國）；兔抗血管性血友病因子（von Willebrand factor，vWF）多克隆抗體、小鼠CD31單克隆抗體、小鼠源S-100單克隆抗體（Abcam公司，美國）；兔抗CD34單克隆抗體（天津三箭生物技術有限公司）；辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠二抗、DyLight 594標記山羊抗兔IgG、DyLight 488標記小鼠抗兔IgG（北京中杉金橋生物技術有限公司）；抗體稀釋液（武漢博士德生物工程有限公司）；NO檢測試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；Trizol抽提液（Invitrogen公司，美國）。Transwell共培養板（BD公司，美國）；iQ5實時熒光定量PCR儀（Bio-Rad公司，美國）；NO-1000全波長紫外 /可見光掃描分光光度計（Nano Drop公司，美國）；倒置相差顯微鏡（Nikon公司，日本）。
1.2 SCs分離培養及鑒定
1.2.1 SCs分離培養
取1日齡SD乳鼠3只，75%乙醇浸泡5 min。剪開大腿后外側以及前肢胸前至前臂皮膚，深層分離組織，獲取坐骨神經與臂叢神經，置于預冷PBS中；體視顯微鏡下剝離神經外膜，眼科剪剪成1 mm × 1 mm × 1 mm 組織塊，PBS漂洗2～3次，以離心半徑12 cm、1 000 r/min離心30 s，棄上清。加入0.25%胰蛋白酶1 mL，37℃消化7 min，加入含10%FBS的DMEM基礎培養基終止消化，以離心半徑12 cm、1 000 r/ min離心1 min，棄上清；取出沉淀的組織塊貼壁于多聚賴氨酸包被過夜的6孔培養板中，待風干1 min后沿壁滴加SCs培養液（含10%FBS、2 μmol/L Forskolin以及1 × 10-5 mol/L阿糖胞苷的DMEM基礎培養基），置于37℃、5%CO2及飽和濕度培養箱中培養。待細胞融合達70%～80%時進行傳代培養。倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態變化。
1.2.2 SCs鑒定
取第2代SCs制成細胞爬片，4%多聚甲醛固定30 min；PBS漂洗后加入3%H2O2，室溫放置20 min；PBS漂洗后加入正常山羊封閉血清，37℃封閉30 min；加入1∶200稀釋的小鼠源S-100單克隆抗體，4℃過夜。次日取出，PBS漂洗后加入辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠二抗，37℃放置30 min；PBS漂洗后加入AEC顯色液，37℃放置10 min；PBS漂洗后加入蘇木素復染1 min，封片，倒置相差熒光顯微鏡下觀察。
1.3 BMSCs分離培養及向內皮細胞誘導分化
1.3.1 BMSCs分離培養
取2周齡SD大鼠2只，頸椎脫臼處死，以75%乙醇浸泡5 min。剪開雙后肢皮膚及肌肉，顯露并完整剪下股骨頭至脛腓骨下端間骨質，剔除外周軟組織，剪去股骨與脛骨兩端；2 mL注射器針頭插入骨髓腔，PBS沖洗2～3次，收集沖洗液，以離心半徑12 cm、1 000 r/min離心10 min；棄上清，加入SD大鼠BMSCs培養液3 mL，吹打均勻，接種于25 cm2培養瓶，置于37℃、5%CO2及飽和濕度培養箱中培養。24 h后PBS漂洗并更換培養液，此后2～3 d換液1次。待細胞融合達70%～80%時進行傳代培養。倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態變化。
1.3.2 BMSCs向內皮細胞誘導分化及鑒定
第3代BMSCs融合達70%時，PBS漂洗2～3次，以EGM-2培養基培養，2～3 d換液1次，誘導分化28 d。倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態變化。取誘導分化28 d的BMSCs，重懸后制成細胞爬片，分別進行以下鑒定：① vWF免疫熒光染色鑒定：次日取出爬片，PBS漂洗2～3次，4%多聚甲醛固定30 min；加入0.5%Triton X-100穿孔，漂洗后加入正常山羊封閉血清，37℃封閉30 min；加入1∶400稀釋的兔抗vWF多克隆抗體，放入濕盒，4℃過夜；次日PBS漂洗后加入1∶200稀釋的DyLight 594標記山羊抗兔IgG，37℃放置1 h，PBS漂洗后封片，倒置相差熒光顯微鏡下觀察。② CD31免疫熒光染色鑒定：次日取出爬片，PBS漂洗2～3次，4%多聚甲醛固定30 min；加入0.5%Triton X-100穿孔，漂洗后加入正常山羊封閉血清，37℃封閉30 min；加入1∶100稀釋的小鼠CD31單克隆抗體，放入濕盒，4℃過夜；次日PBS漂洗，加入1∶200稀釋的DyLight 488標記小鼠抗兔IgG，37℃放置1 h，PBS漂洗后封片，倒置相差熒光顯微鏡下觀察。
1.4 非接觸共培養下SCs對BMSCs來源內皮細胞釋放NO的影響
取第2代純化后的SCs和誘導培養28 d的BMSCs，分別以0.25%胰蛋白酶消化后以EGM-2培養基重懸，調整細胞密度至1 ×105個/mL。取孔徑為0.4 μm的Transwell共培養板，實驗分為2組，實驗組上室接種100 μL SCs細胞懸液，添加EGM-2培養基至1.6 mL，下室接種100 μL BMSCs來源內皮細胞細胞懸液，添加EGM-2培養基至2.4 mL；對照組僅于下室接種100 μL BMSCs來源內皮細胞細胞懸液，添加EGM-2培養基至4 mL。每組設3個復孔，置于37℃、5%CO2及飽和濕度培養箱中培養。分別于培養后1、3、5、7 d收集培養液，根據NO檢測試劑盒說明書繪制的內皮細胞誘導培養液NO濃度-吸光度（A）值標準曲線，計算NO濃度。
1.5 非接觸共培養下SCs對BMSCs來源內皮細胞一氧化氮合酶2（nitric oxide synthetase 2，NOS2）與NOS3表達的影響
同1.4方法將SCs與BMSCs來源內皮細胞共培養（培養液更換為含5%FBS的EGM-2培養基），每組設3個復孔。培養1、3、7、10 d，采用實時熒光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）檢測下層BMSCs來源內皮細胞的NOS2與NOS3 mRNA表達。抽提樣品總RNA，其中細胞總RNA在液氮冷凍狀態下研磨后加入Trizol并純化獲得。引物序列：NOS2上游5'-CTCACTGTGGCTGTGGTCACCTA-3'，下游3'-A-TTGGACTTCGGGCTTCTGGG-5'；NOS3上游5'-GC-GGCTGGTACATGAGTTCAGA-3'，下游3'-ACACCG-ACAGACGTACCTAGA-5'；內參GAPDH上游5'-GG-ACCAGGTTGTCTCCTGTG-3'，下游3'-TGTAGGCCA-TGAGGTCCAC-5'。采用標準三步法進行反應：預變性95℃、10 min，1個循環；變性95℃、10 s，退火60℃、20 s，延伸72℃、15 s，40個循環；延伸結束后進行檢測，溫度間隔為0.5℃，溫度梯度為72～95℃與30℃，時間分別為每次6 s與30 s，進行熔解曲線分析檢測。采用2-ΔΔCt 法分析兩組NOS2與NOS3 mRNA相對表達量。
1.6 統計學方法
采用SPSS16.0統計軟件進行分析。數據以均數 ± 標準差表示，組內各時間點間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗；組間比較采用獨立樣本t檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 SCs形態學觀察與鑒定
倒置相差顯微鏡觀察示，原代及第1代SCs呈雙極或單極，胞體極窄，伸出長絲狀突觸，形似麥芒；原代培養的SCs中成纖維細胞較多，細胞不易觀察（圖 1）。純化后的第2代SCs均勻分布時細胞突觸交叉呈網格狀生長。S-100免疫組織化學染色示，細胞質呈褐色，為陽性反應（圖 2）。
圖1
SCs形態學觀察（倒置相差顯微鏡×100） ? 原代培養3 d ? 第1代培養3 d ? ?2.2 BMSCs形態學觀察及向內皮細胞誘導分化鑒定
倒置相差顯微鏡觀察示，原代及第3代BMSCs均呈梭形、三角形或多角形，邊界清晰；第3代細胞平行排列，排列緊密處可呈草束狀（圖 3）。誘導培養28 d，細胞形態更為圓鈍，細胞核增大，融合成“鋪路石”樣（圖 4 a）。vWF免疫熒光染色鑒定示，大部分細胞細胞質呈強紅色熒光（圖 4 b）；CD31免疫熒光染色鑒定示，大部分細胞細胞膜呈綠色熒光（圖 4 c）。
2.3 非接觸共培養下SCs對BMSCs來源內皮細胞釋放NO的影響
實驗組釋放NO濃度在3 d達最低點，此后呈上升趨勢；對照組第3天高于1 d，在5 d達最低點，7 d時略有升高。兩組內各時間點間釋放NO濃度比較，差異均有統計學意義（P＜ 0.05）。1、5、7 d時實驗組釋放NO濃度均顯著高于對照組，差異有統計學意義（P＜ 0.05）；3 d時兩組比較，差異無統計學意義（t=1.049，P=0.364）。見圖 5。
圖5
兩組培養各時間點BMSCs來源內皮細胞釋放NO濃度比較
Figure5.
NO concentration of medium for BMSCs derived endothelial cells in 2 groups at different time points
2.4 非接觸共培養下SCs對BMSCs來源內皮細胞NOS2與NOS3 mRNA表達的影響
RT-qPCR檢測結果顯示，培養各時間點實驗組NOS2 mRNA相對表達量均顯著高于對照組，差異有統計學意義（P＜ 0.05）；兩組內各時間點間比較，差異均有統計學意義（P＜ 0.05）。除第10天外，實驗組NOS3 mRNA相對表達量均顯著高于對照組，差異均有統計學意義（P＜ 0.05）；實驗組內各時間點間NOS3 mRNA相對表達量比較差異無統計學意義（F=6.673，P=0.062），對照組內各時間點間比較差異有統計學意義（F=36.581，P=0.000）。見表 1。
表1
兩組培養后各時間點NOS2和NOS3 mRNA相對表達量比較（n=3，3 討論
成熟的具有生理功能的組織工程骨需同時具備血管網絡與神經纖維。血管網絡是新生骨早期成活的關鍵因素，其對組織工程骨構建的重要作用已有大量研究證實；神經纖維對組織工程骨形成同樣具有重要作用。在骨質中，來自感覺神經與自主神經的神經肽可直接作用于骨細胞，如感覺神經分泌的P物質、降鈣素基因相關肽，副交感神經分泌的血管活性腸肽以及交感神經分泌的神經肽Y等[8-10]。目前研究多集中于血管因素對新骨形成的作用，而神經因素在新骨生成中的作用研究較少，血管及神經因素相互作用的研究更少。
一些學者采用糖尿病神經損傷、腦卒中疾病模型，進行神經、血管相互作用研究。SCs與神經細胞可分泌多種神經營養因子，如神經營養因子、BDNF、睫狀神經營養因子、白血病抑制因子、VEGF、FGF等，對血管內皮細胞均有特定而廣泛的作用。如神經營養因子是交感神經元中提供神經營養和促進神經生長的主要因子，也可作為一種促血管因子在諸多疾病中起作用；另外，BDNF對血管新生也具有促進作用[11-13]。因此我們認為在新骨形成過程中，神經可能通過促血管生成對成骨起間接作用。
BMSCs在體外向內皮細胞方向誘導分化的機制及誘導方法并不成熟，但多采用含有VEGF的培養基。本研究采用EGM-2培養基，其中含有EGF、VEGF、bFGF、IGF、氫化可的松、抗壞血酸以及肝素鈉。本研究通過S-100免疫組織化學染色鑒定表明，BMSCs誘導分化的細胞為具有正常功能的內皮細胞，可用于后期的功能測定實驗。
NO由NOS合成，在體內以自由基形式存在。NOS具有3種不同形式，神經型（neuronal NOS，nNOS）、內皮型（endothelial NOS，eNOS）和誘導型（inducible NOS，iNOS）[14-15]。與血管功能及再生關系最密切的是iNOS與eNOS。其中，iNOS可轉運內皮細胞產生的NO，促進內皮細胞增殖，加速血管修復；eNOS可維持內皮組織與周圍組織微環境穩態，是微循環中保證組織局部正常血液灌流的重要調節因子[16]。此外，NO與VEGF的關系極為密切。VEGF對eNOS與iNOS介導的血管新生具有誘導作用[6]；同時eNOS與iNOS為VEGF提供細胞信號轉導的靶點，尤其在缺氧、脂質過氧化、血管受損等病理生理過程中為VEGF修復局部內皮組織、改善血管通透性提供必要的微環境[17-19]。此外，由于NO極不穩定，本研究中只能通過檢測NO2-的濃度間接測定NO濃度，并檢測合成NO的NOS相關基因NOS2與NOS3表達，進一步闡釋血管內皮細胞在SCs作用下分泌NO的情況。本研究通過非接觸共培養體系檢測發現，SCs對BMSCs來源內皮細胞的NOS2與NOS3 mRNA表達均有促進作用，且隨時間延長該作用有累積效應。提示SCs能夠上調BMSCs來源內皮細胞的NOS相關基因表達，活化NOS，從而促進NO生成、轉運及在局部聚集，促進血管再生，進而間接促進組織工程骨形成。
綜上述，本實驗結果提示SCs可促進BMSCs來源內皮細胞分泌NO，為后期研究組織工程骨形成過程中神經因素對血管因素的作用奠定了實驗基礎。但內皮細胞具有多種分泌功能，其產生的多種細胞因子及其他大分子對血管化及成骨均具有促進作用，而本研究僅針對其分泌NO的功能進行研究，有一定局限性。為了更好闡釋神經因素對血管化及間接對組織工程骨成骨的作用，尚需進行更為全面的研究。
組織工程骨在成骨過程中受多種因素影響，其中支架材料中新生血管及時生成尤為重要。長入支架材料的血管可為種子細胞提供營養和氧，并轉運細胞代謝產物，以確保種子細胞在支架材料中存活和進一步增殖[1-2]。然而新生骨成熟時還需有神經作用，神經可參與骨代謝、分泌和造血過程[3-5]。在臨床實踐中我們發現，中樞神經損傷患者其遠端成骨效率強于無中樞神經損傷患者，提示神經也是影響組織工程骨成骨的重要因素。同時神經與血管也相互作用。神經纖維是由雪旺細胞（Schwann cells，SCs）構成的髓鞘包繞神經細胞軸突構成，SCs可分泌多種神經營養因子，其中腦源性神經營養因子（brain derived neurophic factor，BDNF）在體外可促進人臍靜脈內皮細胞遷移和管狀結構形成，其促血管新生作用與VEGF相當[6]。同時血管內皮細胞分泌的VEGF具有神經營養作用，并能刺激軸突生長、增強細胞存活及外周神經系統中SCs增殖。內皮細胞是構成血管內膜的重要細胞，內皮細胞所分泌的一氧化氮（nitric oxide，NO）能夠調節血管張力、保護內皮細胞免受損傷、抑制血小板聚集、調節炎性細胞黏附，是舒張與收縮血管的重要物質[7]。本研究旨在觀察生理性成骨過程中SCs對BMSCs來源內皮細胞分泌NO的作用，為進一步探究組織工程骨成骨過程中神經因素如何通過血管因素起作用奠定實驗基礎。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
1日齡SD乳鼠3只，2周齡SD大鼠2只，雌雄不限，均由南方醫科大學實驗動物中心提供。
SD大鼠BMSCs培養液（Cyagen公司，美國）；阿糖胞苷、Ⅰ型膠原酶、明膠、青霉素鈉、鏈霉素（Sigma公司，美國）；Forskolin（Biovision公司，美國）；EGM-2培養基（Lonza公司，美國）；DMEM基礎培養基（HyClone公司，美國）；胰蛋白酶、FBS （GIBCO公司，美國）；兔抗血管性血友病因子（von Willebrand factor，vWF）多克隆抗體、小鼠CD31單克隆抗體、小鼠源S-100單克隆抗體（Abcam公司，美國）；兔抗CD34單克隆抗體（天津三箭生物技術有限公司）；辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠二抗、DyLight 594標記山羊抗兔IgG、DyLight 488標記小鼠抗兔IgG（北京中杉金橋生物技術有限公司）；抗體稀釋液（武漢博士德生物工程有限公司）；NO檢測試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；Trizol抽提液（Invitrogen公司，美國）。Transwell共培養板（BD公司，美國）；iQ5實時熒光定量PCR儀（Bio-Rad公司，美國）；NO-1000全波長紫外 /可見光掃描分光光度計（Nano Drop公司，美國）；倒置相差顯微鏡（Nikon公司，日本）。
1.2 SCs分離培養及鑒定
1.2.1 SCs分離培養
取1日齡SD乳鼠3只，75%乙醇浸泡5 min。剪開大腿后外側以及前肢胸前至前臂皮膚，深層分離組織，獲取坐骨神經與臂叢神經，置于預冷PBS中；體視顯微鏡下剝離神經外膜，眼科剪剪成1 mm × 1 mm × 1 mm 組織塊，PBS漂洗2～3次，以離心半徑12 cm、1 000 r/min離心30 s，棄上清。加入0.25%胰蛋白酶1 mL，37℃消化7 min，加入含10%FBS的DMEM基礎培養基終止消化，以離心半徑12 cm、1 000 r/ min離心1 min，棄上清；取出沉淀的組織塊貼壁于多聚賴氨酸包被過夜的6孔培養板中，待風干1 min后沿壁滴加SCs培養液（含10%FBS、2 μmol/L Forskolin以及1 × 10-5 mol/L阿糖胞苷的DMEM基礎培養基），置于37℃、5%CO2及飽和濕度培養箱中培養。待細胞融合達70%～80%時進行傳代培養。倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態變化。
1.2.2 SCs鑒定
取第2代SCs制成細胞爬片，4%多聚甲醛固定30 min；PBS漂洗后加入3%H2O2，室溫放置20 min；PBS漂洗后加入正常山羊封閉血清，37℃封閉30 min；加入1∶200稀釋的小鼠源S-100單克隆抗體，4℃過夜。次日取出，PBS漂洗后加入辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠二抗，37℃放置30 min；PBS漂洗后加入AEC顯色液，37℃放置10 min；PBS漂洗后加入蘇木素復染1 min，封片，倒置相差熒光顯微鏡下觀察。
1.3 BMSCs分離培養及向內皮細胞誘導分化
1.3.1 BMSCs分離培養
取2周齡SD大鼠2只，頸椎脫臼處死，以75%乙醇浸泡5 min。剪開雙后肢皮膚及肌肉，顯露并完整剪下股骨頭至脛腓骨下端間骨質，剔除外周軟組織，剪去股骨與脛骨兩端；2 mL注射器針頭插入骨髓腔，PBS沖洗2～3次，收集沖洗液，以離心半徑12 cm、1 000 r/min離心10 min；棄上清，加入SD大鼠BMSCs培養液3 mL，吹打均勻，接種于25 cm2培養瓶，置于37℃、5%CO2及飽和濕度培養箱中培養。24 h后PBS漂洗并更換培養液，此后2～3 d換液1次。待細胞融合達70%～80%時進行傳代培養。倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態變化。
1.3.2 BMSCs向內皮細胞誘導分化及鑒定
第3代BMSCs融合達70%時，PBS漂洗2～3次，以EGM-2培養基培養，2～3 d換液1次，誘導分化28 d。倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態變化。取誘導分化28 d的BMSCs，重懸后制成細胞爬片，分別進行以下鑒定：① vWF免疫熒光染色鑒定：次日取出爬片，PBS漂洗2～3次，4%多聚甲醛固定30 min；加入0.5%Triton X-100穿孔，漂洗后加入正常山羊封閉血清，37℃封閉30 min；加入1∶400稀釋的兔抗vWF多克隆抗體，放入濕盒，4℃過夜；次日PBS漂洗后加入1∶200稀釋的DyLight 594標記山羊抗兔IgG，37℃放置1 h，PBS漂洗后封片，倒置相差熒光顯微鏡下觀察。② CD31免疫熒光染色鑒定：次日取出爬片，PBS漂洗2～3次，4%多聚甲醛固定30 min；加入0.5%Triton X-100穿孔，漂洗后加入正常山羊封閉血清，37℃封閉30 min；加入1∶100稀釋的小鼠CD31單克隆抗體，放入濕盒，4℃過夜；次日PBS漂洗，加入1∶200稀釋的DyLight 488標記小鼠抗兔IgG，37℃放置1 h，PBS漂洗后封片，倒置相差熒光顯微鏡下觀察。
1.4 非接觸共培養下SCs對BMSCs來源內皮細胞釋放NO的影響
取第2代純化后的SCs和誘導培養28 d的BMSCs，分別以0.25%胰蛋白酶消化后以EGM-2培養基重懸，調整細胞密度至1 ×105個/mL。取孔徑為0.4 μm的Transwell共培養板，實驗分為2組，實驗組上室接種100 μL SCs細胞懸液，添加EGM-2培養基至1.6 mL，下室接種100 μL BMSCs來源內皮細胞細胞懸液，添加EGM-2培養基至2.4 mL；對照組僅于下室接種100 μL BMSCs來源內皮細胞細胞懸液，添加EGM-2培養基至4 mL。每組設3個復孔，置于37℃、5%CO2及飽和濕度培養箱中培養。分別于培養后1、3、5、7 d收集培養液，根據NO檢測試劑盒說明書繪制的內皮細胞誘導培養液NO濃度-吸光度（A）值標準曲線，計算NO濃度。
1.5 非接觸共培養下SCs對BMSCs來源內皮細胞一氧化氮合酶2（nitric oxide synthetase 2，NOS2）與NOS3表達的影響
同1.4方法將SCs與BMSCs來源內皮細胞共培養（培養液更換為含5%FBS的EGM-2培養基），每組設3個復孔。培養1、3、7、10 d，采用實時熒光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）檢測下層BMSCs來源內皮細胞的NOS2與NOS3 mRNA表達。抽提樣品總RNA，其中細胞總RNA在液氮冷凍狀態下研磨后加入Trizol并純化獲得。引物序列：NOS2上游5'-CTCACTGTGGCTGTGGTCACCTA-3'，下游3'-A-TTGGACTTCGGGCTTCTGGG-5'；NOS3上游5'-GC-GGCTGGTACATGAGTTCAGA-3'，下游3'-ACACCG-ACAGACGTACCTAGA-5'；內參GAPDH上游5'-GG-ACCAGGTTGTCTCCTGTG-3'，下游3'-TGTAGGCCA-TGAGGTCCAC-5'。采用標準三步法進行反應：預變性95℃、10 min，1個循環；變性95℃、10 s，退火60℃、20 s，延伸72℃、15 s，40個循環；延伸結束后進行檢測，溫度間隔為0.5℃，溫度梯度為72～95℃與30℃，時間分別為每次6 s與30 s，進行熔解曲線分析檢測。采用2-ΔΔCt 法分析兩組NOS2與NOS3 mRNA相對表達量。
1.6 統計學方法
采用SPSS16.0統計軟件進行分析。數據以均數 ± 標準差表示，組內各時間點間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗；組間比較采用獨立樣本t檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 SCs形態學觀察與鑒定
倒置相差顯微鏡觀察示，原代及第1代SCs呈雙極或單極，胞體極窄，伸出長絲狀突觸，形似麥芒；原代培養的SCs中成纖維細胞較多，細胞不易觀察（圖 1）。純化后的第2代SCs均勻分布時細胞突觸交叉呈網格狀生長。S-100免疫組織化學染色示，細胞質呈褐色，為陽性反應（圖 2）。
圖1
SCs形態學觀察（倒置相差顯微鏡×100） ? 原代培養3 d ? 第1代培養3 d ? ?2.2 BMSCs形態學觀察及向內皮細胞誘導分化鑒定
倒置相差顯微鏡觀察示，原代及第3代BMSCs均呈梭形、三角形或多角形，邊界清晰；第3代細胞平行排列，排列緊密處可呈草束狀（圖 3）。誘導培養28 d，細胞形態更為圓鈍，細胞核增大，融合成“鋪路石”樣（圖 4 a）。vWF免疫熒光染色鑒定示，大部分細胞細胞質呈強紅色熒光（圖 4 b）；CD31免疫熒光染色鑒定示，大部分細胞細胞膜呈綠色熒光（圖 4 c）。
2.3 非接觸共培養下SCs對BMSCs來源內皮細胞釋放NO的影響
實驗組釋放NO濃度在3 d達最低點，此后呈上升趨勢；對照組第3天高于1 d，在5 d達最低點，7 d時略有升高。兩組內各時間點間釋放NO濃度比較，差異均有統計學意義（P＜ 0.05）。1、5、7 d時實驗組釋放NO濃度均顯著高于對照組，差異有統計學意義（P＜ 0.05）；3 d時兩組比較，差異無統計學意義（t=1.049，P=0.364）。見圖 5。
圖5
兩組培養各時間點BMSCs來源內皮細胞釋放NO濃度比較
Figure5.
NO concentration of medium for BMSCs derived endothelial cells in 2 groups at different time points
2.4 非接觸共培養下SCs對BMSCs來源內皮細胞NOS2與NOS3 mRNA表達的影響
RT-qPCR檢測結果顯示，培養各時間點實驗組NOS2 mRNA相對表達量均顯著高于對照組，差異有統計學意義（P＜ 0.05）；兩組內各時間點間比較，差異均有統計學意義（P＜ 0.05）。除第10天外，實驗組NOS3 mRNA相對表達量均顯著高于對照組，差異均有統計學意義（P＜ 0.05）；實驗組內各時間點間NOS3 mRNA相對表達量比較差異無統計學意義（F=6.673，P=0.062），對照組內各時間點間比較差異有統計學意義（F=36.581，P=0.000）。見表 1。
表1
兩組培養后各時間點NOS2和NOS3 mRNA相對表達量比較（n=3，3 討論
成熟的具有生理功能的組織工程骨需同時具備血管網絡與神經纖維。血管網絡是新生骨早期成活的關鍵因素，其對組織工程骨構建的重要作用已有大量研究證實；神經纖維對組織工程骨形成同樣具有重要作用。在骨質中，來自感覺神經與自主神經的神經肽可直接作用于骨細胞，如感覺神經分泌的P物質、降鈣素基因相關肽，副交感神經分泌的血管活性腸肽以及交感神經分泌的神經肽Y等[8-10]。目前研究多集中于血管因素對新骨形成的作用，而神經因素在新骨生成中的作用研究較少，血管及神經因素相互作用的研究更少。
一些學者采用糖尿病神經損傷、腦卒中疾病模型，進行神經、血管相互作用研究。SCs與神經細胞可分泌多種神經營養因子，如神經營養因子、BDNF、睫狀神經營養因子、白血病抑制因子、VEGF、FGF等，對血管內皮細胞均有特定而廣泛的作用。如神經營養因子是交感神經元中提供神經營養和促進神經生長的主要因子，也可作為一種促血管因子在諸多疾病中起作用；另外，BDNF對血管新生也具有促進作用[11-13]。因此我們認為在新骨形成過程中，神經可能通過促血管生成對成骨起間接作用。
BMSCs在體外向內皮細胞方向誘導分化的機制及誘導方法并不成熟，但多采用含有VEGF的培養基。本研究采用EGM-2培養基，其中含有EGF、VEGF、bFGF、IGF、氫化可的松、抗壞血酸以及肝素鈉。本研究通過S-100免疫組織化學染色鑒定表明，BMSCs誘導分化的細胞為具有正常功能的內皮細胞，可用于后期的功能測定實驗。
NO由NOS合成，在體內以自由基形式存在。NOS具有3種不同形式，神經型（neuronal NOS，nNOS）、內皮型（endothelial NOS，eNOS）和誘導型（inducible NOS，iNOS）[14-15]。與血管功能及再生關系最密切的是iNOS與eNOS。其中，iNOS可轉運內皮細胞產生的NO，促進內皮細胞增殖，加速血管修復；eNOS可維持內皮組織與周圍組織微環境穩態，是微循環中保證組織局部正常血液灌流的重要調節因子[16]。此外，NO與VEGF的關系極為密切。VEGF對eNOS與iNOS介導的血管新生具有誘導作用[6]；同時eNOS與iNOS為VEGF提供細胞信號轉導的靶點，尤其在缺氧、脂質過氧化、血管受損等病理生理過程中為VEGF修復局部內皮組織、改善血管通透性提供必要的微環境[17-19]。此外，由于NO極不穩定，本研究中只能通過檢測NO2-的濃度間接測定NO濃度，并檢測合成NO的NOS相關基因NOS2與NOS3表達，進一步闡釋血管內皮細胞在SCs作用下分泌NO的情況。本研究通過非接觸共培養體系檢測發現，SCs對BMSCs來源內皮細胞的NOS2與NOS3 mRNA表達均有促進作用，且隨時間延長該作用有累積效應。提示SCs能夠上調BMSCs來源內皮細胞的NOS相關基因表達，活化NOS，從而促進NO生成、轉運及在局部聚集，促進血管再生，進而間接促進組織工程骨形成。
綜上述，本實驗結果提示SCs可促進BMSCs來源內皮細胞分泌NO，為后期研究組織工程骨形成過程中神經因素對血管因素的作用奠定了實驗基礎。但內皮細胞具有多種分泌功能，其產生的多種細胞因子及其他大分子對血管化及成骨均具有促進作用，而本研究僅針對其分泌NO的功能進行研究，有一定局限性。為了更好闡釋神經因素對血管化及間接對組織工程骨成骨的作用，尚需進行更為全面的研究。
