引用本文： 莊淑波, 柴家科, 郁永輝, 尹回男, 劉玲英, 樊軍, 王一賀, 侯玉森. 燒傷對小鼠棕色脂肪組織影響的實驗研究. 中國修復重建外科雜志, 2014, 28(8): 988-992. doi: 10.7507/1002-1892.20140218 復制
燒傷、感染、手術等創傷后，人體存在高代謝以及胰島素抵抗，高代謝會引起機體能量供應不足，臟器功能損害，機體免疫力下降，感染風險增加，創面延遲愈合，嚴重影響患者預后及生活質量[1-2]。創傷后高代謝的發生發展分子機制十分復雜，目前尚未完全闡明。人體脂肪組織分為棕色脂肪（brown adipose tissue，BAT）及白色脂肪（white adipose tissue，WAT）[3-4]，其中BAT在調節機體能量代謝及內分泌中具有重要作用[5-8]。研究表明，BAT通過調節性產熱對人體能量平衡進行調控，可能成為代謝紊亂防治的新靶點[9]。本研究通過觀察燒傷小鼠體溫及體內脂肪組織、肌肉、水等成分變化，明確燒傷后高代謝狀態下BAT及WAT的變化，初步探討燒傷與BAT之間的關系。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
清潔級3～4月齡雄性BALB/c小鼠40只，體重（20 ± 3）g，由中國醫學科學院實驗動物研究所提供（許可證號：SCXK 京2009-0007）。適應性飼養1周以上，室溫維持25～28℃。
Trizol（Invitrogen公司，美國）；逆轉錄試劑盒（Pro-mega公司，美國）；QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix（Toyobo公司，日本）；解偶聯蛋白1（uncoupling protein 1，UCP-1）一抗ab10983（Abcam公司，美國）；免疫組織化學染色試劑盒、DAB （北京尚柏生物醫學技術有限公司）。CO2 恒溫培養箱（Heracell公司，德國）；超凈工作臺（杭州凈化有限公司）；倒置相差顯微鏡（Olympus公司，日本）；L-550臺式低溫離心機（湘儀離心機儀器有限公司）；電子臺秤（惠而邦電子衡器有限公司）；透射電鏡（Jeol公司，日本）；Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件（Media Cybernetics公司，美國）。
1.2 實驗分組及方法
將40 只實驗動物隨機分為實驗組及對照組，每組20只。實驗前12 h禁食，自由飲水。兩組小鼠以腹腔注射戊巴比妥鈉（50 mg/kg）麻醉后，背部去毛。將實驗組小鼠背部置于90℃熱水中9 s，制備30%總體表面積Ⅲ度燙傷模型[10-11]；造模后小鼠立即腹腔注射生理鹽水（40 mL/ kg）抗休克。對照組小鼠背部置于37℃熱水中9 s。實驗動物單籠飼養。
1.3 觀測指標
1.3.1 一般情況
觀察兩組小鼠存活情況。分別于造模前及造模后4周內每周稱重1次，稱重前夜禁食不禁水，第2天清晨使用電子臺稱稱量小鼠空腹體重。于造模前與造模后1、2、3、7 d早、晚各測量1次小鼠直腸溫度，取均值。
1.3.2 大體觀察
造模后7 d，兩組各取12只小鼠，頸椎脫臼處死后分離肩胛間區BAT及附睪WAT，行大體觀察并電子臺秤稱重。
1.3.3 組織學及透射電鏡觀察
大體觀察后，兩組各取其中6只小鼠脂肪組織進行組織學及透射電鏡觀察。① 取部分BAT及WAT，經冰凍切片包埋劑固定，切片，片厚10 μm，HE染色，光鏡下觀察脂肪組織形態。② 取部分BAT及WAT，PBS 液沖洗2次，2%戊二醛固定4周，超薄切片，透射電鏡觀察脂肪細胞超微結構。
1.3.4 實時定量PCR檢測UCP-1基因表達
兩組各取剩余6只小鼠脂肪組織，取部分行實時定量PCR檢測UCP-1基因表達。采用Trizol抽提BAT及WAT總RNA，以隨機引物（oligodT）、 1.25 μL 10 mmol/ L dNTP mix、25 μL RNA酶抑制劑、200 μL M-MLV酶、13.375 μL DEPC水反應體系進行cDNA逆轉錄。以cDNA為模板，進行擴增；引物序列（5'→3'）：UCP-1 上游：AGGGTTTGTGGCTTCTTTTC，下游：TGGTTGG-TTTTATTCGTGGT；內參 β-actin上游：GGCAGGTCT-ACTTTGGAG，下游：ACATTCGAGGCTCCAGTGTT。實時定量PCR總反應體系為20 μL，反應條件：94℃預變性5 min，94℃變性10 s，50℃退火30 s，72℃延伸10 s，22℃延伸5 min，55～95℃40個循環，制備熔解曲線。以與β-actin 的比值作為UCP-1基因相對表達量。
1.3.5 免疫組織化學染色檢測UCP-1蛋白表達
取部分BAT及WAT以10%甲醛固定，采用 ABC 法進行免疫組織化學染色。實驗步驟：石蠟切片，二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化；高壓鍋抗原修復 2 min，PBS 洗滌；3%H2O2去離子水孵育 10 min，PBS 洗滌；滴加正常山羊血清封閉液室溫孵育 20 min，加入1∶500 稀釋的UCP-1一抗，放入濕盒內4℃過夜，PBS 洗滌；依次滴加生物素標記的二抗、生物素過氧化物酶氧化物各15 min；DAB 顯色，蘇木素復染，脫水，透明，封片。鏡下觀察棕黃色顆粒為UCP-1陽性表達。于 200 倍鏡下每張切片隨機取 10 個視野，采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件分析 UCP-1 陽性表達的積分吸光度（IA） 值。
1.4 統計學方法
采用 SPSS17.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用方差分析，兩兩比較采用 LSD 檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 一般情況
兩組小鼠造模后均存活至實驗結束。造模前兩組小鼠空腹體重比較，差異無統計學意義（F=1.770，P=0.069）；造模后1、2、3、4周實驗組小鼠空腹體重顯著低于對照組，比較差異均有統計學意義（P＜ 0.05）。見圖 1。造模前兩組小鼠體溫比較，差異無統計學意義（F=0.000，P=1.000）；造模后1、2、3、7 d實驗組小鼠體溫顯著高于對照組，比較差異均有統計學意義（P＜ 0.05）。見圖 2 。
圖1
造模前后兩組小鼠空腹體重 ? ?2.2 大體觀察
與對照組比較，實驗組WAT體積明顯變小，BAT體積顯著增大、顏色更深（圖 3）。實驗組BAT重量為（0.134 ± 0.015） g，顯著高于對照組的（0.084 ± 0.005） g，差異有統計學意義（F=122.893，P=0.000）；實驗組WAT重量為（0.062 ± 0.013）g，顯著低于對照組的（0.194 ± 0.114）g，比較差異有統計學意義（F=184.300，P=0.000）。
2.3 組織學觀察
造模后7 d，與對照組相比，實驗組單個視野細胞數顯著增多，WAT及BAT細胞均變小，細胞長徑和短徑均顯著降低，其中WAT毛細血管基質增生，BAT細胞間質及毛細血管基質增生。見圖 4。
2.4 透射電鏡觀察
造模后7 d，對照組WAT細胞中脂肪滴占據大部分細胞質，細胞質呈薄層，位于細胞周緣，包繞脂滴；實驗組WAT細胞中脂滴明顯變小，細胞質和線粒體多于對照組。對照組BAT細胞中脂滴占據大部分細胞質，線粒體分散；實驗組BAT脂滴明顯變小，細胞質和線粒體明顯增多并連接緊密。見圖 5。
2.5 實時定量PCR檢測UCP-1基因表達
實驗組BAT中UCP-1基因相對表達量為1.236 ± 0.159，對照組為0.212 ± 0.032，比較差異有統計學意義（F=20.420，P=0.000）。實驗組WAT中UCP-1基因相對表達量為0.032 ± 0.004，對照組為0.080 ± 0.044，比較差異有統計學意義（F=256.366，P=0.000）。
2.6 免疫組織化學染色觀測UCP-1蛋白表達
鏡下觀察見實驗組BAT、WAT內棕黃色顆粒均多于對照組，見圖 6。實驗組BAT、WAT中UCP-1 蛋白表達量IA值分別為415.000 ± 9.055、65.000 ± 3.973，均明顯高于對照組的219.400 ± 8.324、36.600 ± 10.454，差異均有統計學意義（F=2 565.341，P=0.000；F=1 995.197，P=0.000）。
3 討論
燒傷后人體組織嚴重破壞，長時間負氮平衡以及蛋白質、脂肪、糖類等物質儲備損耗，使機體處于嚴重營養不良狀態[12-14]。脂肪組織是能量儲存的主要器官，它能夠整合來自于中樞和外周組織的各類信號，進而調節脂肪儲存和分解[15-16]。燒傷后脂肪組織大量分解會引起高脂血癥、胰島素抵抗等內環境紊亂，降低患者對治療的敏感性和耐受性[17-21]。為此，本研究探討燒傷對BAT的影響，旨在為臨床采取措施調控脂肪組織分解代謝，提高患者生活質量和改善疾病預后提供參考。
本研究發現小鼠燒傷后體重下降同時伴體溫升高，此現象與嚴重燒傷患者臨床表現相同，同時也與BAT激活狀態一致。WAT與BAT在能量代謝中發揮相反作用，其中WAT主要通過甘油三酯貯存能量[22-24]。本研究大體觀察發現實驗組燒傷后BAT體積增大，顏色加深；HE染色示BAT細胞較對照組變小，單個視野平均細胞數增多，脂肪組織毛細血管基質增生；透射電鏡示BAT組織中脂肪滴明顯變小，細胞質和線粒體緊密。UCP-1是線粒體內膜的UCP，是決定BAT組織功能的關鍵因子，UCP-1在BAT中高表達，在WAT中無表達或僅有少量表達[25-29]。本研究結果顯示實驗組BAT中UCP-1基因及蛋白表達量均顯著高于對照組。以上結果均表明燒傷導致BAT被激活，故小鼠BAT可能參與了燒傷后機體的高代謝反應。
本研究中實驗組WAT的大體觀察、HE染色、透射電鏡觀察結果與燒傷機體高代謝脂肪過度消耗相符[12]。同時，HE染色及透射電鏡觀察發現燒傷后WAT組織中的部分細胞形態向BAT細胞轉變；進一步對BAT組織特異性因子UCP-1進行檢測顯示，實驗組WAT中UCP-1基因及蛋白表達量均顯著高于對照組，表明燒傷后部分WAT細胞向BAT細胞轉變。研究表明，在大鼠限制攝入熱量6個月時，通過激活WAT線粒體新陳代謝和脂肪酸生物合成，BAT可由消耗能量系統改變為貯存能量系統[30]。Sharon等[31]將小鼠置于4℃環境中1周，BAT線粒體含量增加，新陳代謝率明顯增高，從而增加了產熱作用； 5周時，周圍皮下組織中的WAT有大量新生血管，并有BAT特征性標質物UCP-1表達，表明低溫暴露可使WAT向BAT轉變。另有學者也通過實驗證實BAT在環境溫度變化、創傷等條件下可轉變為肌肉和WAT[32-33]。
綜上述，小鼠BAT可能參與了燒傷后機體的高代謝反應，燒傷后部分WAT可能向BAT轉變，進一步促進燒傷后高代謝反應。本研究結果為研究燒傷后高代謝的調控機制和治療提供了參考。
燒傷、感染、手術等創傷后，人體存在高代謝以及胰島素抵抗，高代謝會引起機體能量供應不足，臟器功能損害，機體免疫力下降，感染風險增加，創面延遲愈合，嚴重影響患者預后及生活質量[1-2]。創傷后高代謝的發生發展分子機制十分復雜，目前尚未完全闡明。人體脂肪組織分為棕色脂肪（brown adipose tissue，BAT）及白色脂肪（white adipose tissue，WAT）[3-4]，其中BAT在調節機體能量代謝及內分泌中具有重要作用[5-8]。研究表明，BAT通過調節性產熱對人體能量平衡進行調控，可能成為代謝紊亂防治的新靶點[9]。本研究通過觀察燒傷小鼠體溫及體內脂肪組織、肌肉、水等成分變化，明確燒傷后高代謝狀態下BAT及WAT的變化，初步探討燒傷與BAT之間的關系。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
清潔級3～4月齡雄性BALB/c小鼠40只，體重（20 ± 3）g，由中國醫學科學院實驗動物研究所提供（許可證號：SCXK 京2009-0007）。適應性飼養1周以上，室溫維持25～28℃。
Trizol（Invitrogen公司，美國）；逆轉錄試劑盒（Pro-mega公司，美國）；QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix（Toyobo公司，日本）；解偶聯蛋白1（uncoupling protein 1，UCP-1）一抗ab10983（Abcam公司，美國）；免疫組織化學染色試劑盒、DAB （北京尚柏生物醫學技術有限公司）。CO2 恒溫培養箱（Heracell公司，德國）；超凈工作臺（杭州凈化有限公司）；倒置相差顯微鏡（Olympus公司，日本）；L-550臺式低溫離心機（湘儀離心機儀器有限公司）；電子臺秤（惠而邦電子衡器有限公司）；透射電鏡（Jeol公司，日本）；Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件（Media Cybernetics公司，美國）。
1.2 實驗分組及方法
將40 只實驗動物隨機分為實驗組及對照組，每組20只。實驗前12 h禁食，自由飲水。兩組小鼠以腹腔注射戊巴比妥鈉（50 mg/kg）麻醉后，背部去毛。將實驗組小鼠背部置于90℃熱水中9 s，制備30%總體表面積Ⅲ度燙傷模型[10-11]；造模后小鼠立即腹腔注射生理鹽水（40 mL/ kg）抗休克。對照組小鼠背部置于37℃熱水中9 s。實驗動物單籠飼養。
1.3 觀測指標
1.3.1 一般情況
觀察兩組小鼠存活情況。分別于造模前及造模后4周內每周稱重1次，稱重前夜禁食不禁水，第2天清晨使用電子臺稱稱量小鼠空腹體重。于造模前與造模后1、2、3、7 d早、晚各測量1次小鼠直腸溫度，取均值。
1.3.2 大體觀察
造模后7 d，兩組各取12只小鼠，頸椎脫臼處死后分離肩胛間區BAT及附睪WAT，行大體觀察并電子臺秤稱重。
1.3.3 組織學及透射電鏡觀察
大體觀察后，兩組各取其中6只小鼠脂肪組織進行組織學及透射電鏡觀察。① 取部分BAT及WAT，經冰凍切片包埋劑固定，切片，片厚10 μm，HE染色，光鏡下觀察脂肪組織形態。② 取部分BAT及WAT，PBS 液沖洗2次，2%戊二醛固定4周，超薄切片，透射電鏡觀察脂肪細胞超微結構。
1.3.4 實時定量PCR檢測UCP-1基因表達
兩組各取剩余6只小鼠脂肪組織，取部分行實時定量PCR檢測UCP-1基因表達。采用Trizol抽提BAT及WAT總RNA，以隨機引物（oligodT）、 1.25 μL 10 mmol/ L dNTP mix、25 μL RNA酶抑制劑、200 μL M-MLV酶、13.375 μL DEPC水反應體系進行cDNA逆轉錄。以cDNA為模板，進行擴增；引物序列（5'→3'）：UCP-1 上游：AGGGTTTGTGGCTTCTTTTC，下游：TGGTTGG-TTTTATTCGTGGT；內參 β-actin上游：GGCAGGTCT-ACTTTGGAG，下游：ACATTCGAGGCTCCAGTGTT。實時定量PCR總反應體系為20 μL，反應條件：94℃預變性5 min，94℃變性10 s，50℃退火30 s，72℃延伸10 s，22℃延伸5 min，55～95℃40個循環，制備熔解曲線。以與β-actin 的比值作為UCP-1基因相對表達量。
1.3.5 免疫組織化學染色檢測UCP-1蛋白表達
取部分BAT及WAT以10%甲醛固定，采用 ABC 法進行免疫組織化學染色。實驗步驟：石蠟切片，二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化；高壓鍋抗原修復 2 min，PBS 洗滌；3%H2O2去離子水孵育 10 min，PBS 洗滌；滴加正常山羊血清封閉液室溫孵育 20 min，加入1∶500 稀釋的UCP-1一抗，放入濕盒內4℃過夜，PBS 洗滌；依次滴加生物素標記的二抗、生物素過氧化物酶氧化物各15 min；DAB 顯色，蘇木素復染，脫水，透明，封片。鏡下觀察棕黃色顆粒為UCP-1陽性表達。于 200 倍鏡下每張切片隨機取 10 個視野，采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件分析 UCP-1 陽性表達的積分吸光度（IA） 值。
1.4 統計學方法
采用 SPSS17.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用方差分析，兩兩比較采用 LSD 檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 一般情況
兩組小鼠造模后均存活至實驗結束。造模前兩組小鼠空腹體重比較，差異無統計學意義（F=1.770，P=0.069）；造模后1、2、3、4周實驗組小鼠空腹體重顯著低于對照組，比較差異均有統計學意義（P＜ 0.05）。見圖 1。造模前兩組小鼠體溫比較，差異無統計學意義（F=0.000，P=1.000）；造模后1、2、3、7 d實驗組小鼠體溫顯著高于對照組，比較差異均有統計學意義（P＜ 0.05）。見圖 2 。
圖1
造模前后兩組小鼠空腹體重 ? ?2.2 大體觀察
與對照組比較，實驗組WAT體積明顯變小，BAT體積顯著增大、顏色更深（圖 3）。實驗組BAT重量為（0.134 ± 0.015） g，顯著高于對照組的（0.084 ± 0.005） g，差異有統計學意義（F=122.893，P=0.000）；實驗組WAT重量為（0.062 ± 0.013）g，顯著低于對照組的（0.194 ± 0.114）g，比較差異有統計學意義（F=184.300，P=0.000）。
2.3 組織學觀察
造模后7 d，與對照組相比，實驗組單個視野細胞數顯著增多，WAT及BAT細胞均變小，細胞長徑和短徑均顯著降低，其中WAT毛細血管基質增生，BAT細胞間質及毛細血管基質增生。見圖 4。
2.4 透射電鏡觀察
造模后7 d，對照組WAT細胞中脂肪滴占據大部分細胞質，細胞質呈薄層，位于細胞周緣，包繞脂滴；實驗組WAT細胞中脂滴明顯變小，細胞質和線粒體多于對照組。對照組BAT細胞中脂滴占據大部分細胞質，線粒體分散；實驗組BAT脂滴明顯變小，細胞質和線粒體明顯增多并連接緊密。見圖 5。
2.5 實時定量PCR檢測UCP-1基因表達
實驗組BAT中UCP-1基因相對表達量為1.236 ± 0.159，對照組為0.212 ± 0.032，比較差異有統計學意義（F=20.420，P=0.000）。實驗組WAT中UCP-1基因相對表達量為0.032 ± 0.004，對照組為0.080 ± 0.044，比較差異有統計學意義（F=256.366，P=0.000）。
2.6 免疫組織化學染色觀測UCP-1蛋白表達
鏡下觀察見實驗組BAT、WAT內棕黃色顆粒均多于對照組，見圖 6。實驗組BAT、WAT中UCP-1 蛋白表達量IA值分別為415.000 ± 9.055、65.000 ± 3.973，均明顯高于對照組的219.400 ± 8.324、36.600 ± 10.454，差異均有統計學意義（F=2 565.341，P=0.000；F=1 995.197，P=0.000）。
3 討論
燒傷后人體組織嚴重破壞，長時間負氮平衡以及蛋白質、脂肪、糖類等物質儲備損耗，使機體處于嚴重營養不良狀態[12-14]。脂肪組織是能量儲存的主要器官，它能夠整合來自于中樞和外周組織的各類信號，進而調節脂肪儲存和分解[15-16]。燒傷后脂肪組織大量分解會引起高脂血癥、胰島素抵抗等內環境紊亂，降低患者對治療的敏感性和耐受性[17-21]。為此，本研究探討燒傷對BAT的影響，旨在為臨床采取措施調控脂肪組織分解代謝，提高患者生活質量和改善疾病預后提供參考。
本研究發現小鼠燒傷后體重下降同時伴體溫升高，此現象與嚴重燒傷患者臨床表現相同，同時也與BAT激活狀態一致。WAT與BAT在能量代謝中發揮相反作用，其中WAT主要通過甘油三酯貯存能量[22-24]。本研究大體觀察發現實驗組燒傷后BAT體積增大，顏色加深；HE染色示BAT細胞較對照組變小，單個視野平均細胞數增多，脂肪組織毛細血管基質增生；透射電鏡示BAT組織中脂肪滴明顯變小，細胞質和線粒體緊密。UCP-1是線粒體內膜的UCP，是決定BAT組織功能的關鍵因子，UCP-1在BAT中高表達，在WAT中無表達或僅有少量表達[25-29]。本研究結果顯示實驗組BAT中UCP-1基因及蛋白表達量均顯著高于對照組。以上結果均表明燒傷導致BAT被激活，故小鼠BAT可能參與了燒傷后機體的高代謝反應。
本研究中實驗組WAT的大體觀察、HE染色、透射電鏡觀察結果與燒傷機體高代謝脂肪過度消耗相符[12]。同時，HE染色及透射電鏡觀察發現燒傷后WAT組織中的部分細胞形態向BAT細胞轉變；進一步對BAT組織特異性因子UCP-1進行檢測顯示，實驗組WAT中UCP-1基因及蛋白表達量均顯著高于對照組，表明燒傷后部分WAT細胞向BAT細胞轉變。研究表明，在大鼠限制攝入熱量6個月時，通過激活WAT線粒體新陳代謝和脂肪酸生物合成，BAT可由消耗能量系統改變為貯存能量系統[30]。Sharon等[31]將小鼠置于4℃環境中1周，BAT線粒體含量增加，新陳代謝率明顯增高，從而增加了產熱作用； 5周時，周圍皮下組織中的WAT有大量新生血管，并有BAT特征性標質物UCP-1表達，表明低溫暴露可使WAT向BAT轉變。另有學者也通過實驗證實BAT在環境溫度變化、創傷等條件下可轉變為肌肉和WAT[32-33]。
綜上述，小鼠BAT可能參與了燒傷后機體的高代謝反應，燒傷后部分WAT可能向BAT轉變，進一步促進燒傷后高代謝反應。本研究結果為研究燒傷后高代謝的調控機制和治療提供了參考。
