引用本文： 宋志芳, 劉德伍. 微小RNA在皮膚發育再生及創面愈合中的作用. 中國修復重建外科雜志, 2014, 28(7): 913-918. doi: 10.7507/1002-1892.20140200 復制
微小RNA（microRNA，miRNA）作為內源性單鏈非編碼RNA，在機體發育、細胞增殖分化與凋亡、腫瘤形成及疾病發生發展等許多生物過程中發揮重要作用。越來越多研究表明[1-3]，miRNA參與調控皮膚及其附屬器的形成和穩態，且與皮膚再生修復顯著相關。本文就miRNA在皮膚發育、再生與創面愈合各環節中的作用作一綜述。
1 miRNA的生物合成及功能概述
miRNA是一類由19～24個核苷酸組成的單鏈非編碼RNA分子，其基因位于內含子或非編碼區的外顯子或間隔區。大多數miRNA基因是孤立的，并在自身啟動子的控制下表達，少數miRNA基因是成簇的，可以共表達[4]。在哺乳動物的基因組中，miRNA基因占基因總數的1%～3%[5]。miRNA的加工過程如下：首先，在細胞核內，RNA聚合酶Ⅱ將編碼miRNA的基因轉錄成含有幾千個堿基、具備莖環結構的分子，即初級miRNA（pri-miRNA）；pri-miRNA與信使核糖核酸（mRNA）分子類似，亦含有5'帽子結構和 3'多聚A尾巴。然后，pri-miRNA的莖部被RNA酶ⅢDrosha及其輔助因子DGCR8非對稱地切割，形成約70個核苷酸長度的前體miRNA（pre-miRNA）。接著，pre-miRNA被核轉運受體Exportin-5及核蛋白RanGTP輸送至細胞質中，由RNA酶ⅢDicer切割其環部，產生一個短的雙鏈分子，其中一條單鏈為成熟miRNA，能結合到靶mRNA的3'非翻譯區來調節基因的表達；另一條為與之互補的miRNA*，miRNA*一般被降解，在某些情況下miRNA*可不被降解，亦靶向結合某些特定的基因[6]。研究發現，miRNA與靶基因的結合位點位于其自身5'端的第2～8個核苷酸，即由7個核苷酸組成的“種子序列”，并且是通過RNA誘導的沉默復合物（RNA induced silencing complex，RISC）發揮作用[7]。雖然miRNA通過RISC調節基因表達的精確機制仍不清楚，但一般認為miRNA和靶基因之間的互補程度是調節基因表達的主要機制[8]，即兩者如果高度互補，近乎完美，靶基因則被降解；如果互補程度低，則對靶基因進行翻譯抑制。據估計，超過1/3編碼蛋白的基因受miRNA調控[9]，miRNA通過轉錄后調控基因表達影響細胞蛋白質的合成[10]。因此，miRNA是動物發育及許多生物過程的重要調控者，如信號轉導、細胞增殖與分化、細胞凋亡、衰老與死亡、免疫調節、炎性反應、脂肪代謝[11]、器官發育、腫瘤形成及疾病的發生發展等。皮膚的形態發生是一個復雜過程，受一系列信號通路調節，已有許多研究證實穩定的miRNA調控網絡在這一過程發揮極其重要的作用，miRNA異常必將導致皮膚形態發生障礙[1-3]。
2 miRNA在皮膚發育中的作用
初次探討miRNA在皮膚中的作用是通過缺失miRNA生物合成所需的關鍵酶和蛋白來進行的。小鼠胚胎發育早期組成性缺失Dicer[12]或DGCR8[13]可導致胚胎在皮膚發育之前死亡，而在小鼠胚胎發育晚期條件性缺失Dicer可以更好地研究miRNA功能。Yi等[2]在表皮特異性啟動子角蛋白14的介導下將胚胎皮膚祖細胞的Dicer條件性敲除，即胚胎發育17.5 d時皮膚相關的miRNA缺失，晚于表皮分化時間（胚胎發育13.5 d）及毛發初步發育時間（胚胎發育15.5 d）[3]。Dicer敲除后新生小鼠的表型基本正常，但出生后 1～2 d體重開始下降，4～6 d出現明顯脫水，在毛被發育前死亡。組織學檢查示，小鼠皮膚毛囊發育不全及錯位，凋亡增加，毛囊形成過程中不向內陷，而是向表皮外翻、退化，表皮層形成囊狀結構，表皮屏障功能喪失，導致Dicer缺失小鼠脫水和早期死亡。且毛囊外根鞘膨凸部的干細胞標志物，如角蛋白15和CD34缺失，提示毛囊發育缺陷是由于毛囊干細胞的早期缺失所致。與之對比，濾泡間表皮未受到明顯影響，保持其正常分化程序，表明一部分miRNAs（或它們的靶基因）作用于毛囊干細胞，而不是濾泡間表皮。除了Dicer，DGCR8也是miRNA生物合成過程中必不可少的輔酶。使用類似敲除Dicer的方法使表皮特異性缺失DGCR8，結果發現，DGCR8缺失的小鼠表型和Dicer缺失小鼠無太大差異，如毛囊外翻、毛球細胞凋亡增多、皮膚粗糙、脫水及新生小鼠致死現象等[14]。通過研究Dicer和DGCR8敲除的小鼠皮膚，揭示了miRNAs在皮膚形態發生、毛囊干細胞的維持、表皮細胞增殖和凋亡中具有重要作用。
3 單個miRNA在皮膚發育中的表達及功能
關于單個miRNA在皮膚調控機制中的研究也有很多報道，Andl等[15]對正常新生小鼠和轉基因新生小鼠（即通過表達Wnt抑制劑DKK1干擾毛發發育的小鼠）全層皮膚的miRNA進行芯片掃描以辨別miRNA表達有無差異，結果發現，miR-200家族（miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-141及 miR-149）、miR-19/20家族（miR-19b、miR-20、miR-17-5p及miR-93）在表皮中優先表達，而miR-199a、miR-214、miR-126、miR-143、miR-152在毛囊中優先表達。
許多miRNAs對皮膚有特定功能[1, 16]。miR-203是第一個被發現在表皮及毛囊豐富表達的miRNA。Sonkoly等[17]系統分析了miR-203在健康人皮膚及各器官中的表達，結果顯示miR-203在皮膚中的表達比在其他器官中高出100倍，被稱為是“皮膚特異性的miRNA”。另一項研究發現，miR-203在小鼠胚胎13.5 d時的皮膚（為單層上皮）中幾乎檢測不到，但胚胎15.5 d（表皮開始分層時）后成為皮膚中表達最豐富的miRNA，提示其表達與皮膚分化和分層密切相關[18]。成熟皮膚原位雜交實驗發現[18]，miR-203高表達于分化后的細胞，如表皮基底上層或毛囊的內根鞘，但不表達于干/祖細胞，如表皮基底層、毛囊外根鞘隆突部。且miR-203這種在皮膚最外層高表達的方式在斑馬魚[19]和人[20]皮膚組織中也得到了證實，表示一種跨物種的保守功能。當角質形成細胞在體外被鈣[21]、12-氧-十四烷酰佛波醇-13-乙酸酯[22]或維生素D[22]誘導分化時，miR-203表達迅速增加。在表皮基底層過表達miR-203的轉基因小鼠出生后不久死亡，組織學檢查顯示表皮菲薄、基底層角蛋白5陽性細胞耗竭，提示miR-203過表達能誘導角質形成細胞分化，減少干細胞集落形成能力，并誘導基底層細胞退出細胞周期[18]。然而，miR-203誘導角質形成細胞分化是有限的，其主要任務是限制干細胞從基底層過渡至基底上層時的增殖潛能[23]。轉錄因子p63是表皮角質形成細胞中miR-203的重要靶基因，它是不同物種復層上皮組織中一個重要的干性維持者，若小鼠缺失p63會導致所有復層上皮災難性損失[24]。p63和miR-203的表達是一種相互排斥的模式，生物信息學和實驗表明，miR-203通過直接抑制p63表達，促進基底層細胞退出細胞周期且向基底上層過渡[25]。另外，p63亦受miR-720、miR-574-3p[26]靶向調控，與miR-203的表達模式及功能類似，miR-720、miR-574-3p也主要在人表皮基底上層表達，參與表皮分化。研究表明，p63調節角質形成細胞細胞周期進程的機制之一是通過抑制miR-34家族成員（miR-34a、miR-34c）實現的[27]，繼而增加細胞周期蛋白D1、CDK4的表達，促進干細胞由G1期向S期轉變，即促進小鼠干細胞增殖。p63還能通過轉錄調控Dicer和miR-130b從而達到抑制腫瘤及其轉移的作用[28]。
鑒于miRNA在調節胚胎和成體干細胞的關鍵作用，可以預見其也能調節表皮干細胞。研究顯示，miR-125b在小鼠的表皮干細胞高表達，而在早期子代細胞表達大幅下降，其通過轉錄后抑制靶基因Blimp1及VDR維持角質形成細胞“干性”[29]，若在轉基因小鼠的皮膚干細胞及其子代細胞中持續過表達miR-125b可導致表皮增厚、皮脂腺增大，且未能產生毛被，說明了miR-125b能調節干細胞的自我更新，抑制干細胞分化。同樣，在人表皮干細胞中高表達的miR-24通過轉錄后抑制細胞周期蛋白依賴激酶抑制蛋白P27、P16，促進干細胞由G1期向S期轉變，細胞增殖；相反，拮抗miR-24可抑制表皮干細胞增殖[30] 。
毛囊周期分為生長期、退行期和靜止期，同時伴有表皮和毛囊顯微解剖、血管、神經的顯著變化[31]。miR-31為控制毛發生長周期的一個關鍵因子，其在小鼠毛發生長期表達顯著增加，在退行期和靜止期下降，通過抑制靶基因Krt16、Dlx3、Fgf10來抑制毛發生長；相反，抑制miR-31的表達后，毛囊數量增加，毛球增多，毛囊外根鞘增生肥厚[32]。Peng等[33]研究還發現，在人或小鼠中miR-31通過負向調控缺氧誘導因子1（hypoxia inducible factor 1，HIF-1），繼而激活Notch通路，促進表皮干細胞分化。
復制性細胞衰老是細胞分裂過程中不可避免地發生細胞損傷積累的結果，隨著年齡增加，突變和損害幾率也增加，細胞開始衰老，衰老時細胞周期停滯，細胞衰老可防止癌變，保護機體遠離癌癥。研究發現miR-137、miR-668[34]、miR-191[35]等與人角質形成細胞的復制性衰老有關，其通過轉錄后下調細胞周期調節基因SATB1、CDK6，阻止細胞從G1期進入S期，導致細胞周期停滯，增殖停止，誘導角質形成細胞進入衰老程 序。
4 miRNA與皮膚創面愈合
創面愈合涉及3個相互重疊的階段[36]：炎性階段，主要表現為血管擴張，毛細血管通透性增加，體液外滲及炎性細胞浸潤；增殖階段，主要表現為上皮化、血管形成及肉芽組織形成；重塑階段，主要表現為膠原沉積。皮膚創面愈合的不同階段中miRNA的表達各不相同，miRNA的異常表達在創面畸形愈合中起著關鍵作用[37]。
4.1 炎性階段miRNA的作用
創面炎性反應始于中性粒細胞及其他白細胞通過受損血管被動滲漏入創面，接著創面的免疫細胞釋放趨化因子、細胞因子及生長因子如巨噬細胞趨化蛋白、PDGF、血小板因子Ⅳ、IL-1β、TGF-β、TNF-α、Toll樣受體（toll-like receptors，TLRs），繼而吸引中性粒細胞和單核細胞聚集，聚集的中性粒細胞具有清潔作用，并殺死入侵的微生物；滲出的單核細胞成熟為巨噬細胞，發揮吞噬、促炎或抗炎和促血管生成等作用。
研究發現創面釋放的炎性介質能誘導特異的miRNA表達，繼而miRNA又能沉默大量促炎因子，即體內存在一個調節環。miR-146[38]、miR-155[38]、miR-21[39]及miR-125b[40]參與了創面炎癥及免疫應答，這些miRNAs能被促炎因子，如IL-1β、TNF-α和TLRs等誘導表達。miR-146家族包括兩個成員：miR-146a和miR-146b，啟動子分析研究提示miR-146a為NF-κB依賴的基因，暴露于炎癥環境下，促炎因子如TNF-α或IL-1β、或TLR-2、4、5能顯著誘導其表達。IRAK1和TRAF6為其靶基因，miR-146a與靶基因結合通過負反饋循環機制調控TLR信號，抑制IL-8及正常T細胞表達和分泌的活性調節蛋白RANTES的釋放。除了TRAF6和IRAK1，IRAK2為miR-146a的另一個靶基因，能調節干擾素的產生。miR-155同樣能被許多炎性介質誘導表達，如TNF-α、聚肌苷酸-聚胞苷酸和IFN-β，通過作用于c/ebp靶基因促進IL-10發揮抗炎作用。miR-21亦是一種常見的受炎癥誘導的miRNA，能轉錄后抑制多個靶基因。與炎癥有關的靶基因是促炎因子程序性細胞死亡因子4（programmed cell death 4，PDCD4），miR-21通過抑制PDCD4使IL-10產生增加，從而抑制了脂多糖的促炎作用。炎癥期間TLR-4亦能誘導miR-125b的表達，同時miR-125b能直接結合至TNF-α的3'非翻譯區繼而靶向沉默TNF-α的表 達。
4.2 增殖階段miRNA的作用
增殖階段重要特征之一是血管形成。內皮細胞增殖遷移和毛細血管形成是血管形成的早期表現，毛細血管進入創面床是支持組織再生的關鍵，若抑制創面血管生成，會嚴重影響創面愈合[41]。研究發現敲除Dicer、Drosha后抑制了內皮細胞毛細血管發芽、遷移和血管生成，提示miRNA參與血管生成[42]。Dicer對鼠胚胎血管生成也是必需的[43]，耗竭內皮細胞的miRNA將抑制出生后各種刺激誘導血管生成的反應，如外源性VEGF、腫瘤、肢體缺血和創面。已發現的促血管生成的miRNA有miR-17-92[44]、miR-126[45]、miR-130a[46]、miR-210[47-48]、miR-296[49]、miR-378[50]等。研究發現，miR-17-92在創面增殖階段往往表達增加，其靶基因血小板反應蛋白1（thrombospondin 1，TSP-1）及結締組織生長因子（connective tissue growth factor，CTGF）為抗血管生成因子，miR-17-92通過抑制TSP-1及CTGF，發揮促血管生成作用。有報道[45]miR-126能促進血管內皮細胞對VEGF的反應性，在對斑馬魚的研究中發現，敲除miR-126后導致胚胎發育過程中血管完整性喪失，出血增加。其靶基因Spred1及PIK3R2能抑制VEGF的表達，miR-126通過抑制Spred1及PIK3R2 實現調節血管完整性和血管生成的作用。已發現GAX、HOXA5基因有抑制血管內皮細胞的血管生成作用，而miR-130a通過抑制GAX、HOXA5基因表達，從而促進血管內皮細胞發揮血管生成作用。另有研究發現[47-48]當血管內皮細胞暴露于缺氧環境下，miR-210的表達逐漸增加，其通過抑制靶基因EFNA3促進基底膜毛細管樣結構的形成及內皮細胞遷移；相反，拮抗miR-210則抑制血管內皮細胞生長及誘導細胞凋亡。炎癥環境下生長因子能誘導miR-296顯著升高，其通過抑制靶基因HGS降低了生長因子受體VEGFR-2和PDGFR-β的降解，最終血管生成增加。另外miR-378通過抑制靶基因Fus-1、Sufu的表達促進血管生成。抑制血管生成的miRNA有miR-92a[51-52]、miR-17[53]、miR-15b、miR-16、miR-20a[54]、miR-221、miR-222[55]、miR-320[56]等。miR-92a主要表達于人內皮細胞，在心肌梗死小鼠模型中，內皮細胞過表達miR-92a，通過抑制整合素α5的表達能阻斷血管發生；相反，抑制miR-92a能促進血管生長和損傷組織的功能恢復。有報道[53]創面局部缺血能上調miR-17，通過抑制靶基因Janus Kinase1，從而抑制血管內皮細胞芽的形成，最終血管數量減少。同樣，缺氧條件下，miR-15b、miR-16、miR-20a表達上調，能直接抑制VEGF的表達，從而減少血管生成。研究報道[56]miR-320表達于微血管內皮細胞，通過抑制促血管生成作用的IGF-1表達，影響血管內皮細胞的增殖與遷移，血管生成減少。miR-221、miR-222亦表達于血管內皮細胞，通過抑制血管生成因子c-kit的表達來控制內皮細胞形成新的毛細血管。
增殖階段另一個重要特征是表皮細胞再生，表現為創面邊緣角質形成細胞的遷移和增殖[57]。沉默SHIP2和增強AKT信號能加速角質形成細胞遷移，miR-205通過抑制SHIP2的轉錄促進角質形成細胞遷移，并拮抗角質形成細胞凋亡，有利于上皮的穩定及創面愈合；拮抗miR-205后，可使創面的絲狀肌動蛋白減少，細胞黏附力增加，焦點接觸增強，從而創面愈合延遲[58]。而miR-205在體內受miR-184的制約，miR-184能拮抗miR-205的抗SHIP2能力，從而使角質形成細胞凋亡、死亡增加[59]。miR-210也通過調控角質形成細胞的增殖影響創面閉合，Biswas等[60]研究發現miR-210在體內缺血性創面中表達上調，miR-210屬于對缺氧敏感的miRNA，而大多數慢性創面屬缺血缺氧性創面，在HIF-1α的刺激下miR-210表達增加，抑制靶基因細胞周期調節蛋白E2F3的轉錄[61]，阻礙細胞從G1期進入S期，DNA合成率及細胞增殖率明顯下降，創面愈合延遲。miR-21也參與了創面愈合[62]，創面愈合過程中TGF-β1上調miR-21的表達，其通過抑制靶基因TIMP3、TIAM1從而促進角質形成細胞的遷移及創面的再上皮化。
4.3 重塑階段miRNA的作用
膠原沉積是重塑階段的一個主要特征。在纖維增生性瘢痕疙瘩形成中，miRNA發揮了重要作用。哺乳動物妊娠早期階段胎兒皮膚無痕愈合[63]，而在后期轉成瘢痕愈合表型[64]，一些miRNA在兩階段之間的表達存在明顯差異，尤其是miR-29b、miR-29c和miR-192在妊娠后期顯著升高，提示參與了瘢痕愈合[65]。miR-29b和miR-29c抑制多種參與無痕愈合信號通路有關的蛋白質，包括細胞外基質蛋白、抗肝纖維化TGF-β、Smad蛋白及β-catenin蛋白[66]。miR-192通過靶向抑制Smad相互作用蛋白1以增強膠原蛋白12的表達[67]。miR-29a能在轉錄后直接抑制膠原蛋白的表達，而在正常皮膚成纖維細胞，miR-29a受控于TGF-β、PDGF-B和IL-4[68]。Kashiyama等[69]比較了瘢痕疙瘩成纖維細胞與正常成纖維細胞的miRNA表達譜，發現20個下調和7個上調的miRNA，特別是miR-196a下調最明顯，miR-196a的表達量與Ⅰ、Ⅲ型膠原水平成負相關[68]。另有研究發現miR-483-3p在創面愈合的終末階段表達上調，通過抑制靶基因MK2、MK167、YAP1的表達，抑制角質形成細胞的增殖與遷移，最終使創面再上皮化過程終止[70]。
5 展望
miRNA 在維持皮膚正常結構功能及創面再生修復過程中發揮重要作用。進一步探討其在創面再生修復不同階段與正常皮膚之間的差異表達，將有助于識別和發現特異性miRNAs，明確它們在皮膚創面愈合中的作用及其調控機制，并為治療提供靶點。鑒于部分miRNA在創面修復中的重要作用，以miRNA為靶標的基因治療可為臨床難愈性創面修復提供新方法。但值得注意的是，已發現同一個miRNA在不同細胞類型中常表現不同甚至截然相反的功能，因此對于miRNA在創面再生修復各個階段中的表達與調控作用及其多效性可能帶來的副作用等，均有待深入研究。
微小RNA（microRNA，miRNA）作為內源性單鏈非編碼RNA，在機體發育、細胞增殖分化與凋亡、腫瘤形成及疾病發生發展等許多生物過程中發揮重要作用。越來越多研究表明[1-3]，miRNA參與調控皮膚及其附屬器的形成和穩態，且與皮膚再生修復顯著相關。本文就miRNA在皮膚發育、再生與創面愈合各環節中的作用作一綜述。
1 miRNA的生物合成及功能概述
miRNA是一類由19～24個核苷酸組成的單鏈非編碼RNA分子，其基因位于內含子或非編碼區的外顯子或間隔區。大多數miRNA基因是孤立的，并在自身啟動子的控制下表達，少數miRNA基因是成簇的，可以共表達[4]。在哺乳動物的基因組中，miRNA基因占基因總數的1%～3%[5]。miRNA的加工過程如下：首先，在細胞核內，RNA聚合酶Ⅱ將編碼miRNA的基因轉錄成含有幾千個堿基、具備莖環結構的分子，即初級miRNA（pri-miRNA）；pri-miRNA與信使核糖核酸（mRNA）分子類似，亦含有5'帽子結構和 3'多聚A尾巴。然后，pri-miRNA的莖部被RNA酶ⅢDrosha及其輔助因子DGCR8非對稱地切割，形成約70個核苷酸長度的前體miRNA（pre-miRNA）。接著，pre-miRNA被核轉運受體Exportin-5及核蛋白RanGTP輸送至細胞質中，由RNA酶ⅢDicer切割其環部，產生一個短的雙鏈分子，其中一條單鏈為成熟miRNA，能結合到靶mRNA的3'非翻譯區來調節基因的表達；另一條為與之互補的miRNA*，miRNA*一般被降解，在某些情況下miRNA*可不被降解，亦靶向結合某些特定的基因[6]。研究發現，miRNA與靶基因的結合位點位于其自身5'端的第2～8個核苷酸，即由7個核苷酸組成的“種子序列”，并且是通過RNA誘導的沉默復合物（RNA induced silencing complex，RISC）發揮作用[7]。雖然miRNA通過RISC調節基因表達的精確機制仍不清楚，但一般認為miRNA和靶基因之間的互補程度是調節基因表達的主要機制[8]，即兩者如果高度互補，近乎完美，靶基因則被降解；如果互補程度低，則對靶基因進行翻譯抑制。據估計，超過1/3編碼蛋白的基因受miRNA調控[9]，miRNA通過轉錄后調控基因表達影響細胞蛋白質的合成[10]。因此，miRNA是動物發育及許多生物過程的重要調控者，如信號轉導、細胞增殖與分化、細胞凋亡、衰老與死亡、免疫調節、炎性反應、脂肪代謝[11]、器官發育、腫瘤形成及疾病的發生發展等。皮膚的形態發生是一個復雜過程，受一系列信號通路調節，已有許多研究證實穩定的miRNA調控網絡在這一過程發揮極其重要的作用，miRNA異常必將導致皮膚形態發生障礙[1-3]。
2 miRNA在皮膚發育中的作用
初次探討miRNA在皮膚中的作用是通過缺失miRNA生物合成所需的關鍵酶和蛋白來進行的。小鼠胚胎發育早期組成性缺失Dicer[12]或DGCR8[13]可導致胚胎在皮膚發育之前死亡，而在小鼠胚胎發育晚期條件性缺失Dicer可以更好地研究miRNA功能。Yi等[2]在表皮特異性啟動子角蛋白14的介導下將胚胎皮膚祖細胞的Dicer條件性敲除，即胚胎發育17.5 d時皮膚相關的miRNA缺失，晚于表皮分化時間（胚胎發育13.5 d）及毛發初步發育時間（胚胎發育15.5 d）[3]。Dicer敲除后新生小鼠的表型基本正常，但出生后 1～2 d體重開始下降，4～6 d出現明顯脫水，在毛被發育前死亡。組織學檢查示，小鼠皮膚毛囊發育不全及錯位，凋亡增加，毛囊形成過程中不向內陷，而是向表皮外翻、退化，表皮層形成囊狀結構，表皮屏障功能喪失，導致Dicer缺失小鼠脫水和早期死亡。且毛囊外根鞘膨凸部的干細胞標志物，如角蛋白15和CD34缺失，提示毛囊發育缺陷是由于毛囊干細胞的早期缺失所致。與之對比，濾泡間表皮未受到明顯影響，保持其正常分化程序，表明一部分miRNAs（或它們的靶基因）作用于毛囊干細胞，而不是濾泡間表皮。除了Dicer，DGCR8也是miRNA生物合成過程中必不可少的輔酶。使用類似敲除Dicer的方法使表皮特異性缺失DGCR8，結果發現，DGCR8缺失的小鼠表型和Dicer缺失小鼠無太大差異，如毛囊外翻、毛球細胞凋亡增多、皮膚粗糙、脫水及新生小鼠致死現象等[14]。通過研究Dicer和DGCR8敲除的小鼠皮膚，揭示了miRNAs在皮膚形態發生、毛囊干細胞的維持、表皮細胞增殖和凋亡中具有重要作用。
3 單個miRNA在皮膚發育中的表達及功能
關于單個miRNA在皮膚調控機制中的研究也有很多報道，Andl等[15]對正常新生小鼠和轉基因新生小鼠（即通過表達Wnt抑制劑DKK1干擾毛發發育的小鼠）全層皮膚的miRNA進行芯片掃描以辨別miRNA表達有無差異，結果發現，miR-200家族（miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-141及 miR-149）、miR-19/20家族（miR-19b、miR-20、miR-17-5p及miR-93）在表皮中優先表達，而miR-199a、miR-214、miR-126、miR-143、miR-152在毛囊中優先表達。
許多miRNAs對皮膚有特定功能[1, 16]。miR-203是第一個被發現在表皮及毛囊豐富表達的miRNA。Sonkoly等[17]系統分析了miR-203在健康人皮膚及各器官中的表達，結果顯示miR-203在皮膚中的表達比在其他器官中高出100倍，被稱為是“皮膚特異性的miRNA”。另一項研究發現，miR-203在小鼠胚胎13.5 d時的皮膚（為單層上皮）中幾乎檢測不到，但胚胎15.5 d（表皮開始分層時）后成為皮膚中表達最豐富的miRNA，提示其表達與皮膚分化和分層密切相關[18]。成熟皮膚原位雜交實驗發現[18]，miR-203高表達于分化后的細胞，如表皮基底上層或毛囊的內根鞘，但不表達于干/祖細胞，如表皮基底層、毛囊外根鞘隆突部。且miR-203這種在皮膚最外層高表達的方式在斑馬魚[19]和人[20]皮膚組織中也得到了證實，表示一種跨物種的保守功能。當角質形成細胞在體外被鈣[21]、12-氧-十四烷酰佛波醇-13-乙酸酯[22]或維生素D[22]誘導分化時，miR-203表達迅速增加。在表皮基底層過表達miR-203的轉基因小鼠出生后不久死亡，組織學檢查顯示表皮菲薄、基底層角蛋白5陽性細胞耗竭，提示miR-203過表達能誘導角質形成細胞分化，減少干細胞集落形成能力，并誘導基底層細胞退出細胞周期[18]。然而，miR-203誘導角質形成細胞分化是有限的，其主要任務是限制干細胞從基底層過渡至基底上層時的增殖潛能[23]。轉錄因子p63是表皮角質形成細胞中miR-203的重要靶基因，它是不同物種復層上皮組織中一個重要的干性維持者，若小鼠缺失p63會導致所有復層上皮災難性損失[24]。p63和miR-203的表達是一種相互排斥的模式，生物信息學和實驗表明，miR-203通過直接抑制p63表達，促進基底層細胞退出細胞周期且向基底上層過渡[25]。另外，p63亦受miR-720、miR-574-3p[26]靶向調控，與miR-203的表達模式及功能類似，miR-720、miR-574-3p也主要在人表皮基底上層表達，參與表皮分化。研究表明，p63調節角質形成細胞細胞周期進程的機制之一是通過抑制miR-34家族成員（miR-34a、miR-34c）實現的[27]，繼而增加細胞周期蛋白D1、CDK4的表達，促進干細胞由G1期向S期轉變，即促進小鼠干細胞增殖。p63還能通過轉錄調控Dicer和miR-130b從而達到抑制腫瘤及其轉移的作用[28]。
鑒于miRNA在調節胚胎和成體干細胞的關鍵作用，可以預見其也能調節表皮干細胞。研究顯示，miR-125b在小鼠的表皮干細胞高表達，而在早期子代細胞表達大幅下降，其通過轉錄后抑制靶基因Blimp1及VDR維持角質形成細胞“干性”[29]，若在轉基因小鼠的皮膚干細胞及其子代細胞中持續過表達miR-125b可導致表皮增厚、皮脂腺增大，且未能產生毛被，說明了miR-125b能調節干細胞的自我更新，抑制干細胞分化。同樣，在人表皮干細胞中高表達的miR-24通過轉錄后抑制細胞周期蛋白依賴激酶抑制蛋白P27、P16，促進干細胞由G1期向S期轉變，細胞增殖；相反，拮抗miR-24可抑制表皮干細胞增殖[30] 。
毛囊周期分為生長期、退行期和靜止期，同時伴有表皮和毛囊顯微解剖、血管、神經的顯著變化[31]。miR-31為控制毛發生長周期的一個關鍵因子，其在小鼠毛發生長期表達顯著增加，在退行期和靜止期下降，通過抑制靶基因Krt16、Dlx3、Fgf10來抑制毛發生長；相反，抑制miR-31的表達后，毛囊數量增加，毛球增多，毛囊外根鞘增生肥厚[32]。Peng等[33]研究還發現，在人或小鼠中miR-31通過負向調控缺氧誘導因子1（hypoxia inducible factor 1，HIF-1），繼而激活Notch通路，促進表皮干細胞分化。
復制性細胞衰老是細胞分裂過程中不可避免地發生細胞損傷積累的結果，隨著年齡增加，突變和損害幾率也增加，細胞開始衰老，衰老時細胞周期停滯，細胞衰老可防止癌變，保護機體遠離癌癥。研究發現miR-137、miR-668[34]、miR-191[35]等與人角質形成細胞的復制性衰老有關，其通過轉錄后下調細胞周期調節基因SATB1、CDK6，阻止細胞從G1期進入S期，導致細胞周期停滯，增殖停止，誘導角質形成細胞進入衰老程 序。
4 miRNA與皮膚創面愈合
創面愈合涉及3個相互重疊的階段[36]：炎性階段，主要表現為血管擴張，毛細血管通透性增加，體液外滲及炎性細胞浸潤；增殖階段，主要表現為上皮化、血管形成及肉芽組織形成；重塑階段，主要表現為膠原沉積。皮膚創面愈合的不同階段中miRNA的表達各不相同，miRNA的異常表達在創面畸形愈合中起著關鍵作用[37]。
4.1 炎性階段miRNA的作用
創面炎性反應始于中性粒細胞及其他白細胞通過受損血管被動滲漏入創面，接著創面的免疫細胞釋放趨化因子、細胞因子及生長因子如巨噬細胞趨化蛋白、PDGF、血小板因子Ⅳ、IL-1β、TGF-β、TNF-α、Toll樣受體（toll-like receptors，TLRs），繼而吸引中性粒細胞和單核細胞聚集，聚集的中性粒細胞具有清潔作用，并殺死入侵的微生物；滲出的單核細胞成熟為巨噬細胞，發揮吞噬、促炎或抗炎和促血管生成等作用。
研究發現創面釋放的炎性介質能誘導特異的miRNA表達，繼而miRNA又能沉默大量促炎因子，即體內存在一個調節環。miR-146[38]、miR-155[38]、miR-21[39]及miR-125b[40]參與了創面炎癥及免疫應答，這些miRNAs能被促炎因子，如IL-1β、TNF-α和TLRs等誘導表達。miR-146家族包括兩個成員：miR-146a和miR-146b，啟動子分析研究提示miR-146a為NF-κB依賴的基因，暴露于炎癥環境下，促炎因子如TNF-α或IL-1β、或TLR-2、4、5能顯著誘導其表達。IRAK1和TRAF6為其靶基因，miR-146a與靶基因結合通過負反饋循環機制調控TLR信號，抑制IL-8及正常T細胞表達和分泌的活性調節蛋白RANTES的釋放。除了TRAF6和IRAK1，IRAK2為miR-146a的另一個靶基因，能調節干擾素的產生。miR-155同樣能被許多炎性介質誘導表達，如TNF-α、聚肌苷酸-聚胞苷酸和IFN-β，通過作用于c/ebp靶基因促進IL-10發揮抗炎作用。miR-21亦是一種常見的受炎癥誘導的miRNA，能轉錄后抑制多個靶基因。與炎癥有關的靶基因是促炎因子程序性細胞死亡因子4（programmed cell death 4，PDCD4），miR-21通過抑制PDCD4使IL-10產生增加，從而抑制了脂多糖的促炎作用。炎癥期間TLR-4亦能誘導miR-125b的表達，同時miR-125b能直接結合至TNF-α的3'非翻譯區繼而靶向沉默TNF-α的表 達。
4.2 增殖階段miRNA的作用
增殖階段重要特征之一是血管形成。內皮細胞增殖遷移和毛細血管形成是血管形成的早期表現，毛細血管進入創面床是支持組織再生的關鍵，若抑制創面血管生成，會嚴重影響創面愈合[41]。研究發現敲除Dicer、Drosha后抑制了內皮細胞毛細血管發芽、遷移和血管生成，提示miRNA參與血管生成[42]。Dicer對鼠胚胎血管生成也是必需的[43]，耗竭內皮細胞的miRNA將抑制出生后各種刺激誘導血管生成的反應，如外源性VEGF、腫瘤、肢體缺血和創面。已發現的促血管生成的miRNA有miR-17-92[44]、miR-126[45]、miR-130a[46]、miR-210[47-48]、miR-296[49]、miR-378[50]等。研究發現，miR-17-92在創面增殖階段往往表達增加，其靶基因血小板反應蛋白1（thrombospondin 1，TSP-1）及結締組織生長因子（connective tissue growth factor，CTGF）為抗血管生成因子，miR-17-92通過抑制TSP-1及CTGF，發揮促血管生成作用。有報道[45]miR-126能促進血管內皮細胞對VEGF的反應性，在對斑馬魚的研究中發現，敲除miR-126后導致胚胎發育過程中血管完整性喪失，出血增加。其靶基因Spred1及PIK3R2能抑制VEGF的表達，miR-126通過抑制Spred1及PIK3R2 實現調節血管完整性和血管生成的作用。已發現GAX、HOXA5基因有抑制血管內皮細胞的血管生成作用，而miR-130a通過抑制GAX、HOXA5基因表達，從而促進血管內皮細胞發揮血管生成作用。另有研究發現[47-48]當血管內皮細胞暴露于缺氧環境下，miR-210的表達逐漸增加，其通過抑制靶基因EFNA3促進基底膜毛細管樣結構的形成及內皮細胞遷移；相反，拮抗miR-210則抑制血管內皮細胞生長及誘導細胞凋亡。炎癥環境下生長因子能誘導miR-296顯著升高，其通過抑制靶基因HGS降低了生長因子受體VEGFR-2和PDGFR-β的降解，最終血管生成增加。另外miR-378通過抑制靶基因Fus-1、Sufu的表達促進血管生成。抑制血管生成的miRNA有miR-92a[51-52]、miR-17[53]、miR-15b、miR-16、miR-20a[54]、miR-221、miR-222[55]、miR-320[56]等。miR-92a主要表達于人內皮細胞，在心肌梗死小鼠模型中，內皮細胞過表達miR-92a，通過抑制整合素α5的表達能阻斷血管發生；相反，抑制miR-92a能促進血管生長和損傷組織的功能恢復。有報道[53]創面局部缺血能上調miR-17，通過抑制靶基因Janus Kinase1，從而抑制血管內皮細胞芽的形成，最終血管數量減少。同樣，缺氧條件下，miR-15b、miR-16、miR-20a表達上調，能直接抑制VEGF的表達，從而減少血管生成。研究報道[56]miR-320表達于微血管內皮細胞，通過抑制促血管生成作用的IGF-1表達，影響血管內皮細胞的增殖與遷移，血管生成減少。miR-221、miR-222亦表達于血管內皮細胞，通過抑制血管生成因子c-kit的表達來控制內皮細胞形成新的毛細血管。
增殖階段另一個重要特征是表皮細胞再生，表現為創面邊緣角質形成細胞的遷移和增殖[57]。沉默SHIP2和增強AKT信號能加速角質形成細胞遷移，miR-205通過抑制SHIP2的轉錄促進角質形成細胞遷移，并拮抗角質形成細胞凋亡，有利于上皮的穩定及創面愈合；拮抗miR-205后，可使創面的絲狀肌動蛋白減少，細胞黏附力增加，焦點接觸增強，從而創面愈合延遲[58]。而miR-205在體內受miR-184的制約，miR-184能拮抗miR-205的抗SHIP2能力，從而使角質形成細胞凋亡、死亡增加[59]。miR-210也通過調控角質形成細胞的增殖影響創面閉合，Biswas等[60]研究發現miR-210在體內缺血性創面中表達上調，miR-210屬于對缺氧敏感的miRNA，而大多數慢性創面屬缺血缺氧性創面，在HIF-1α的刺激下miR-210表達增加，抑制靶基因細胞周期調節蛋白E2F3的轉錄[61]，阻礙細胞從G1期進入S期，DNA合成率及細胞增殖率明顯下降，創面愈合延遲。miR-21也參與了創面愈合[62]，創面愈合過程中TGF-β1上調miR-21的表達，其通過抑制靶基因TIMP3、TIAM1從而促進角質形成細胞的遷移及創面的再上皮化。
4.3 重塑階段miRNA的作用
膠原沉積是重塑階段的一個主要特征。在纖維增生性瘢痕疙瘩形成中，miRNA發揮了重要作用。哺乳動物妊娠早期階段胎兒皮膚無痕愈合[63]，而在后期轉成瘢痕愈合表型[64]，一些miRNA在兩階段之間的表達存在明顯差異，尤其是miR-29b、miR-29c和miR-192在妊娠后期顯著升高，提示參與了瘢痕愈合[65]。miR-29b和miR-29c抑制多種參與無痕愈合信號通路有關的蛋白質，包括細胞外基質蛋白、抗肝纖維化TGF-β、Smad蛋白及β-catenin蛋白[66]。miR-192通過靶向抑制Smad相互作用蛋白1以增強膠原蛋白12的表達[67]。miR-29a能在轉錄后直接抑制膠原蛋白的表達，而在正常皮膚成纖維細胞，miR-29a受控于TGF-β、PDGF-B和IL-4[68]。Kashiyama等[69]比較了瘢痕疙瘩成纖維細胞與正常成纖維細胞的miRNA表達譜，發現20個下調和7個上調的miRNA，特別是miR-196a下調最明顯，miR-196a的表達量與Ⅰ、Ⅲ型膠原水平成負相關[68]。另有研究發現miR-483-3p在創面愈合的終末階段表達上調，通過抑制靶基因MK2、MK167、YAP1的表達，抑制角質形成細胞的增殖與遷移，最終使創面再上皮化過程終止[70]。
5 展望
miRNA 在維持皮膚正常結構功能及創面再生修復過程中發揮重要作用。進一步探討其在創面再生修復不同階段與正常皮膚之間的差異表達，將有助于識別和發現特異性miRNAs，明確它們在皮膚創面愈合中的作用及其調控機制，并為治療提供靶點。鑒于部分miRNA在創面修復中的重要作用，以miRNA為靶標的基因治療可為臨床難愈性創面修復提供新方法。但值得注意的是，已發現同一個miRNA在不同細胞類型中常表現不同甚至截然相反的功能，因此對于miRNA在創面再生修復各個階段中的表達與調控作用及其多效性可能帶來的副作用等，均有待深入研究。