引用本文： 孫凱, 年爭好, 徐成, 李瑞欣, 李暉. 絲素蛋白復合膠原蛋白支架的制備及性能研究. 中國修復重建外科雜志, 2014, 28(7): 903-908. doi: 10.7507/1002-1892.20140198 復制
目前臨床上治療關節軟骨損傷主要采用自體或同種異體軟骨移植，但存在供區損傷、新形成組織綜合性能欠佳等缺陷[1]。組織工程學的快速發展為軟骨損傷修復提供了新思路[2]。目前，大量研究者致力于尋求一種具有優良孔隙、力學性能佳、生物相容性好的三維多孔支架材料。在眾多材料中，絲素蛋白和膠原蛋白作為天然生物材料是研究熱點[3]。絲素蛋白具有良好的生物相容性；膠原蛋白是骨軟骨組織的天然成分，來源于牛等動物的肌腱中，其本身結構序列中含有氨基酸和蛋白結構序列，可促進細胞黏附和蛋白表達[4]。但兩種材料單獨使用時存在以下不足：膠原蛋白力學強度不足，極易碎裂，降解速度快[4]；絲素蛋白力學強度可，但降解速度較慢[5]。本研究針對兩種支架材料各自不足，對兩種材料進行物理共混制備復合支架材料，對不同質量比的絲素/膠原復合支架進行分析，并觀察細胞在支架內部的增殖代謝，優選出最佳質量比的復合支架，探討其作為軟骨組織工程支架的可行性。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要材料、試劑、儀器
4周齡雄性Wistar大鼠2只，體重約120 g，由軍事醫學科學院動物中心提供。
L-DMEM培養基（GIBCO公司，美國）；FBS（蘭州民海生物工程有限公司）；青、鏈霉素混合液（南京凱基生物科技發展有限公司）；新鮮牛肌腱、胰蛋白酶、桑蠶絲（北京索萊寶生物科技有限公司）；大鼠干細胞分離液（中國醫學科學院生物醫學工程研究所）；MTT（上海貝博生物公司）。
78646-2826型CO2細胞培養箱（Forma Scientifis公司，美國）；倒置顯微鏡及照相系統（Olympus公司，日本）；S3000N掃描電鏡（Hitachi公司，日本）；低溫冷凍干燥儀、酶標儀（Thermo公司，美國）；Instron5865力學試驗機（Instron 公司，美國）。
1.2 復合支架制備
1.2.1 絲素蛋白制備
① 脫膠：將適量桑蠶絲置于0.5%無水碳酸鈉溶液中，90℃煮3次，30 min/次。烘箱內烘干，溶解于CaCl2·CH3CH2OH·H2O（摩爾比1∶2∶8）的三元溶液2 h，冷卻后以離心半徑15 cm、8 000 r/min離心10 min，取上清液。② 透析：將上清置入透析袋中，流動自來水透析48 h，去離子水透析24 h；③ 濃縮：40%聚乙二醇（相對分子質量20 ×103）濃縮7 h。④ 濃度測定：取培養皿洗凈后放入60℃恒溫烘箱中烘干，充分冷卻，稱重記為M0；取適量絲素蛋白溶液放入培養皿，稱重記為M1，恒溫烘箱中烘1 h，冷卻后稱重記為M2。按以下公式計算絲素蛋白溶液濃度：（M2－M0）/（M1－M0） ×100%，重復3次，取均值。
1.2.2 膠原蛋白制備
按文獻[6]方法制備膠原蛋白。取新鮮牛肌腱剝凈外膜，清除脂肪，粉碎后以0.05 mol/ L Tris緩沖液浸泡24 h，收集沉淀，加入含胃蛋白酶的醋酸溶液，收集上清；加入3.5 mol/L NaCl溶液，收集鹽析沉淀物，4℃去離子水透析5 d；同絲素蛋白濃度測定方法測定膠原蛋白濃度。
1.2.3 復合支架制備
按絲素蛋白和膠原蛋白不同質量比制備3種復合支架，分別為4∶2（A組），4∶4（B 組），4∶8（C組）。將兩種溶液充分混合，真空冷凍干燥后，無水乙醇浸泡24 h；0.5%NaOH溶液浸泡24 h，去離子水浸泡30 min，制備直徑10 mm、高10 mm的圓柱形支架，60Co滅菌后備用。
1.3 復合支架性能檢測
1.3.1 孔隙率測定
采用改良液體位移法測定支架材料孔隙率。具體步驟：選用帶有刻度的試管，加入體積為V1的無水乙醇；將干燥支架樣本切成合適大小浸入其中5 min，負壓脫氣至支架無氣泡逸出，記錄此時乙醇體積（浸沒支架）為V2；輕輕取出支架樣品，剩余乙醇體積為V3。按以下公式計算支架孔隙率：（V1－V3） /（V2－V3）×100%。每組測定3個樣本，取均值。
1.3.2 吸水膨脹率測定
每組取3個干燥支架樣本，浸于pH7.4的0.01 mol/L PBS 液中24 h至平衡。吸干表面水分稱重記為M0，干燥箱內干燥12 h后稱重記為M1，按以下公式計算吸水膨脹率：（M0－M1）/M1 ×100%，取均值。
1.3.3 力學性能檢測
于37℃每組取3個干燥支架樣本浸于pH7.4的0.01 mol/L PBS液中24 h至平衡。采用Instron5865力學試驗機進行支架壓縮力學性能測試，采用0.5 Hz正弦波形，預載荷0.1 N，最大壓縮應變10%，循環3次[7]；繪制應力-應變曲線，得出支架的彈性模量參數。
1.3.4 孔徑測定
每組取3個樣本，掃描電鏡下觀察支架微觀結構并測量支架孔徑，取均值。
1.3.5 細胞相容性檢測
采用MTT法檢測細胞在支架內的增殖情況[8]。將每組支架剪成0.5 cm × 0.5 cm大小，加入完全培養液（含10%FBS以及1%青、鏈霉素的L-DMEM培養液），37℃、5%CO2培養箱內靜置24 h。取4周齡雄性Wistar大鼠，采用密度梯度離心法制備大鼠BMSCs[7]，倒置顯微鏡下觀察細胞形態；取第3代BMSCs，以2 ×107個/mL密度接種于支架（每個支架樣品接種細胞懸液100 μL）；4 h后加入完全培養液。培養1、3、5、7、9、11、13 d后，將細胞-支架復合物移入24孔板，每孔加2 mg/mL MTT溶液2 mL，繼續培養4 h后棄去，每孔加入DMSO 2 mL，充分溶解，將溶液移至96孔板內，每孔150 μL，酶標儀檢測520 nm波長下吸光度（A）值。
1.3.6 HE染色觀察
取第3代BMSCs按2 ×107 個 / mL密度接種于3組支架（每個支架樣品接種細胞懸液100 μL），培養14 d后取出樣本，10%甲醛溶液固定，石蠟包埋，5 μm厚連續切片，行HE染色觀察。計數高倍鏡（× 400）下視野內的細胞數，取均值[9]。
1.3.7 掃描電鏡觀察
取第3代BMSCs按2 ×107 個 / mL密度接種于3組支架（每個支架樣品接種細胞懸液100 μL），培養14 d后取出樣本，4%戊二醛溶液固定，1%鋨酸4℃固定4 h，梯度乙醇脫水，臨界點干燥，金屬鍍膜后掃描電鏡下觀察細胞在支架上的分 布。
1.4 統計學方法
采用SPSS13.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 孔隙率測定
A、B、C組支架孔隙率分別為94.6% ± 1.6%、80.6% ± 1.1%、60.6% ± 1.0%，A組顯著高于B、C組，B組高于C組，差異均有統計學意義（P＜ 0.05）。
2.2 吸水膨脹率測定
A、B、C組支架吸水膨脹率分別為1 523.7% ± 186.6%、1 091.0% ± 151.6%、659.6% ± 161.4%，A組顯著高于B、C組，但A、B、C 組間比較差異均無統計學意義（F=6.67，P=0.08）。
2.3 力學性能檢測
3組復合支架冷凍干燥后質地柔韌，浸入培養液后質地變軟，具有延展性。A、B、C組支架彈性模量分別為（23.1 ± 2.5）、（25.1 ± 2.3）、（29.8 ± 2.6）kPa，組間比較差異無統計學意義（F=2.00，P=0.28），符合關節軟骨彈性模量值（4～35 kPa）[10]；應力-應變曲線示，各組支架均具有良好的黏彈性。見圖 1。
圖1
3組復合支架應力-應變曲線 ? A組 ? B組 ? C組 ? ?2.4 孔徑測定
A、B、C組支架孔徑分別為（103 ± 12）、（80 ± 15）、（60 ± 16）μm，A組高于B、C組，B組高于C組，但組間比較差異無統計學意義（F=2.22，P=0.26）。見圖 2。
2.5 細胞相容性檢測
2.5.1 BMSCs形態學觀察
原代BMSCs分離后呈圓形，24 h后部分細胞貼壁，呈長梭形或多角形；10 d出現集落樣增殖，可達80%～90%融合。傳代后細胞生長明顯加速，生長活躍，呈典型的漩渦樣生長。傳至第3代可獲得高純度BMSCs。見圖 3。
2.5.2 MTT檢測細胞增殖
MTT檢測示，1 d時A組細胞數高于B、C組，5 d時3組均出現A值稍降低；7、9、11、13 d時，A組細胞數明顯高于B、C組，B組高于C組，差異均有統計學意義（P＜ 0.05）。見圖 4。
2.6 HE染色觀察
培養14 d后，鏡下見A組細胞分布均勻，細胞數量多；B、C組細胞數量少且分布不均勻。A、B、C組支架內部細胞計數分別為（400 ± 30）、（100 ± 15）、（10 ± 2）個/HP，A組明顯多于B、C組，B組多于C組，3組比較差異均有統計學意義（P＜ 0.05）。見圖 5。
圖5
3組細胞-支架復合物培養14 d HE染色觀察（× 20） A組 B組 C組 ? ?2.7 掃描電鏡觀察
培養14 d后，掃描電鏡觀察示，A組支架孔徑大小較一致，相通性好，細胞在支架內部生長良好，伸展充分；B、C組支架孔徑較小，內部結構紊亂，孔隙間連通性差，細胞在內部數量少，生長差。見圖 6。A、B、C組支架內部細胞數分別為（100 ± 10）、（40 ± 6）、（10 ± 1） 個/HP，A組明顯多于B、C組，B組多于C組，3組間比較差異均有統計學意義（P＜ 0.05）。見圖 6。
3 討論
3.1 支架材料的選擇
支架作為細胞體外培養的載體，需符合一定材料標準。在保證對細胞無損害情況下，其孔隙率、吸水膨脹率、力學性能、孔徑要滿足相應條件，并且在復合細胞時需保證細胞的代謝活性[11]。人工合成支架材料種類較多，如聚乳酸、聚羥基乙酸及二者共聚物等，具有物理機械性能較好、可調控降解時間、來源不受限制等特點，但其生物相容性明顯差于天然材料，存在細胞親和性較差、降解速度慢等缺陷，在體內長期留存易引起宿主組織炎癥及腫脹、造成宿主關節附加損害、引起免疫排斥反應后破壞支架結構等缺陷[12]。天然材料具有生物相容性好、易降解、毒副作用小、降解產物易吸收的優勢，在組織工程支架材料研究中備受青睞。目前采用的天然材料主要包括絲素蛋白、膠原蛋白、殼聚糖等。作為一種生物相容性良好的纖維蛋白，絲素蛋白在組織工程中的應用日益深入，絲素蛋白可提供較好強度（可高達4.8 GPa）、足夠韌性（高達35%）、彈性和環境穩定性[13-14]。然而在材料內部長入的細胞較少，究其原因為材料內部無足夠空間，細胞無法長入[15]。膠原蛋白為軟骨基質的主要成分，在人體內含量豐富，以膠原蛋白為原料的支架有利于細胞黏附并對細胞起支持保護作用，且有利于外源細胞的導入。膠原蛋白支架的缺點是降解速度快、新生組織塑形欠佳、機械應力強度不足，目前常與其他材料復合使用。殼聚糖屬多糖類，有良好的生物相容性和降解性，但部分學者認為殼聚糖是細胞外基質分泌的誘導劑，使軟骨細胞易于黏附在殼聚糖表面，而殼聚糖本身不起支架作用，而且在與其他材料復合時，制備過程中需使用交聯劑，對細胞造成較大損傷[16]。絲素/膠原復合支架是近幾年研究熱點，對兩種材料進行共混，提高了支架生物相容性，更有利于細胞在支架內部的生長。既往研究未明確兩者質量比，更未對不同質量比支架進行比較研究。本研究制備3種不同質量比復合支架，考察不同質量比支架綜合性能差異，為軟骨組織工程支架材料研究提供參考。
3.2 復合支架制備方法
復合支架采用多孔聚合物方法制備，目前常用的有物理和化學交聯法、相分離法、快速成型技術、低溫干燥法等[17]。本研究采用冷凍干燥法，是將經冷凍的樣品置于高真空中，升華除去樣品中的水分。冷凍干燥技術是一種制造具有多孔結構的簡便技術，利用冰晶升華形成孔隙，可避免應力開裂，并可通過控制冰晶成型達到對孔隙結構的控制，制備出微觀孔隙結構、氣孔率可調范圍大、形狀復雜、孔隙率較高、力學性能好的材料，是一種快速、經濟及環保的制備方法[18]。
3.3 支架性能檢測及對比分析
絲素/膠原復合支架中，如何通過調節絲素蛋白和膠原蛋白比例獲得理想的細胞載體仍是目前需解決的問題之一[19]。軟骨組織工程支架材料要求支架孔隙率在90%以上，良好的孔隙率有利于營養物質滲入和代謝廢物排出[20]；孔隙率較低，會導致細胞長入和營養物質滲入困難。吸水膨脹率是指支架在浸潤培養液時，最大程度吸收培養液并黏附細胞的能力[21]。本研究中A組支架孔隙率、吸水膨脹率、孔徑最大，有利于營養物質滲入、吸收培養液、早期黏附細胞，并可為細胞生長提供更加充分的營養物質，利于細胞良好生長，主要原因是在制備過程中濃縮后溶液黏度提高，限制了冷凍時冰粒子的形成數量所致[22-24]。支架力學性能是支架濕態下，在循環載荷下保持力學穩定的狀態[7]，本研究應力-應變曲線顯示各組支架均具有良好的黏彈性，在一定壓應變情況下支架彈性模量變化均較小，傳遞力學的同時發揮了支撐作用[25-27]。MTT檢測示，1 d時A組細胞數量比B、C組高，表明A組支架吸水膨脹率有利于細胞早期黏附[28]；5 d時3組均出現A值降低，主要是部分細胞對支架內部環境不適應發生凋亡[28]；7、9、11、13 d時，A組細胞增殖活躍，細胞數量明顯高于B、C組，主要是由于A組支架有優良的孔隙率及吸水膨脹率且孔徑適中。HE染色結果表明A組支架內部結構更有利于細胞長入，這可能與孔徑、吸水膨脹率及孔隙率大小有關；掃描電鏡結果驗證了HE結果，A組支架內部可觀察到細胞數量明顯多于B、C組，且A組支架孔徑大小較為一致，各孔隙間相通性好，而B、C組內部結構混亂，孔隙大小不一，孔徑較小，連通性差。
綜上述，本研究利用絲素蛋白及膠原蛋白兩種材料的優勢，采用冷凍干燥技術，獲得具有高度連通性的多孔支架，利于細胞的生長，對復合支架的相關性能進行了初步研究，以絲素蛋白∶膠原蛋白質量比為4∶2時綜合性能最佳，其孔隙率、吸水膨脹率、力學性能、孔徑及細胞增殖性均為最佳，表明該質量比的復合支架是適合細胞生長的良好材料，符合軟骨組織工程要求，為軟骨組織工程支架材料研究拓展了方向。有關此復合支架的體內軟骨組織修復動物實驗有待進一步研 究。
目前臨床上治療關節軟骨損傷主要采用自體或同種異體軟骨移植，但存在供區損傷、新形成組織綜合性能欠佳等缺陷[1]。組織工程學的快速發展為軟骨損傷修復提供了新思路[2]。目前，大量研究者致力于尋求一種具有優良孔隙、力學性能佳、生物相容性好的三維多孔支架材料。在眾多材料中，絲素蛋白和膠原蛋白作為天然生物材料是研究熱點[3]。絲素蛋白具有良好的生物相容性；膠原蛋白是骨軟骨組織的天然成分，來源于牛等動物的肌腱中，其本身結構序列中含有氨基酸和蛋白結構序列，可促進細胞黏附和蛋白表達[4]。但兩種材料單獨使用時存在以下不足：膠原蛋白力學強度不足，極易碎裂，降解速度快[4]；絲素蛋白力學強度可，但降解速度較慢[5]。本研究針對兩種支架材料各自不足，對兩種材料進行物理共混制備復合支架材料，對不同質量比的絲素/膠原復合支架進行分析，并觀察細胞在支架內部的增殖代謝，優選出最佳質量比的復合支架，探討其作為軟骨組織工程支架的可行性。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要材料、試劑、儀器
4周齡雄性Wistar大鼠2只，體重約120 g，由軍事醫學科學院動物中心提供。
L-DMEM培養基（GIBCO公司，美國）；FBS（蘭州民海生物工程有限公司）；青、鏈霉素混合液（南京凱基生物科技發展有限公司）；新鮮牛肌腱、胰蛋白酶、桑蠶絲（北京索萊寶生物科技有限公司）；大鼠干細胞分離液（中國醫學科學院生物醫學工程研究所）；MTT（上海貝博生物公司）。
78646-2826型CO2細胞培養箱（Forma Scientifis公司，美國）；倒置顯微鏡及照相系統（Olympus公司，日本）；S3000N掃描電鏡（Hitachi公司，日本）；低溫冷凍干燥儀、酶標儀（Thermo公司，美國）；Instron5865力學試驗機（Instron 公司，美國）。
1.2 復合支架制備
1.2.1 絲素蛋白制備
① 脫膠：將適量桑蠶絲置于0.5%無水碳酸鈉溶液中，90℃煮3次，30 min/次。烘箱內烘干，溶解于CaCl2·CH3CH2OH·H2O（摩爾比1∶2∶8）的三元溶液2 h，冷卻后以離心半徑15 cm、8 000 r/min離心10 min，取上清液。② 透析：將上清置入透析袋中，流動自來水透析48 h，去離子水透析24 h；③ 濃縮：40%聚乙二醇（相對分子質量20 ×103）濃縮7 h。④ 濃度測定：取培養皿洗凈后放入60℃恒溫烘箱中烘干，充分冷卻，稱重記為M0；取適量絲素蛋白溶液放入培養皿，稱重記為M1，恒溫烘箱中烘1 h，冷卻后稱重記為M2。按以下公式計算絲素蛋白溶液濃度：（M2－M0）/（M1－M0） ×100%，重復3次，取均值。
1.2.2 膠原蛋白制備
按文獻[6]方法制備膠原蛋白。取新鮮牛肌腱剝凈外膜，清除脂肪，粉碎后以0.05 mol/ L Tris緩沖液浸泡24 h，收集沉淀，加入含胃蛋白酶的醋酸溶液，收集上清；加入3.5 mol/L NaCl溶液，收集鹽析沉淀物，4℃去離子水透析5 d；同絲素蛋白濃度測定方法測定膠原蛋白濃度。
1.2.3 復合支架制備
按絲素蛋白和膠原蛋白不同質量比制備3種復合支架，分別為4∶2（A組），4∶4（B 組），4∶8（C組）。將兩種溶液充分混合，真空冷凍干燥后，無水乙醇浸泡24 h；0.5%NaOH溶液浸泡24 h，去離子水浸泡30 min，制備直徑10 mm、高10 mm的圓柱形支架，60Co滅菌后備用。
1.3 復合支架性能檢測
1.3.1 孔隙率測定
采用改良液體位移法測定支架材料孔隙率。具體步驟：選用帶有刻度的試管，加入體積為V1的無水乙醇；將干燥支架樣本切成合適大小浸入其中5 min，負壓脫氣至支架無氣泡逸出，記錄此時乙醇體積（浸沒支架）為V2；輕輕取出支架樣品，剩余乙醇體積為V3。按以下公式計算支架孔隙率：（V1－V3） /（V2－V3）×100%。每組測定3個樣本，取均值。
1.3.2 吸水膨脹率測定
每組取3個干燥支架樣本，浸于pH7.4的0.01 mol/L PBS 液中24 h至平衡。吸干表面水分稱重記為M0，干燥箱內干燥12 h后稱重記為M1，按以下公式計算吸水膨脹率：（M0－M1）/M1 ×100%，取均值。
1.3.3 力學性能檢測
于37℃每組取3個干燥支架樣本浸于pH7.4的0.01 mol/L PBS液中24 h至平衡。采用Instron5865力學試驗機進行支架壓縮力學性能測試，采用0.5 Hz正弦波形，預載荷0.1 N，最大壓縮應變10%，循環3次[7]；繪制應力-應變曲線，得出支架的彈性模量參數。
1.3.4 孔徑測定
每組取3個樣本，掃描電鏡下觀察支架微觀結構并測量支架孔徑，取均值。
1.3.5 細胞相容性檢測
采用MTT法檢測細胞在支架內的增殖情況[8]。將每組支架剪成0.5 cm × 0.5 cm大小，加入完全培養液（含10%FBS以及1%青、鏈霉素的L-DMEM培養液），37℃、5%CO2培養箱內靜置24 h。取4周齡雄性Wistar大鼠，采用密度梯度離心法制備大鼠BMSCs[7]，倒置顯微鏡下觀察細胞形態；取第3代BMSCs，以2 ×107個/mL密度接種于支架（每個支架樣品接種細胞懸液100 μL）；4 h后加入完全培養液。培養1、3、5、7、9、11、13 d后，將細胞-支架復合物移入24孔板，每孔加2 mg/mL MTT溶液2 mL，繼續培養4 h后棄去，每孔加入DMSO 2 mL，充分溶解，將溶液移至96孔板內，每孔150 μL，酶標儀檢測520 nm波長下吸光度（A）值。
1.3.6 HE染色觀察
取第3代BMSCs按2 ×107 個 / mL密度接種于3組支架（每個支架樣品接種細胞懸液100 μL），培養14 d后取出樣本，10%甲醛溶液固定，石蠟包埋，5 μm厚連續切片，行HE染色觀察。計數高倍鏡（× 400）下視野內的細胞數，取均值[9]。
1.3.7 掃描電鏡觀察
取第3代BMSCs按2 ×107 個 / mL密度接種于3組支架（每個支架樣品接種細胞懸液100 μL），培養14 d后取出樣本，4%戊二醛溶液固定，1%鋨酸4℃固定4 h，梯度乙醇脫水，臨界點干燥，金屬鍍膜后掃描電鏡下觀察細胞在支架上的分 布。
1.4 統計學方法
采用SPSS13.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 孔隙率測定
A、B、C組支架孔隙率分別為94.6% ± 1.6%、80.6% ± 1.1%、60.6% ± 1.0%，A組顯著高于B、C組，B組高于C組，差異均有統計學意義（P＜ 0.05）。
2.2 吸水膨脹率測定
A、B、C組支架吸水膨脹率分別為1 523.7% ± 186.6%、1 091.0% ± 151.6%、659.6% ± 161.4%，A組顯著高于B、C組，但A、B、C 組間比較差異均無統計學意義（F=6.67，P=0.08）。
2.3 力學性能檢測
3組復合支架冷凍干燥后質地柔韌，浸入培養液后質地變軟，具有延展性。A、B、C組支架彈性模量分別為（23.1 ± 2.5）、（25.1 ± 2.3）、（29.8 ± 2.6）kPa，組間比較差異無統計學意義（F=2.00，P=0.28），符合關節軟骨彈性模量值（4～35 kPa）[10]；應力-應變曲線示，各組支架均具有良好的黏彈性。見圖 1。
圖1
3組復合支架應力-應變曲線 ? A組 ? B組 ? C組 ? ?2.4 孔徑測定
A、B、C組支架孔徑分別為（103 ± 12）、（80 ± 15）、（60 ± 16）μm，A組高于B、C組，B組高于C組，但組間比較差異無統計學意義（F=2.22，P=0.26）。見圖 2。
2.5 細胞相容性檢測
2.5.1 BMSCs形態學觀察
原代BMSCs分離后呈圓形，24 h后部分細胞貼壁，呈長梭形或多角形；10 d出現集落樣增殖，可達80%～90%融合。傳代后細胞生長明顯加速，生長活躍，呈典型的漩渦樣生長。傳至第3代可獲得高純度BMSCs。見圖 3。
2.5.2 MTT檢測細胞增殖
MTT檢測示，1 d時A組細胞數高于B、C組，5 d時3組均出現A值稍降低；7、9、11、13 d時，A組細胞數明顯高于B、C組，B組高于C組，差異均有統計學意義（P＜ 0.05）。見圖 4。
2.6 HE染色觀察
培養14 d后，鏡下見A組細胞分布均勻，細胞數量多；B、C組細胞數量少且分布不均勻。A、B、C組支架內部細胞計數分別為（400 ± 30）、（100 ± 15）、（10 ± 2）個/HP，A組明顯多于B、C組，B組多于C組，3組比較差異均有統計學意義（P＜ 0.05）。見圖 5。
圖5
3組細胞-支架復合物培養14 d HE染色觀察（× 20） A組 B組 C組 ? ?2.7 掃描電鏡觀察
培養14 d后，掃描電鏡觀察示，A組支架孔徑大小較一致，相通性好，細胞在支架內部生長良好，伸展充分；B、C組支架孔徑較小，內部結構紊亂，孔隙間連通性差，細胞在內部數量少，生長差。見圖 6。A、B、C組支架內部細胞數分別為（100 ± 10）、（40 ± 6）、（10 ± 1） 個/HP，A組明顯多于B、C組，B組多于C組，3組間比較差異均有統計學意義（P＜ 0.05）。見圖 6。
3 討論
3.1 支架材料的選擇
支架作為細胞體外培養的載體，需符合一定材料標準。在保證對細胞無損害情況下，其孔隙率、吸水膨脹率、力學性能、孔徑要滿足相應條件，并且在復合細胞時需保證細胞的代謝活性[11]。人工合成支架材料種類較多，如聚乳酸、聚羥基乙酸及二者共聚物等，具有物理機械性能較好、可調控降解時間、來源不受限制等特點，但其生物相容性明顯差于天然材料，存在細胞親和性較差、降解速度慢等缺陷，在體內長期留存易引起宿主組織炎癥及腫脹、造成宿主關節附加損害、引起免疫排斥反應后破壞支架結構等缺陷[12]。天然材料具有生物相容性好、易降解、毒副作用小、降解產物易吸收的優勢，在組織工程支架材料研究中備受青睞。目前采用的天然材料主要包括絲素蛋白、膠原蛋白、殼聚糖等。作為一種生物相容性良好的纖維蛋白，絲素蛋白在組織工程中的應用日益深入，絲素蛋白可提供較好強度（可高達4.8 GPa）、足夠韌性（高達35%）、彈性和環境穩定性[13-14]。然而在材料內部長入的細胞較少，究其原因為材料內部無足夠空間，細胞無法長入[15]。膠原蛋白為軟骨基質的主要成分，在人體內含量豐富，以膠原蛋白為原料的支架有利于細胞黏附并對細胞起支持保護作用，且有利于外源細胞的導入。膠原蛋白支架的缺點是降解速度快、新生組織塑形欠佳、機械應力強度不足，目前常與其他材料復合使用。殼聚糖屬多糖類，有良好的生物相容性和降解性，但部分學者認為殼聚糖是細胞外基質分泌的誘導劑，使軟骨細胞易于黏附在殼聚糖表面，而殼聚糖本身不起支架作用，而且在與其他材料復合時，制備過程中需使用交聯劑，對細胞造成較大損傷[16]。絲素/膠原復合支架是近幾年研究熱點，對兩種材料進行共混，提高了支架生物相容性，更有利于細胞在支架內部的生長。既往研究未明確兩者質量比，更未對不同質量比支架進行比較研究。本研究制備3種不同質量比復合支架，考察不同質量比支架綜合性能差異，為軟骨組織工程支架材料研究提供參考。
3.2 復合支架制備方法
復合支架采用多孔聚合物方法制備，目前常用的有物理和化學交聯法、相分離法、快速成型技術、低溫干燥法等[17]。本研究采用冷凍干燥法，是將經冷凍的樣品置于高真空中，升華除去樣品中的水分。冷凍干燥技術是一種制造具有多孔結構的簡便技術，利用冰晶升華形成孔隙，可避免應力開裂，并可通過控制冰晶成型達到對孔隙結構的控制，制備出微觀孔隙結構、氣孔率可調范圍大、形狀復雜、孔隙率較高、力學性能好的材料，是一種快速、經濟及環保的制備方法[18]。
3.3 支架性能檢測及對比分析
絲素/膠原復合支架中，如何通過調節絲素蛋白和膠原蛋白比例獲得理想的細胞載體仍是目前需解決的問題之一[19]。軟骨組織工程支架材料要求支架孔隙率在90%以上，良好的孔隙率有利于營養物質滲入和代謝廢物排出[20]；孔隙率較低，會導致細胞長入和營養物質滲入困難。吸水膨脹率是指支架在浸潤培養液時，最大程度吸收培養液并黏附細胞的能力[21]。本研究中A組支架孔隙率、吸水膨脹率、孔徑最大，有利于營養物質滲入、吸收培養液、早期黏附細胞，并可為細胞生長提供更加充分的營養物質，利于細胞良好生長，主要原因是在制備過程中濃縮后溶液黏度提高，限制了冷凍時冰粒子的形成數量所致[22-24]。支架力學性能是支架濕態下，在循環載荷下保持力學穩定的狀態[7]，本研究應力-應變曲線顯示各組支架均具有良好的黏彈性，在一定壓應變情況下支架彈性模量變化均較小，傳遞力學的同時發揮了支撐作用[25-27]。MTT檢測示，1 d時A組細胞數量比B、C組高，表明A組支架吸水膨脹率有利于細胞早期黏附[28]；5 d時3組均出現A值降低，主要是部分細胞對支架內部環境不適應發生凋亡[28]；7、9、11、13 d時，A組細胞增殖活躍，細胞數量明顯高于B、C組，主要是由于A組支架有優良的孔隙率及吸水膨脹率且孔徑適中。HE染色結果表明A組支架內部結構更有利于細胞長入，這可能與孔徑、吸水膨脹率及孔隙率大小有關；掃描電鏡結果驗證了HE結果，A組支架內部可觀察到細胞數量明顯多于B、C組，且A組支架孔徑大小較為一致，各孔隙間相通性好，而B、C組內部結構混亂，孔隙大小不一，孔徑較小，連通性差。
綜上述，本研究利用絲素蛋白及膠原蛋白兩種材料的優勢，采用冷凍干燥技術，獲得具有高度連通性的多孔支架，利于細胞的生長，對復合支架的相關性能進行了初步研究，以絲素蛋白∶膠原蛋白質量比為4∶2時綜合性能最佳，其孔隙率、吸水膨脹率、力學性能、孔徑及細胞增殖性均為最佳，表明該質量比的復合支架是適合細胞生長的良好材料，符合軟骨組織工程要求，為軟骨組織工程支架材料研究拓展了方向。有關此復合支架的體內軟骨組織修復動物實驗有待進一步研 究。
