引用本文： 馬超, 陳偉, 賈維勝, 郭宇, 葉鋼. 膠原生物膜支架材料促進膀胱再生的組織學初步研究. 中國修復重建外科雜志, 2014, 28(6): 773-776. doi: 10.7507/1002-1892.20140171 復制
對于因先天性疾病、損傷、炎癥、感染或腫瘤等原因導致的膀胱缺損，常需行膀胱重建術以恢復其結構和功能[1]。目前，胃腸道膀胱成形術是膀胱重建的金標準[2]，但胃腸道作為膀胱重建材料存在許多黏膜并發癥，如酸堿代謝紊亂、黏液分泌、結石、感染、甚至惡變等[3]。因此，探索新的膀胱重建材料具有重要臨床意義。
膠原是人體內含量最豐富的蛋白質，是細胞外基質的主要組成成分[4]。在器官發育和創傷修復過程中，膠原作為細胞生長的依附與支架，能誘導細胞黏附、遷移、增殖和分化[5-6]。另外，移植物的免疫原性主要由表達人類組織相容性抗原的細胞所引起，而膠原作為細胞外基質，抗原性極小，且具有生物可降解性[7]。在皮膚組織工程研究中，膠原作為支架材料已得到廣泛應用[8]。膀胱壁的構成、功能及所在環境與皮膚完全不同，鑒于此，本研究應用膠原生物膜作為支架材料，重建大鼠膀胱，初步從組織學方面觀察其能否促進膀胱再生，為探索新的膀胱重建材料提供參考。
1 材料與方法
1.1 實驗動物與主要試劑、儀器
健康成年雄性SD大鼠12只，體重300～350 g，購自中國科學院遺傳發育所實驗動物中心。膠原生物膜購自山東正海生物有限公司，分割成1 cm × 1 cm × 1 mm大小，以60Co輻照（劑量12 Gy）消毒、備用。兔抗α 平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscleactin，α-SMA）多克隆抗體、兔抗血管假性血友病因子（von Willebrand factor，vWF）多克隆抗體 （Santa Cruz公司，美國）；DAB顯色試劑盒、S-P法免疫組織化學檢測試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司）。Image-Pro Plus軟件（Media Cybernetics 公司，美國）。
1.2 實驗方法及分組
將12只SD大鼠隨機分為膠原生物膜組（實驗組）及假手術組（對照組），每組6只。兩組大鼠以1%戊巴比妥鈉（30 mg/kg）腹腔注射麻醉，腹部向上、四肢固定于手術臺上。作下腹部正中切口，顯露膀胱。實驗組行上半膀胱切除術，用6-0可吸收線將膠原生物膜與膀胱切緣漿肌層連續縫合重建膀胱，并用1-0絲線在吻合口前、后、左、右（漿膜面）各縫1針作為標記；經尿道插管向膀胱內注入生理鹽水，沖洗膀胱，并檢查吻合口，明確無漏尿后關閉切口（圖 1）。對照組膀胱僅行等量翻動后關閉切口。兩組術后3 d內每天肌肉注射慶大霉素（1.5 mg/kg）預防感染。
圖1
實驗組大鼠膀胱重建手術示意圖 ? 暴露膀胱 ? 行上半膀胱切除術 ? 采用膠原生物膜重建膀胱 ? ?1.3 觀測指標
1.3.1 一般情況
術后觀察兩組大鼠存活及切口愈合情況，記錄實驗組有無尿漏、感染發生。
1.3.2 組織學觀察
術后30 d兩組大鼠用脊椎脫臼法處死，以原切口入路取膀胱，置于4%多聚甲醛固定24 h，石蠟包埋，連續切片，片厚5 μm。取部分切片行HE、Masson 染色，鏡下觀察膀胱修復再生情況。
1.3.3 免疫組織化學染色觀察
取剩余切片按照S-P法免疫組織化學檢測試劑盒說明書，檢測α-SMA（1∶100）、vWF（1∶800）的表達。鏡下觀察α-SMA及 vWF染色情況，并采用Image-Pro Plus軟件計算α-SMA染色陽性面積比和血管數。100倍鏡下，每張切片隨機取6 個視野，α-SMA染色陽性面積比＝α-SMA染色陽性面積/視野總面積×100%，取均值；200倍鏡下，每張切片隨機取6 個視野計數血管數，取均值。
1.4 統計學方法
采用SPSS13.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 一般情況
兩組大鼠均存活至實驗完成，切口愈合良好。實驗組大鼠無尿漏、感染發生。
2.2 組織學觀察
HE染色示，實驗組膠原生物膜黏膜面已基本被尿路上皮細胞覆蓋，肌層可見少量平滑肌細胞，無炎性細胞浸潤，僅呈肌肉樣改變；對照組膀胱3層結構明顯，排列規則，無炎性細胞浸潤。見圖 2。Masson染色示，實驗組可見大部分膠原生物膜已降解吸收，再生平滑肌中夾雜散在未降解膠原纖維；對照組僅見正常存在于膀胱黏膜下的膠原纖維。見圖 3。
2.3 免疫組織化學染色觀察
α-SMA免疫組織化學染色示，實驗組可見肌纖維沿膠原生物膜長入，但未形成膀胱肌層結構，膀胱壁平滑肌再生不良；對照組可見內縱、中環、外縱3層平滑肌結構。見圖 4。實驗組α-SMA染色陽性面積比為6.49% ± 2.14%，顯著低于對照組的52.42% ± 1.78%，比較差異有統計學意義（t=40.40，P=0.00）。
vWF免疫組織化學染色示，實驗組膠原生物膜內有新生血管，但與對照組相比血管數較少。見圖 5。實驗組血管數為（4.83 ± 0.75）個，顯著低于對照組的（14.83 ± 1.17）個，比較差異有統計學意義（t=17.62，P=0.00）。
3 討論
理想的生物支架材料應具備以下特點：① 良好的組織相容性，在體內不會引起免疫排斥反應；② 適宜的生物可降解性和降解速率，降解產物可被人體吸收，不產生炎性反應；③ 具有一定可塑性和三維空間結構，可誘導細胞浸潤生長和血管長入；④ 具有良好的表面活性，促進細胞黏附、增殖及分化，并提供良好的細胞外微環境[9-12]。
目前，膀胱組織工程主要采用小腸黏膜下層或膀胱脫細胞基質進行修復，修復效果有限[3]。膠原是人體中參與創傷愈合的主要結構蛋白，其來源豐富。膠原本身包含的細胞黏附信號肽序列精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸可引導細胞對其特異性識別，有助于保持多種細胞的表型及活性[6, 13]。因此，膠原制備的支架材料具有優越的生物相容性、良好的生物降解性和低抗原性。同時，臨床上許多基于膠原的治療方法已得到美國食品藥品監督管理局（FDA）認證，包括傷口敷料和人工皮膚等[14]。既往已有將膠原生物膜用于修復膽管[15]、子宮[16]、腹壁[17]等的動物實驗，并取得良好效果。本實驗采用的膠原生物膜是通過脫細胞方法獲取的牛皮膚膠原，具有疏松多孔結構，孔徑介于40～200 μm之間，孔隙率＞ 80%，具有良好細胞相容性及力學性能[18]，適合細胞長入[19]。
本實驗采用膠原生物膜重建大鼠膀胱，術后30 d HE染色示大量細胞遷移至材料中央，尿路上皮細胞完全再生，而肌層再生不明顯，僅呈現肌肉樣改變，且雜亂無序；Masson染色也顯示大部分膠原生物膜被降解吸收，剩余部分僅存在于材料中心部分。提示膠原生物膜具有良好的組織相容性以及生物可降解性，膠原支架的孔隙有利于鄰近組織細胞的爬行和生長，但是自體細胞在單純膠原材料上浸入生長深度有限，導致中心部位仍有一定膠原纖維未降解。
血管化是創傷修復和組織再生過程中的一個重要環節，新生血管能為損傷部位持續提供營養物質，加快組織修復 [20-21]。本實驗中，實驗組再生膀胱壁中可見到明顯血管形成，但血管數量顯著少于對照組。提示膠原雖能促進血管新生，但其血管化仍較局限，下一步研究可從種子細胞、生長因子入手力求更好的血管化。
膀胱平滑肌在維持正常膀胱排尿功能中發揮著重要作用，此外還可調節膀胱內壓，使膀胱內壓隨著膀胱容量的增長而不發生明顯增加[22-23]。本實驗通過α-SMA免疫組織化學染色來檢測膀胱平滑肌再生效果。結果表明，與對照組比較，實驗組平滑肌細胞在膠原生物膜支架上的生長有限。提示單純使用膠原支架材料進行膀胱重建，其平滑肌再生修復能力有限。
綜上述，膠原生物膜作為一種生物支架材料用于組織工程膀胱的構建，展示出了較好的生物相容性，具有良好應用前景。但采用單純膠原生物膜進行膀胱重建，血管及肌肉再生均欠佳，需要進一步聯合細胞或生長因子進行研究。
對于因先天性疾病、損傷、炎癥、感染或腫瘤等原因導致的膀胱缺損，常需行膀胱重建術以恢復其結構和功能[1]。目前，胃腸道膀胱成形術是膀胱重建的金標準[2]，但胃腸道作為膀胱重建材料存在許多黏膜并發癥，如酸堿代謝紊亂、黏液分泌、結石、感染、甚至惡變等[3]。因此，探索新的膀胱重建材料具有重要臨床意義。
膠原是人體內含量最豐富的蛋白質，是細胞外基質的主要組成成分[4]。在器官發育和創傷修復過程中，膠原作為細胞生長的依附與支架，能誘導細胞黏附、遷移、增殖和分化[5-6]。另外，移植物的免疫原性主要由表達人類組織相容性抗原的細胞所引起，而膠原作為細胞外基質，抗原性極小，且具有生物可降解性[7]。在皮膚組織工程研究中，膠原作為支架材料已得到廣泛應用[8]。膀胱壁的構成、功能及所在環境與皮膚完全不同，鑒于此，本研究應用膠原生物膜作為支架材料，重建大鼠膀胱，初步從組織學方面觀察其能否促進膀胱再生，為探索新的膀胱重建材料提供參考。
1 材料與方法
1.1 實驗動物與主要試劑、儀器
健康成年雄性SD大鼠12只，體重300～350 g，購自中國科學院遺傳發育所實驗動物中心。膠原生物膜購自山東正海生物有限公司，分割成1 cm × 1 cm × 1 mm大小，以60Co輻照（劑量12 Gy）消毒、備用。兔抗α 平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscleactin，α-SMA）多克隆抗體、兔抗血管假性血友病因子（von Willebrand factor，vWF）多克隆抗體 （Santa Cruz公司，美國）；DAB顯色試劑盒、S-P法免疫組織化學檢測試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司）。Image-Pro Plus軟件（Media Cybernetics 公司，美國）。
1.2 實驗方法及分組
將12只SD大鼠隨機分為膠原生物膜組（實驗組）及假手術組（對照組），每組6只。兩組大鼠以1%戊巴比妥鈉（30 mg/kg）腹腔注射麻醉，腹部向上、四肢固定于手術臺上。作下腹部正中切口，顯露膀胱。實驗組行上半膀胱切除術，用6-0可吸收線將膠原生物膜與膀胱切緣漿肌層連續縫合重建膀胱，并用1-0絲線在吻合口前、后、左、右（漿膜面）各縫1針作為標記；經尿道插管向膀胱內注入生理鹽水，沖洗膀胱，并檢查吻合口，明確無漏尿后關閉切口（圖 1）。對照組膀胱僅行等量翻動后關閉切口。兩組術后3 d內每天肌肉注射慶大霉素（1.5 mg/kg）預防感染。
圖1
實驗組大鼠膀胱重建手術示意圖 ? 暴露膀胱 ? 行上半膀胱切除術 ? 采用膠原生物膜重建膀胱 ? ?1.3 觀測指標
1.3.1 一般情況
術后觀察兩組大鼠存活及切口愈合情況，記錄實驗組有無尿漏、感染發生。
1.3.2 組織學觀察
術后30 d兩組大鼠用脊椎脫臼法處死，以原切口入路取膀胱，置于4%多聚甲醛固定24 h，石蠟包埋，連續切片，片厚5 μm。取部分切片行HE、Masson 染色，鏡下觀察膀胱修復再生情況。
1.3.3 免疫組織化學染色觀察
取剩余切片按照S-P法免疫組織化學檢測試劑盒說明書，檢測α-SMA（1∶100）、vWF（1∶800）的表達。鏡下觀察α-SMA及 vWF染色情況，并采用Image-Pro Plus軟件計算α-SMA染色陽性面積比和血管數。100倍鏡下，每張切片隨機取6 個視野，α-SMA染色陽性面積比＝α-SMA染色陽性面積/視野總面積×100%，取均值；200倍鏡下，每張切片隨機取6 個視野計數血管數，取均值。
1.4 統計學方法
采用SPSS13.0 統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 一般情況
兩組大鼠均存活至實驗完成，切口愈合良好。實驗組大鼠無尿漏、感染發生。
2.2 組織學觀察
HE染色示，實驗組膠原生物膜黏膜面已基本被尿路上皮細胞覆蓋，肌層可見少量平滑肌細胞，無炎性細胞浸潤，僅呈肌肉樣改變；對照組膀胱3層結構明顯，排列規則，無炎性細胞浸潤。見圖 2。Masson染色示，實驗組可見大部分膠原生物膜已降解吸收，再生平滑肌中夾雜散在未降解膠原纖維；對照組僅見正常存在于膀胱黏膜下的膠原纖維。見圖 3。
2.3 免疫組織化學染色觀察
α-SMA免疫組織化學染色示，實驗組可見肌纖維沿膠原生物膜長入，但未形成膀胱肌層結構，膀胱壁平滑肌再生不良；對照組可見內縱、中環、外縱3層平滑肌結構。見圖 4。實驗組α-SMA染色陽性面積比為6.49% ± 2.14%，顯著低于對照組的52.42% ± 1.78%，比較差異有統計學意義（t=40.40，P=0.00）。
vWF免疫組織化學染色示，實驗組膠原生物膜內有新生血管，但與對照組相比血管數較少。見圖 5。實驗組血管數為（4.83 ± 0.75）個，顯著低于對照組的（14.83 ± 1.17）個，比較差異有統計學意義（t=17.62，P=0.00）。
3 討論
理想的生物支架材料應具備以下特點：① 良好的組織相容性，在體內不會引起免疫排斥反應；② 適宜的生物可降解性和降解速率，降解產物可被人體吸收，不產生炎性反應；③ 具有一定可塑性和三維空間結構，可誘導細胞浸潤生長和血管長入；④ 具有良好的表面活性，促進細胞黏附、增殖及分化，并提供良好的細胞外微環境[9-12]。
目前，膀胱組織工程主要采用小腸黏膜下層或膀胱脫細胞基質進行修復，修復效果有限[3]。膠原是人體中參與創傷愈合的主要結構蛋白，其來源豐富。膠原本身包含的細胞黏附信號肽序列精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸可引導細胞對其特異性識別，有助于保持多種細胞的表型及活性[6, 13]。因此，膠原制備的支架材料具有優越的生物相容性、良好的生物降解性和低抗原性。同時，臨床上許多基于膠原的治療方法已得到美國食品藥品監督管理局（FDA）認證，包括傷口敷料和人工皮膚等[14]。既往已有將膠原生物膜用于修復膽管[15]、子宮[16]、腹壁[17]等的動物實驗，并取得良好效果。本實驗采用的膠原生物膜是通過脫細胞方法獲取的牛皮膚膠原，具有疏松多孔結構，孔徑介于40～200 μm之間，孔隙率＞ 80%，具有良好細胞相容性及力學性能[18]，適合細胞長入[19]。
本實驗采用膠原生物膜重建大鼠膀胱，術后30 d HE染色示大量細胞遷移至材料中央，尿路上皮細胞完全再生，而肌層再生不明顯，僅呈現肌肉樣改變，且雜亂無序；Masson染色也顯示大部分膠原生物膜被降解吸收，剩余部分僅存在于材料中心部分。提示膠原生物膜具有良好的組織相容性以及生物可降解性，膠原支架的孔隙有利于鄰近組織細胞的爬行和生長，但是自體細胞在單純膠原材料上浸入生長深度有限，導致中心部位仍有一定膠原纖維未降解。
血管化是創傷修復和組織再生過程中的一個重要環節，新生血管能為損傷部位持續提供營養物質，加快組織修復 [20-21]。本實驗中，實驗組再生膀胱壁中可見到明顯血管形成，但血管數量顯著少于對照組。提示膠原雖能促進血管新生，但其血管化仍較局限，下一步研究可從種子細胞、生長因子入手力求更好的血管化。
膀胱平滑肌在維持正常膀胱排尿功能中發揮著重要作用，此外還可調節膀胱內壓，使膀胱內壓隨著膀胱容量的增長而不發生明顯增加[22-23]。本實驗通過α-SMA免疫組織化學染色來檢測膀胱平滑肌再生效果。結果表明，與對照組比較，實驗組平滑肌細胞在膠原生物膜支架上的生長有限。提示單純使用膠原支架材料進行膀胱重建，其平滑肌再生修復能力有限。
綜上述，膠原生物膜作為一種生物支架材料用于組織工程膀胱的構建，展示出了較好的生物相容性，具有良好應用前景。但采用單純膠原生物膜進行膀胱重建，血管及肌肉再生均欠佳，需要進一步聯合細胞或生長因子進行研究。
