引用本文： 綦惠, 杰永生, 陳磊, 江建, 高新生, 孫磊. 脫細胞真皮基質制備及其生物相容性研究. 中國修復重建外科雜志, 2014, 28(6): 768-772. doi: 10.7507/1002-1892.20140170 復制
退行性病變、創傷等造成的關節軟骨缺損，會導致關節區域疼痛、關節運動障礙等后期病變，嚴重影響患者生活質量。關節軟骨是一種無血管組織，軟骨細胞主要依靠關節滑液及細胞周圍基質以無氧酵解供給營養，其自身修復能力有限[1-2]。如何促進關節軟骨自身修復并重建關節功能是臨床難題之一。隨著軟骨組織工程學的發展，制備可降解、無毒性的生物支架材料，并接種種子細胞制備組織工程軟骨修復軟骨缺損，是一種創傷小、副作用少且簡便實用的修復方法[3-6]。其中支架材料制備與種子細胞選擇是兩個關鍵問題。本實驗選用新生小牛背部皮膚，通過脫細胞、結構重塑、交聯及表面修飾等工藝，制備脫細胞真皮基質支架材料（專利號：ZL 2011 1 0099363.1）；根據既往研究[7]，選取按照3∶7比例共培養的軟骨細胞與骨髓基質細胞作為種子細胞，接種于制備的支架材料上，觀察種子細胞在支架上的黏附、增殖，檢測種子細胞Ⅱ型膠原表達情況，分析細胞在支架上軟骨表型的維持情況，為后續動物體內植入奠定理論基礎。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
清潔級新生3 d內新西蘭大白兔30只，雌雄不限；SPF級成年SD大鼠9只，雌雄不限，體重350～450 g；均購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。新生小牛背部皮膚購自河北衡水肉牛養殖場。
L929細胞由北京積水潭醫院細胞室提供。乙酸、SDS、PBS、無水乙醇、甲醛、NaCl等均為國產分析純（北京化工廠）；DMEM/F12培養基、FBS（GIBCO公司，美國）；Ⅱ型膠原酶、胰蛋白酶、SDS、PAGE、N，N’-亞甲雙丙烯酰胺（Sigma公司，美國）；Trizol（Invitrogen公司，美國）；RT-PCR試劑盒（Qiagen公司，美國）；PCR marker（北京三博遠志生物技術有限責任公司）；Tween-20（Amresco公司，美國）、Ⅱ型膠原與β-actin一抗（Santa Cruz公司，美國）；羊抗兔二抗（北京中杉金橋生物技術有限公司）；聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜（Pall公司，美國）；化學發光劑（Pierce公司，美國）。
電動取皮刀（Zimmer公司，美國）；數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；掃描電鏡（日本電子株式會社，日本）；往復式真空泵（上海益化真空設備有限公司）；真空冷凍干燥機（Virtis公司，美國）；倒置相差顯微鏡（Olympus公司，日本）；低溫高速離心機（Sigma公司，美國）；酶標儀、PCR儀（Bio-Rad公司，美國）；CO2恒溫培養箱（SHEL-LAB公司，美國）；恒壓恒流電泳儀（北京市六一儀器廠）。
1.2 脫細胞真皮基質制備及觀察
① 脫細胞處理：取新生小牛背部皮膚，脫毛、清洗，乙酸溶液浸泡溶脹2 h，使皮膚表皮、真皮和皮下組織各層有相對明顯的界線，電動取皮刀切取厚度為1～2 mm的真皮層。流水沖洗乙酸后，室溫下用0.5%SDS溶液水平振蕩脫細胞2 h，更換新的SDS溶液，再繼續作用2 h。流水沖洗過夜。蒸餾水再次沖洗20次后，冷凍干燥機中凍干。常規HE染色，觀察脫細胞效果。② 結構重塑：取脫細胞真皮基質置于0.5%胰蛋白酶溶液，室溫超聲振蕩2.5 h，冷凍干燥機中凍干。掃描電鏡觀察膠原纖維的排列及孔隙大小等物理特征。③ 交聯：結構重塑后，用甲醛作為交聯劑室溫浸泡2 h；PBS沖洗3次，流水沖洗過夜，以去除殘留的交聯劑，再用蒸餾水清洗20次后凍干。④ 表面修飾：取交聯凍干后的脫細胞真皮基質，浸泡于0.5%硫酸軟骨素溶液中，室溫超聲波振蕩1.5～2.0 h，冷凍干燥機凍干。60Co輻照消毒后備用。
1.3 檢測指標
1.3.1 材料孔隙率測定
取結構重塑前后的脫細胞真皮基質，切成 1 cm × 1 cm的小塊，置于一定體積（V1）乙醇中，循環抽真空至無氣泡逸出，材料和乙醇總體積記為V2，將含乙醇的材料移出后剩余乙醇體積記為V3，按以下公式計算孔隙率：[（V1－V3）/（V2－V3）] ×100%。比較結構重塑前后材料孔隙率的差異。
1.3.2 材料浸提液細胞毒性實驗
根據GB/T 16175-2008和GB/T 16886.5-2003/ISO 10993-5：1999規定方法，檢測材料細胞毒性。稱取2 g材料，加10 mL 含10%FBS的DMEM培養基，37℃、5%CO2培養箱中浸提48 h，制備材料浸提液并2倍稀釋后備用。復蘇L929細胞，常規傳代至第2代，用0.5%胰蛋白酶消化傳代至第3代，配制成濃度為4 ×104個/mL的細胞懸液置入96孔板，每孔100 μL。實驗分為3組，將細胞分別采用材料浸提液（實驗組）、64 g/L苯酚溶液（陽性對照組）、正常細胞培養液（陰性對照組）培養。置于37℃、5%CO2及飽和濕度條件下培養2、4、7 d后，每孔加入DMSO 150 μL，震蕩10 min；再于每孔中加入MTT（5 g/L）20 μL，37℃孵育4 h；棄上清液控干，每孔加150 μL DMSO，混勻震蕩10 min。于酶標儀上490 nm波長處測定吸光度（A）值，取均值（n=3）。按以下公式計算細胞相對增殖率（relative growth rate，RGR）：[（實驗組A值－陽性對照組A值）/（陰性對照組A值－陽性對照組A值）] ×100%。根據RGR評價材料細胞毒性，其中RGR≥100%為0級，無細胞毒性，材料合格；75%～99%為1級，極低細胞毒性，材料合格；50%～74%為2級，低細胞毒性，根據材料的性質作綜合分析；＜ 50%出現1次，即證實有細胞毒性，材料不合格。
1.3.3 皮下埋植實驗
取成年SD大鼠9只，腹腔注射10%水合氯醛（0.4 mL/100 g）麻醉，無菌條件下于脊柱兩側設計1.0 cm × 0.5 cm大小的皮瓣，蒂部位于背部中間。掀起皮瓣，將制備的脫細胞真皮基質植入皮下。術后4、8、12周沿原切口切開皮瓣，大體觀察材料與周圍組織的關系，并取材行HE染色觀察。光鏡下每張切片取5個視野，包括術區周邊4個視野（近上皮細胞側和近基質層側各2個視野）、中央1個視野；于高倍鏡（× 400倍）下計數炎性細胞，炎性細胞鏡下呈藍染、細胞核較大。
1.3.4 細胞相容性觀察
① 掃描電鏡觀察：按本課題組既往方法[7]，將新生3 d內新西蘭大白兔來源的軟骨細胞與骨髓基質細胞以3∶7比例共培養至第2代作為種子細胞，接種于制備的脫細胞真皮基質上，于37℃、5%CO2及飽和濕度條件下培養48 h，掃描電鏡觀察細胞在支架上黏附情況。
② RT-PCR檢測Ⅱ型膠原mRNA表達：實驗分為2組，其中接種于脫細胞真皮基質上進行培養的種子細胞作為實驗組，單純種子細胞作為對照組。培養2周后，行RT-PCR檢測Ⅱ型膠原mRNA表達。引物由博奧生物技術有限公司合成。引物序列：Ⅱ型膠原上游5'-ACCAAAGGGACAGAAAG-3'，下游5'-ACAGCATAACATGGGGCTTC-3'，產物長度470 bp；β-actin上游5'-AGTGCGACGTGGACATCCTTG-3'，下游5'-TGGCTCTAACAGTCCGCCTAGAGCTA-3'，產物長度302 bp。反應條件：94℃預變性2 min；94℃變性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸1 min，30個循環；72℃延伸5 min。取5 mL PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳后，用凝膠成像系統掃描照相。ScnImage 圖像分析軟件測定灰度值，以Ⅱ型膠原與β-actin灰度值的比值作為Ⅱ型膠原mRNA的相對表達量。每組6個樣本。
③ Western blot檢測Ⅱ型膠原蛋白表達：同1.3.2方法分組，取培養2周細胞按照BSA法提取總蛋白，并測定蛋白濃度。進行SDS-PAGE凝膠電泳，孵育抗體后，將蛋白轉移至PVDF膜。將膜包于塑料保鮮膜中，暗室曝光。采用ScnImage圖像分析軟件測定灰度值。每組6個樣本。
1.4 統計學方法
采用SPSS13.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示。兩組間比較采用獨立樣本t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 HE染色及掃描電鏡觀察
脫細胞后，HE染色示組織略溶脹，細胞幾乎無殘留，纖維結構完整（圖 1 a）。結構重塑后，大體觀察真皮組織呈瓷白色，蓬松，表面有肉眼可見孔隙（圖 1 b）；掃描電鏡觀察示材料纖維表面光滑、立體感強、孔隙均勻（圖 1 c）。
圖1
脫細胞真皮基質相關觀測 ? 脫細胞后HE染色觀察（× 200） ? 結構重塑后大體觀察 ? 結構重塑后掃描電鏡觀察（× 500） ? ?2.2 材料孔隙率測定
結構重塑前、后的脫細胞真皮基質孔隙率分別為72.8% ± 5.8%和85.4% ± 2.8%，差異有統計學意義（t= -4.384，P=0.005）。
2.3 材料浸提液細胞毒性實驗
培養2、4、7 d，實驗組A值均顯著高于陽性對照組，差異有統計學意義（P＜ 0.05）；與陰性對照組比較差異無統計學意義（P＞ 0.05）。見表 1。
根據A值計算培養2、4、7 d實驗組RGR分別為96.2% ± 8.8%、97.9% ± 2.5%、92.1% ± 5.9%。材料細胞毒性為1級，合格。
表1
MTT法檢測材料細胞毒性（n=3，2.4 皮下埋植實驗
HE染色示，術后4、8、12周均見組織反應輕微，無明顯出血、壞死或水腫，12周時真皮外周有輕度纖維包裹，內部未見炎性細胞、出血或壞死，組織周圍有小血管長入（圖 2）。術后4、8、12周炎性細胞數分別為（45.8 ± 10.7）、（28.2 ± 11.5）、（23.0 ± 9.9）個/HP，各時間點炎性細胞數比較差異均有統計學意義（P＜ 0.05）。
2.5 細胞相容性觀察
2.5.1 掃描電鏡觀察
種子細胞接種48 h后，大量細胞呈片層貼附于支架上，細胞形態飽滿，表面可見微絨毛和分泌現象。見圖 3。
2.5.2 RT-PCR及Western
blot檢測實驗組和對照組Ⅱ型膠原mRNA相對表達量分別為 1.381 ± 0.119 和 1.300 ± 0.105，蛋白表達量分別為 0.612 ± 0.122 和 0.672 ± 0.099 ，比較差異均無統計學意義（t=1.265，P=0.235；t=0.935，P=0.372）。見圖 4、5。
圖4
RT-PCR檢測Ⅱ型膠原mRNA表達 M：Marker 1：對照組 2：實驗組 ? ?3 討論
天然膠原是生物體結締組織的主要組成成分，具有良好的組織相容性。Chajra等[8]和Stone等[9]從毒性、無菌程度、溶血性、致熱原性等方面對膠原進行檢測，證明其是一種可移植、安全且能夠支持軟骨細胞生長的支架材料。1985年，Heck等[10]研究發現同種異體皮膚移植所發生的免疫排斥反應主要源于表皮細胞、內皮細胞和成纖維細胞等，因此只要將皮膚中的細胞成分去除，即能最大限度減弱或避免免疫排斥反應的發生。脫細胞真皮基質不僅去除了細胞成分，而且完整保留了真皮乳頭層表面的基底膜，為移植細胞的新生和擴展提供了有利支持。1995年，Livesey等[11]首先成功制備脫細胞真皮基質。此后脫細胞真皮基質作為一種新型組織工程材料，在燒傷/創傷創面以及口腔頜面皮膚修復等領域取得了良好效果[12]。但未進一步處理的脫細胞動物真皮基質存在組織相容性欠佳、孔隙率不理想等缺點，不能作為軟骨組織工程支架材料。
本實驗應用0.5%胰蛋白酶溶液對脫細胞真皮基質的膠原纖維進行結構重塑，使膠原纖維表面光滑、孔隙均勻、孔隙率較高，利于細胞長入、營養成分滲入及代謝產物排出。然后，應用甲醛作為交聯劑進行交聯，使其孔隙結構更穩定，并具備一定的立體結構和可塑性。組織相容性檢測表明，交聯后的脫細胞真皮基質組織相容性良好，炎性反應隨時間延長逐漸減弱。硫酸軟骨素可抑制彈性蛋白酶、溶酶體酶等水解酶的釋放，減少其對軟骨基質的水解破壞，還具有微弱的抗炎效果，對保護和修復關節軟骨具有重要作用。目前，硫酸軟骨素已被認為是治療骨關節炎、緩解關節不適癥狀的安全有效藥物[13-14]。因此，為使制備的脫細胞真皮基質不僅能作為種子細胞的承載物，還可促進種子細胞生長，我們應用0.5%硫酸軟骨素溶液對交聯后材料進行了表面修飾。
安全高效的種子細胞源是組織工程研究中另一關鍵因素，但至今尚無一種細胞能完全滿足軟骨組織工程對種子細胞的要求[6, 15-16]。我們既往研究表明[7]，以3∶7比例共培養的第2代軟骨細胞與骨髓基質細胞不僅具有較強的增殖能力和軟骨細胞形態，而且良好地保持了軟骨細胞的分泌特性。因此，本實驗將其接種于制備的脫細胞真皮基質支架上，共培養48 h后掃描電鏡下可觀察到大量細胞黏附于支架上，且細胞形態飽滿，細胞表面具有微絨毛，部分細胞可呈分泌狀態。為進一步分析細胞在支架上軟骨表型的維持情況，我們檢測了共培養2周后細胞Ⅱ型膠原mRNA與蛋白表達。結果表明，接種于支架上共培養的種子細胞能維持軟骨細胞表型。
綜上述，經脫細胞、結構重塑、交聯、表面修飾制備的脫細胞真皮基質，具有較高孔隙率、良好組織相容性和細胞黏附性；接種種子細胞后，細胞能較好保持軟骨細胞特性，同時具有較強的增殖和分泌能力，可作為軟骨組織工程一種理想的支架材料。但本實驗也存在不足，未對脫細胞真皮基質的生物降解性和力學特性進行檢測；僅觀測了Ⅱ型膠原表達情況，其他蛋白相關分子生物學檢測有待進一步完善。后續我們還會將該支架材料與其他支架材料進行比較，分析脫細胞真皮基質作為軟骨組織工程支架材料的優缺點，為制備技術的改進和優化提供實驗支持。
退行性病變、創傷等造成的關節軟骨缺損，會導致關節區域疼痛、關節運動障礙等后期病變，嚴重影響患者生活質量。關節軟骨是一種無血管組織，軟骨細胞主要依靠關節滑液及細胞周圍基質以無氧酵解供給營養，其自身修復能力有限[1-2]。如何促進關節軟骨自身修復并重建關節功能是臨床難題之一。隨著軟骨組織工程學的發展，制備可降解、無毒性的生物支架材料，并接種種子細胞制備組織工程軟骨修復軟骨缺損，是一種創傷小、副作用少且簡便實用的修復方法[3-6]。其中支架材料制備與種子細胞選擇是兩個關鍵問題。本實驗選用新生小牛背部皮膚，通過脫細胞、結構重塑、交聯及表面修飾等工藝，制備脫細胞真皮基質支架材料（專利號：ZL 2011 1 0099363.1）；根據既往研究[7]，選取按照3∶7比例共培養的軟骨細胞與骨髓基質細胞作為種子細胞，接種于制備的支架材料上，觀察種子細胞在支架上的黏附、增殖，檢測種子細胞Ⅱ型膠原表達情況，分析細胞在支架上軟骨表型的維持情況，為后續動物體內植入奠定理論基礎。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
清潔級新生3 d內新西蘭大白兔30只，雌雄不限；SPF級成年SD大鼠9只，雌雄不限，體重350～450 g；均購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。新生小牛背部皮膚購自河北衡水肉牛養殖場。
L929細胞由北京積水潭醫院細胞室提供。乙酸、SDS、PBS、無水乙醇、甲醛、NaCl等均為國產分析純（北京化工廠）；DMEM/F12培養基、FBS（GIBCO公司，美國）；Ⅱ型膠原酶、胰蛋白酶、SDS、PAGE、N，N’-亞甲雙丙烯酰胺（Sigma公司，美國）；Trizol（Invitrogen公司，美國）；RT-PCR試劑盒（Qiagen公司，美國）；PCR marker（北京三博遠志生物技術有限責任公司）；Tween-20（Amresco公司，美國）、Ⅱ型膠原與β-actin一抗（Santa Cruz公司，美國）；羊抗兔二抗（北京中杉金橋生物技術有限公司）；聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜（Pall公司，美國）；化學發光劑（Pierce公司，美國）。
電動取皮刀（Zimmer公司，美國）；數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；掃描電鏡（日本電子株式會社，日本）；往復式真空泵（上海益化真空設備有限公司）；真空冷凍干燥機（Virtis公司，美國）；倒置相差顯微鏡（Olympus公司，日本）；低溫高速離心機（Sigma公司，美國）；酶標儀、PCR儀（Bio-Rad公司，美國）；CO2恒溫培養箱（SHEL-LAB公司，美國）；恒壓恒流電泳儀（北京市六一儀器廠）。
1.2 脫細胞真皮基質制備及觀察
① 脫細胞處理：取新生小牛背部皮膚，脫毛、清洗，乙酸溶液浸泡溶脹2 h，使皮膚表皮、真皮和皮下組織各層有相對明顯的界線，電動取皮刀切取厚度為1～2 mm的真皮層。流水沖洗乙酸后，室溫下用0.5%SDS溶液水平振蕩脫細胞2 h，更換新的SDS溶液，再繼續作用2 h。流水沖洗過夜。蒸餾水再次沖洗20次后，冷凍干燥機中凍干。常規HE染色，觀察脫細胞效果。② 結構重塑：取脫細胞真皮基質置于0.5%胰蛋白酶溶液，室溫超聲振蕩2.5 h，冷凍干燥機中凍干。掃描電鏡觀察膠原纖維的排列及孔隙大小等物理特征。③ 交聯：結構重塑后，用甲醛作為交聯劑室溫浸泡2 h；PBS沖洗3次，流水沖洗過夜，以去除殘留的交聯劑，再用蒸餾水清洗20次后凍干。④ 表面修飾：取交聯凍干后的脫細胞真皮基質，浸泡于0.5%硫酸軟骨素溶液中，室溫超聲波振蕩1.5～2.0 h，冷凍干燥機凍干。60Co輻照消毒后備用。
1.3 檢測指標
1.3.1 材料孔隙率測定
取結構重塑前后的脫細胞真皮基質，切成 1 cm × 1 cm的小塊，置于一定體積（V1）乙醇中，循環抽真空至無氣泡逸出，材料和乙醇總體積記為V2，將含乙醇的材料移出后剩余乙醇體積記為V3，按以下公式計算孔隙率：[（V1－V3）/（V2－V3）] ×100%。比較結構重塑前后材料孔隙率的差異。
1.3.2 材料浸提液細胞毒性實驗
根據GB/T 16175-2008和GB/T 16886.5-2003/ISO 10993-5：1999規定方法，檢測材料細胞毒性。稱取2 g材料，加10 mL 含10%FBS的DMEM培養基，37℃、5%CO2培養箱中浸提48 h，制備材料浸提液并2倍稀釋后備用。復蘇L929細胞，常規傳代至第2代，用0.5%胰蛋白酶消化傳代至第3代，配制成濃度為4 ×104個/mL的細胞懸液置入96孔板，每孔100 μL。實驗分為3組，將細胞分別采用材料浸提液（實驗組）、64 g/L苯酚溶液（陽性對照組）、正常細胞培養液（陰性對照組）培養。置于37℃、5%CO2及飽和濕度條件下培養2、4、7 d后，每孔加入DMSO 150 μL，震蕩10 min；再于每孔中加入MTT（5 g/L）20 μL，37℃孵育4 h；棄上清液控干，每孔加150 μL DMSO，混勻震蕩10 min。于酶標儀上490 nm波長處測定吸光度（A）值，取均值（n=3）。按以下公式計算細胞相對增殖率（relative growth rate，RGR）：[（實驗組A值－陽性對照組A值）/（陰性對照組A值－陽性對照組A值）] ×100%。根據RGR評價材料細胞毒性，其中RGR≥100%為0級，無細胞毒性，材料合格；75%～99%為1級，極低細胞毒性，材料合格；50%～74%為2級，低細胞毒性，根據材料的性質作綜合分析；＜ 50%出現1次，即證實有細胞毒性，材料不合格。
1.3.3 皮下埋植實驗
取成年SD大鼠9只，腹腔注射10%水合氯醛（0.4 mL/100 g）麻醉，無菌條件下于脊柱兩側設計1.0 cm × 0.5 cm大小的皮瓣，蒂部位于背部中間。掀起皮瓣，將制備的脫細胞真皮基質植入皮下。術后4、8、12周沿原切口切開皮瓣，大體觀察材料與周圍組織的關系，并取材行HE染色觀察。光鏡下每張切片取5個視野，包括術區周邊4個視野（近上皮細胞側和近基質層側各2個視野）、中央1個視野；于高倍鏡（× 400倍）下計數炎性細胞，炎性細胞鏡下呈藍染、細胞核較大。
1.3.4 細胞相容性觀察
① 掃描電鏡觀察：按本課題組既往方法[7]，將新生3 d內新西蘭大白兔來源的軟骨細胞與骨髓基質細胞以3∶7比例共培養至第2代作為種子細胞，接種于制備的脫細胞真皮基質上，于37℃、5%CO2及飽和濕度條件下培養48 h，掃描電鏡觀察細胞在支架上黏附情況。
② RT-PCR檢測Ⅱ型膠原mRNA表達：實驗分為2組，其中接種于脫細胞真皮基質上進行培養的種子細胞作為實驗組，單純種子細胞作為對照組。培養2周后，行RT-PCR檢測Ⅱ型膠原mRNA表達。引物由博奧生物技術有限公司合成。引物序列：Ⅱ型膠原上游5'-ACCAAAGGGACAGAAAG-3'，下游5'-ACAGCATAACATGGGGCTTC-3'，產物長度470 bp；β-actin上游5'-AGTGCGACGTGGACATCCTTG-3'，下游5'-TGGCTCTAACAGTCCGCCTAGAGCTA-3'，產物長度302 bp。反應條件：94℃預變性2 min；94℃變性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸1 min，30個循環；72℃延伸5 min。取5 mL PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳后，用凝膠成像系統掃描照相。ScnImage 圖像分析軟件測定灰度值，以Ⅱ型膠原與β-actin灰度值的比值作為Ⅱ型膠原mRNA的相對表達量。每組6個樣本。
③ Western blot檢測Ⅱ型膠原蛋白表達：同1.3.2方法分組，取培養2周細胞按照BSA法提取總蛋白，并測定蛋白濃度。進行SDS-PAGE凝膠電泳，孵育抗體后，將蛋白轉移至PVDF膜。將膜包于塑料保鮮膜中，暗室曝光。采用ScnImage圖像分析軟件測定灰度值。每組6個樣本。
1.4 統計學方法
采用SPSS13.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示。兩組間比較采用獨立樣本t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 HE染色及掃描電鏡觀察
脫細胞后，HE染色示組織略溶脹，細胞幾乎無殘留，纖維結構完整（圖 1 a）。結構重塑后，大體觀察真皮組織呈瓷白色，蓬松，表面有肉眼可見孔隙（圖 1 b）；掃描電鏡觀察示材料纖維表面光滑、立體感強、孔隙均勻（圖 1 c）。
圖1
脫細胞真皮基質相關觀測 ? 脫細胞后HE染色觀察（× 200） ? 結構重塑后大體觀察 ? 結構重塑后掃描電鏡觀察（× 500） ? ?2.2 材料孔隙率測定
結構重塑前、后的脫細胞真皮基質孔隙率分別為72.8% ± 5.8%和85.4% ± 2.8%，差異有統計學意義（t= -4.384，P=0.005）。
2.3 材料浸提液細胞毒性實驗
培養2、4、7 d，實驗組A值均顯著高于陽性對照組，差異有統計學意義（P＜ 0.05）；與陰性對照組比較差異無統計學意義（P＞ 0.05）。見表 1。
根據A值計算培養2、4、7 d實驗組RGR分別為96.2% ± 8.8%、97.9% ± 2.5%、92.1% ± 5.9%。材料細胞毒性為1級，合格。
表1
MTT法檢測材料細胞毒性（n=3，2.4 皮下埋植實驗
HE染色示，術后4、8、12周均見組織反應輕微，無明顯出血、壞死或水腫，12周時真皮外周有輕度纖維包裹，內部未見炎性細胞、出血或壞死，組織周圍有小血管長入（圖 2）。術后4、8、12周炎性細胞數分別為（45.8 ± 10.7）、（28.2 ± 11.5）、（23.0 ± 9.9）個/HP，各時間點炎性細胞數比較差異均有統計學意義（P＜ 0.05）。
2.5 細胞相容性觀察
2.5.1 掃描電鏡觀察
種子細胞接種48 h后，大量細胞呈片層貼附于支架上，細胞形態飽滿，表面可見微絨毛和分泌現象。見圖 3。
2.5.2 RT-PCR及Western
blot檢測實驗組和對照組Ⅱ型膠原mRNA相對表達量分別為 1.381 ± 0.119 和 1.300 ± 0.105，蛋白表達量分別為 0.612 ± 0.122 和 0.672 ± 0.099 ，比較差異均無統計學意義（t=1.265，P=0.235；t=0.935，P=0.372）。見圖 4、5。
圖4
RT-PCR檢測Ⅱ型膠原mRNA表達 M：Marker 1：對照組 2：實驗組 ? ?3 討論
天然膠原是生物體結締組織的主要組成成分，具有良好的組織相容性。Chajra等[8]和Stone等[9]從毒性、無菌程度、溶血性、致熱原性等方面對膠原進行檢測，證明其是一種可移植、安全且能夠支持軟骨細胞生長的支架材料。1985年，Heck等[10]研究發現同種異體皮膚移植所發生的免疫排斥反應主要源于表皮細胞、內皮細胞和成纖維細胞等，因此只要將皮膚中的細胞成分去除，即能最大限度減弱或避免免疫排斥反應的發生。脫細胞真皮基質不僅去除了細胞成分，而且完整保留了真皮乳頭層表面的基底膜，為移植細胞的新生和擴展提供了有利支持。1995年，Livesey等[11]首先成功制備脫細胞真皮基質。此后脫細胞真皮基質作為一種新型組織工程材料，在燒傷/創傷創面以及口腔頜面皮膚修復等領域取得了良好效果[12]。但未進一步處理的脫細胞動物真皮基質存在組織相容性欠佳、孔隙率不理想等缺點，不能作為軟骨組織工程支架材料。
本實驗應用0.5%胰蛋白酶溶液對脫細胞真皮基質的膠原纖維進行結構重塑，使膠原纖維表面光滑、孔隙均勻、孔隙率較高，利于細胞長入、營養成分滲入及代謝產物排出。然后，應用甲醛作為交聯劑進行交聯，使其孔隙結構更穩定，并具備一定的立體結構和可塑性。組織相容性檢測表明，交聯后的脫細胞真皮基質組織相容性良好，炎性反應隨時間延長逐漸減弱。硫酸軟骨素可抑制彈性蛋白酶、溶酶體酶等水解酶的釋放，減少其對軟骨基質的水解破壞，還具有微弱的抗炎效果，對保護和修復關節軟骨具有重要作用。目前，硫酸軟骨素已被認為是治療骨關節炎、緩解關節不適癥狀的安全有效藥物[13-14]。因此，為使制備的脫細胞真皮基質不僅能作為種子細胞的承載物，還可促進種子細胞生長，我們應用0.5%硫酸軟骨素溶液對交聯后材料進行了表面修飾。
安全高效的種子細胞源是組織工程研究中另一關鍵因素，但至今尚無一種細胞能完全滿足軟骨組織工程對種子細胞的要求[6, 15-16]。我們既往研究表明[7]，以3∶7比例共培養的第2代軟骨細胞與骨髓基質細胞不僅具有較強的增殖能力和軟骨細胞形態，而且良好地保持了軟骨細胞的分泌特性。因此，本實驗將其接種于制備的脫細胞真皮基質支架上，共培養48 h后掃描電鏡下可觀察到大量細胞黏附于支架上，且細胞形態飽滿，細胞表面具有微絨毛，部分細胞可呈分泌狀態。為進一步分析細胞在支架上軟骨表型的維持情況，我們檢測了共培養2周后細胞Ⅱ型膠原mRNA與蛋白表達。結果表明，接種于支架上共培養的種子細胞能維持軟骨細胞表型。
綜上述，經脫細胞、結構重塑、交聯、表面修飾制備的脫細胞真皮基質，具有較高孔隙率、良好組織相容性和細胞黏附性；接種種子細胞后，細胞能較好保持軟骨細胞特性，同時具有較強的增殖和分泌能力，可作為軟骨組織工程一種理想的支架材料。但本實驗也存在不足，未對脫細胞真皮基質的生物降解性和力學特性進行檢測；僅觀測了Ⅱ型膠原表達情況，其他蛋白相關分子生物學檢測有待進一步完善。后續我們還會將該支架材料與其他支架材料進行比較，分析脫細胞真皮基質作為軟骨組織工程支架材料的優缺點，為制備技術的改進和優化提供實驗支持。
