引用本文： 莊淑波, 柴家科, 郁永輝, 段紅杰, 劉玲英, 樊軍, 侯玉森, 王一賀. 燒傷血清對3T3-L1前脂肪細胞增殖活性和成脂分化能力的影響. 中國修復重建外科雜志, 2014, 28(6): 763-767. doi: 10.7507/1002-1892.20140169 復制
燒傷后機體組織破壞嚴重，長時間的負氮平衡導致蛋白質、脂肪、糖類和能量等物質儲備嚴重損耗，使機體處于嚴重營養不良狀態[1]。脂肪消耗過度會引起機體能量供應不足，免疫力下降，感染率增加，創面愈合延遲，嚴重影響患者的生存和預后[2-6]。本研究應用燒傷大鼠血清模擬燒傷環境，體外培養3T3-Ll前脂肪細胞，觀察燒傷血清對細胞增殖及成脂分化能力的影響，為指導臨床調控脂肪分解代謝提供理論依據。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
清潔級成年雄性SD大鼠48只，體重（250 ± 10） g，由中國醫學科學院實驗動物研究所提供。3T3-Ll前脂肪細胞由北京老年醫學研究所提供。胰島素、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、地塞米松（Sigma公司，美國）；MTT（北京華美生物工程公司）；過氧化物酶體增殖物激活受體γ（preoxisome proliferator-activated receptor γ，PPAR-γ）單克隆抗體、脂蛋白脂酶（lipoprotein lipase，LPL）單克隆抗體（武漢博士德生物工程有限公司）；RNA提取試劑盒（Invitrogen公司，美國）；蛋白裂解液測定液試劑盒（PiereBiotee公司，美國）。CO2培養箱（SANYO公司，日本）；倒置顯微鏡、熒光顯微鏡（Leica公司，德國）；450型自動酶標儀系統（Bio-Rad公司，美國）。
1.2 大鼠燒傷血清制備
將48 只大鼠隨機分為6組，分別為假傷組及燒傷1、4、7、14、21 d組，每組8只。實驗前12 h禁食，自由飲水。所有大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉（50 mg/kg）麻醉，背部去毛。各燒傷組大鼠背部置于94℃熱水中12 s，制成30%總體表面積的Ⅲ度燙傷模型[7-8]；假傷組置于37℃熱水中12 s。造模后立即腹腔注射生理鹽水（40 mL/kg）抗休克，單籠飼養。
假傷組于造模后4 d、各燒傷組于傷后對應時間點，取大鼠同上法麻醉后，打開腹腔，分離腹主動脈，10 mL注射器穿刺收集全血。4℃以離心半徑13.5 cm、3 000 r/min離心15 min，收集血清，-70℃保存。
1.3 燒傷血清對3T3-Ll前脂肪細胞增殖能力的影響
取3T3-Ll前脂肪細胞，經0.25%胰蛋白酶消化制成單細胞懸液，按1 ×105個/孔接種于96孔板，分別加入含10%血清（1.2中制備的各組血清）的DMEM培養基，置于37℃、5%CO2 培養箱中培養。培養后1、2、3 d采用MTT法檢測細胞增殖活性。各時間點各組取1塊96孔板，每孔加入MTT（5 mg/mL）20 μL，37℃孵育4 h，棄上清，加入DMSO 150 μL，振蕩10 min，使結晶充分溶解。在酶標儀上于490 nm波長處測量吸光度（A）值，繪制生長曲線。選擇增殖能力最低組血清進行后續實驗。
1.4 燒傷血清對3T3-Ll前脂肪細胞成脂分化能力的影響
1.4.1 實驗分組及方法
實驗分為4組，分別為假傷血清組（A組）、燒傷血清組（B組）、假傷血清成脂誘導組（C組）、燒傷血清成脂誘導組（D組）。首先將各組3T3-Ll前脂肪細胞按1 ×106個接種于培養皿中，采用含10%血清的DMEM培養基培養，其中A、C組采用假傷組大鼠血清，B、D組采用燒傷組大鼠血清（增殖能力最低組血清），每3天換液1次。按參考文獻[9]方法制備含10%血清（C、D組對應血清）的DMEM成脂誘導培養基（1 μmol/L地塞米松、0.5 mmol/L 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、1 μmol/L人胰島素、1 μmol/L吲哚美辛）。C、D組細胞生長融合后更換為成脂誘導培養基繼續培養，A、B組不更換培養基。倒置顯微鏡下觀察各組細胞生長情況。培養7 d后取各組細胞進行以下觀測。
1.4.2 油紅O染色
取各組細胞爬片PBS沖洗2次，置于10%甲醛固定30 min，60%異丙醇固定30 min，油紅O染液1 h，60%異丙醇固定3 s，蒸餾水沖洗棄液，Mayer蘇木素染色5 min，1%鹽酸分化退藍，自來水漂洗10 min，晾干，甘油明膠封固[10]。光鏡下觀察脂肪細胞染色情況，每組隨機選取5枚蓋玻片，于200倍鏡下計數脂肪細胞，取均值。
另取各組細胞置于10%甲醛固定30 min，60%異丙醇固定30 min，油紅O染液1 h，60%異丙醇固定3 s，蒸餾水沖洗棄液，加入等量異丙醇，充分震蕩搖勻后，以離心半徑13.5 cm、3 000 r/min離心15 min。取上清，在酶標儀上于490 nm波長處測定A值，以A值表示脂肪細胞數量[9]。
1.4.3 實時定量PCR檢測成脂特異性轉錄因子PPAR-γ、
LPL基因表達取各組細胞，按RNA提取試劑盒說明抽提總RNA。以隨機引物（oligoDT）、 1.25 μL 10 mmol/L dNTP mix、25 μL RNA酶抑制劑、200 μL M-MLV酶、13.375 μL DEPC水反應體系進行cDNA逆轉錄。cDNA為模板，進行RT-PCR擴增。 引物序列（5'→3'）：PPAR-γ上游GCATGGTGCCTTCGCTGA，下游TGGCATCTCTGTGTCAACCATG；LPL 上游TGTACTTCCAGTGCGTCTC，下游TCCCTTCCGAAT-TATGCT；β-actin 上游 GGCAGGTCTACTTTGGAG，下游ACATTCGAGGCTCCAGTGTT。實時定量PCR總反應體系為20 μL。反應條件：95℃預變性 2 min； 95℃變性 15 s，60℃延伸60 s，循環40次。以β-actin作為內參照，計算PPAR-γ、LPL基因相對表達量。
1.4.4 Western
blot檢測PPAR-γ、LPL蛋白表達取各組細胞，按蛋白裂解液測定液試劑盒說明書分別提取組織蛋白和測定蛋白濃度； 根據蛋白濃度加入loading buffer，煮沸5 min，蛋白變性；使用 12% 分離膠和5% 濃縮膠行PAGE凝膠電泳； 轉膜，用 5%TBST 配制的牛奶封閉 1 h；分別加入PPAR-γ、LPL一抗、二抗，孵育。發光按照發光液試劑盒說明進行。用Quantity One 圖像分析軟件分析PPAR-γ及LPL蛋白表達量。
1.5 統計學方法
采用 SPSS16.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用方差分析，方差齊時兩兩比較采用 LSD 法，方差不齊時采用秩和檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 3T3-Ll前脂肪細胞增殖能力檢測
MTT檢測示，燒傷4、7 d組3T3-Ll前脂肪細胞增殖能力顯著低于其余各組（P＜ 0.05），其中7 d組細胞增殖能力最低（P＜ 0.05）。故選擇燒傷7 d組大鼠血清進行后續實驗。見圖 1。
圖1
各組細胞生長曲線
Figure1.
Growth curve of each group
2.2 燒傷血清對3T3-Ll前脂肪細胞成脂分化能力的影響
2.2.1 細胞形態學觀察
倒置顯微鏡下觀察示，正常3T3-Ll前脂肪細胞貼壁生長后呈長梭形，大部分呈平行排列。A、B組培養期間細胞形態無明顯變化。誘導培養后3 d C組細胞胞質內出現高折光性小脂滴，主要集中于細胞核周圍，隨時間延長脂滴逐漸增多并聚集成大脂滴，細胞體積逐漸增大，由長梭形變為圓形或橢圓形。D組僅有少量細胞胞質內出現高折光性小脂滴，主要集中于細胞核周圍，細胞形態變化與C組一致。見圖 2。
圖2
各組細胞形態學觀察（倒置顯微鏡× 200） ? A組 ? B組 ? C組 ? D組 ? ?2.2.2 油紅O染色觀測
油紅O染色示，A、B組染色為陰性；C組可見細胞中有大小不等的橙紅色脂滴堆積，細胞核呈淡藍色，集中于細胞周圍，提示為脂肪細胞；D組亦可見橙紅色脂滴，但脂肪細胞少于C組。見圖 3。油紅O染色后各組脂肪細胞計數及A值比較示，A、B組間以及C、D組間比較，差異均有統計學意義（P＜ 0.05）。見圖 4。
2.3 PPAR-γ、LPL 基因及蛋白檢測
B組PPAR-γ基因相對表達量明顯低于A組（P＜ 0.05），但LPL基因相對表達量兩組間差異無統計學意義（P＞ 0.05）；PPAR-γ、LPL蛋白表達量兩組間比較差異無統計學意義（P＞ 0.05）。D組PPAR-γ、LPL基因及蛋白表達量均顯著低于C組，差異有統計學意義（P＜ 0.05）。見圖 5～7。
3 討論
3T3-L1前脂肪細胞是從17～19 d小鼠胚胎Swiss3T3細胞中分離獲得的前體細胞，具有單一分化潛能，經克隆擴增成為前脂肪細胞系，細胞本身無脂肪細胞的特性，但在適當誘導條件下可分化成脂肪細胞，與脂肪細胞的形成密切相關[11-12]。3T3-L1前脂肪細胞具有增殖能力，且其增殖也是體內脂肪沉積的主要因素[13]，故本實驗通過3T3-L1前脂肪細胞來研究燒傷脂肪代謝。通過觀察燒傷后1、4、7、14、21 d血清對3T3-L1前脂肪細胞增殖能力的影響，發現燒傷后7 d血清影響最大，細胞增殖能力最低。在臨床中燒傷后第7天是燒傷高代謝階段，該時期患者表現為發熱、白細胞增多，體內糖、脂與肌肉代謝紊亂[14-16]。本研究細胞增殖研究結果與臨床表現相符，故選用燒傷后7 d血清進行3T3-L1前脂肪細胞成脂分化能力的研究。
油紅O染色定量實驗是將細胞進行油紅O染色后，使用異丙醇將脂肪細胞黏染的染料清洗后收集上清液，通過酶標儀對上清液進行A值檢測分析，是較為公認的脂肪細胞定量檢測方法之一。因此，本研究選擇染色后細胞計數及檢測上清液A值兩種方法，明確各組成脂誘導后的細胞數量。結果顯示，C組經成脂誘導后形成大量脂肪細胞，而D組誘導成脂細胞量明顯減少。
本研究對誘導后細胞中成脂特異性轉錄因子PPAR-γ和LPL基因及蛋白表達量進行了檢測。PPAR-γ在成脂早期即表達，它還可調控其他脂肪細胞特異性基因的表達，從而調控成脂分化。PPAR-γ是脂肪細胞分化的決定性因子，無論是在體內還是體外實驗都已證實PPAR-γ的表達是脂肪細胞形成所必需因素[17-23]。LPL是細胞分化為脂肪細胞經典而重要的標志，不僅在分化早期表達，在脂肪細胞分化前期及成熟脂肪細胞均可表達[24-26]。研究結果提示，在A組3T3-L1前脂肪細胞可見PPAR-γ基因表達，B組細胞PPAR-γ基因相對表達量較A組顯著下降，提示燒傷血清通過基因水平調控3T3-L1前脂肪細胞的成脂分化。A、B組均未采用成脂誘導劑進行培養，故LPL基因相對表達量甚微，兩組間比較也無明顯差異。C組PPAR-γ基因及蛋白表達明均顯著高于D組，進一步表明燒傷血清抑制了3T3-L1前脂肪細胞成脂分化。
綜上述，本研究結果提示，采用大鼠燒傷血清培養3T3-L1前脂肪細胞，會降低細胞的成脂分化能力，而成脂分化能力下降是燒傷后脂肪分解代謝變化的主要原因之一。如何能有效的改善燒傷后脂肪代謝，有待更深入的研究。
燒傷后機體組織破壞嚴重，長時間的負氮平衡導致蛋白質、脂肪、糖類和能量等物質儲備嚴重損耗，使機體處于嚴重營養不良狀態[1]。脂肪消耗過度會引起機體能量供應不足，免疫力下降，感染率增加，創面愈合延遲，嚴重影響患者的生存和預后[2-6]。本研究應用燒傷大鼠血清模擬燒傷環境，體外培養3T3-Ll前脂肪細胞，觀察燒傷血清對細胞增殖及成脂分化能力的影響，為指導臨床調控脂肪分解代謝提供理論依據。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
清潔級成年雄性SD大鼠48只，體重（250 ± 10） g，由中國醫學科學院實驗動物研究所提供。3T3-Ll前脂肪細胞由北京老年醫學研究所提供。胰島素、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、地塞米松（Sigma公司，美國）；MTT（北京華美生物工程公司）；過氧化物酶體增殖物激活受體γ（preoxisome proliferator-activated receptor γ，PPAR-γ）單克隆抗體、脂蛋白脂酶（lipoprotein lipase，LPL）單克隆抗體（武漢博士德生物工程有限公司）；RNA提取試劑盒（Invitrogen公司，美國）；蛋白裂解液測定液試劑盒（PiereBiotee公司，美國）。CO2培養箱（SANYO公司，日本）；倒置顯微鏡、熒光顯微鏡（Leica公司，德國）；450型自動酶標儀系統（Bio-Rad公司，美國）。
1.2 大鼠燒傷血清制備
將48 只大鼠隨機分為6組，分別為假傷組及燒傷1、4、7、14、21 d組，每組8只。實驗前12 h禁食，自由飲水。所有大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉（50 mg/kg）麻醉，背部去毛。各燒傷組大鼠背部置于94℃熱水中12 s，制成30%總體表面積的Ⅲ度燙傷模型[7-8]；假傷組置于37℃熱水中12 s。造模后立即腹腔注射生理鹽水（40 mL/kg）抗休克，單籠飼養。
假傷組于造模后4 d、各燒傷組于傷后對應時間點，取大鼠同上法麻醉后，打開腹腔，分離腹主動脈，10 mL注射器穿刺收集全血。4℃以離心半徑13.5 cm、3 000 r/min離心15 min，收集血清，-70℃保存。
1.3 燒傷血清對3T3-Ll前脂肪細胞增殖能力的影響
取3T3-Ll前脂肪細胞，經0.25%胰蛋白酶消化制成單細胞懸液，按1 ×105個/孔接種于96孔板，分別加入含10%血清（1.2中制備的各組血清）的DMEM培養基，置于37℃、5%CO2 培養箱中培養。培養后1、2、3 d采用MTT法檢測細胞增殖活性。各時間點各組取1塊96孔板，每孔加入MTT（5 mg/mL）20 μL，37℃孵育4 h，棄上清，加入DMSO 150 μL，振蕩10 min，使結晶充分溶解。在酶標儀上于490 nm波長處測量吸光度（A）值，繪制生長曲線。選擇增殖能力最低組血清進行后續實驗。
1.4 燒傷血清對3T3-Ll前脂肪細胞成脂分化能力的影響
1.4.1 實驗分組及方法
實驗分為4組，分別為假傷血清組（A組）、燒傷血清組（B組）、假傷血清成脂誘導組（C組）、燒傷血清成脂誘導組（D組）。首先將各組3T3-Ll前脂肪細胞按1 ×106個接種于培養皿中，采用含10%血清的DMEM培養基培養，其中A、C組采用假傷組大鼠血清，B、D組采用燒傷組大鼠血清（增殖能力最低組血清），每3天換液1次。按參考文獻[9]方法制備含10%血清（C、D組對應血清）的DMEM成脂誘導培養基（1 μmol/L地塞米松、0.5 mmol/L 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、1 μmol/L人胰島素、1 μmol/L吲哚美辛）。C、D組細胞生長融合后更換為成脂誘導培養基繼續培養，A、B組不更換培養基。倒置顯微鏡下觀察各組細胞生長情況。培養7 d后取各組細胞進行以下觀測。
1.4.2 油紅O染色
取各組細胞爬片PBS沖洗2次，置于10%甲醛固定30 min，60%異丙醇固定30 min，油紅O染液1 h，60%異丙醇固定3 s，蒸餾水沖洗棄液，Mayer蘇木素染色5 min，1%鹽酸分化退藍，自來水漂洗10 min，晾干，甘油明膠封固[10]。光鏡下觀察脂肪細胞染色情況，每組隨機選取5枚蓋玻片，于200倍鏡下計數脂肪細胞，取均值。
另取各組細胞置于10%甲醛固定30 min，60%異丙醇固定30 min，油紅O染液1 h，60%異丙醇固定3 s，蒸餾水沖洗棄液，加入等量異丙醇，充分震蕩搖勻后，以離心半徑13.5 cm、3 000 r/min離心15 min。取上清，在酶標儀上于490 nm波長處測定A值，以A值表示脂肪細胞數量[9]。
1.4.3 實時定量PCR檢測成脂特異性轉錄因子PPAR-γ、
LPL基因表達取各組細胞，按RNA提取試劑盒說明抽提總RNA。以隨機引物（oligoDT）、 1.25 μL 10 mmol/L dNTP mix、25 μL RNA酶抑制劑、200 μL M-MLV酶、13.375 μL DEPC水反應體系進行cDNA逆轉錄。cDNA為模板，進行RT-PCR擴增。 引物序列（5'→3'）：PPAR-γ上游GCATGGTGCCTTCGCTGA，下游TGGCATCTCTGTGTCAACCATG；LPL 上游TGTACTTCCAGTGCGTCTC，下游TCCCTTCCGAAT-TATGCT；β-actin 上游 GGCAGGTCTACTTTGGAG，下游ACATTCGAGGCTCCAGTGTT。實時定量PCR總反應體系為20 μL。反應條件：95℃預變性 2 min； 95℃變性 15 s，60℃延伸60 s，循環40次。以β-actin作為內參照，計算PPAR-γ、LPL基因相對表達量。
1.4.4 Western
blot檢測PPAR-γ、LPL蛋白表達取各組細胞，按蛋白裂解液測定液試劑盒說明書分別提取組織蛋白和測定蛋白濃度； 根據蛋白濃度加入loading buffer，煮沸5 min，蛋白變性；使用 12% 分離膠和5% 濃縮膠行PAGE凝膠電泳； 轉膜，用 5%TBST 配制的牛奶封閉 1 h；分別加入PPAR-γ、LPL一抗、二抗，孵育。發光按照發光液試劑盒說明進行。用Quantity One 圖像分析軟件分析PPAR-γ及LPL蛋白表達量。
1.5 統計學方法
采用 SPSS16.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用方差分析，方差齊時兩兩比較采用 LSD 法，方差不齊時采用秩和檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 3T3-Ll前脂肪細胞增殖能力檢測
MTT檢測示，燒傷4、7 d組3T3-Ll前脂肪細胞增殖能力顯著低于其余各組（P＜ 0.05），其中7 d組細胞增殖能力最低（P＜ 0.05）。故選擇燒傷7 d組大鼠血清進行后續實驗。見圖 1。
圖1
各組細胞生長曲線
Figure1.
Growth curve of each group
2.2 燒傷血清對3T3-Ll前脂肪細胞成脂分化能力的影響
2.2.1 細胞形態學觀察
倒置顯微鏡下觀察示，正常3T3-Ll前脂肪細胞貼壁生長后呈長梭形，大部分呈平行排列。A、B組培養期間細胞形態無明顯變化。誘導培養后3 d C組細胞胞質內出現高折光性小脂滴，主要集中于細胞核周圍，隨時間延長脂滴逐漸增多并聚集成大脂滴，細胞體積逐漸增大，由長梭形變為圓形或橢圓形。D組僅有少量細胞胞質內出現高折光性小脂滴，主要集中于細胞核周圍，細胞形態變化與C組一致。見圖 2。
圖2
各組細胞形態學觀察（倒置顯微鏡× 200） ? A組 ? B組 ? C組 ? D組 ? ?2.2.2 油紅O染色觀測
油紅O染色示，A、B組染色為陰性；C組可見細胞中有大小不等的橙紅色脂滴堆積，細胞核呈淡藍色，集中于細胞周圍，提示為脂肪細胞；D組亦可見橙紅色脂滴，但脂肪細胞少于C組。見圖 3。油紅O染色后各組脂肪細胞計數及A值比較示，A、B組間以及C、D組間比較，差異均有統計學意義（P＜ 0.05）。見圖 4。
2.3 PPAR-γ、LPL 基因及蛋白檢測
B組PPAR-γ基因相對表達量明顯低于A組（P＜ 0.05），但LPL基因相對表達量兩組間差異無統計學意義（P＞ 0.05）；PPAR-γ、LPL蛋白表達量兩組間比較差異無統計學意義（P＞ 0.05）。D組PPAR-γ、LPL基因及蛋白表達量均顯著低于C組，差異有統計學意義（P＜ 0.05）。見圖 5～7。
3 討論
3T3-L1前脂肪細胞是從17～19 d小鼠胚胎Swiss3T3細胞中分離獲得的前體細胞，具有單一分化潛能，經克隆擴增成為前脂肪細胞系，細胞本身無脂肪細胞的特性，但在適當誘導條件下可分化成脂肪細胞，與脂肪細胞的形成密切相關[11-12]。3T3-L1前脂肪細胞具有增殖能力，且其增殖也是體內脂肪沉積的主要因素[13]，故本實驗通過3T3-L1前脂肪細胞來研究燒傷脂肪代謝。通過觀察燒傷后1、4、7、14、21 d血清對3T3-L1前脂肪細胞增殖能力的影響，發現燒傷后7 d血清影響最大，細胞增殖能力最低。在臨床中燒傷后第7天是燒傷高代謝階段，該時期患者表現為發熱、白細胞增多，體內糖、脂與肌肉代謝紊亂[14-16]。本研究細胞增殖研究結果與臨床表現相符，故選用燒傷后7 d血清進行3T3-L1前脂肪細胞成脂分化能力的研究。
油紅O染色定量實驗是將細胞進行油紅O染色后，使用異丙醇將脂肪細胞黏染的染料清洗后收集上清液，通過酶標儀對上清液進行A值檢測分析，是較為公認的脂肪細胞定量檢測方法之一。因此，本研究選擇染色后細胞計數及檢測上清液A值兩種方法，明確各組成脂誘導后的細胞數量。結果顯示，C組經成脂誘導后形成大量脂肪細胞，而D組誘導成脂細胞量明顯減少。
本研究對誘導后細胞中成脂特異性轉錄因子PPAR-γ和LPL基因及蛋白表達量進行了檢測。PPAR-γ在成脂早期即表達，它還可調控其他脂肪細胞特異性基因的表達，從而調控成脂分化。PPAR-γ是脂肪細胞分化的決定性因子，無論是在體內還是體外實驗都已證實PPAR-γ的表達是脂肪細胞形成所必需因素[17-23]。LPL是細胞分化為脂肪細胞經典而重要的標志，不僅在分化早期表達，在脂肪細胞分化前期及成熟脂肪細胞均可表達[24-26]。研究結果提示，在A組3T3-L1前脂肪細胞可見PPAR-γ基因表達，B組細胞PPAR-γ基因相對表達量較A組顯著下降，提示燒傷血清通過基因水平調控3T3-L1前脂肪細胞的成脂分化。A、B組均未采用成脂誘導劑進行培養，故LPL基因相對表達量甚微，兩組間比較也無明顯差異。C組PPAR-γ基因及蛋白表達明均顯著高于D組，進一步表明燒傷血清抑制了3T3-L1前脂肪細胞成脂分化。
綜上述，本研究結果提示，采用大鼠燒傷血清培養3T3-L1前脂肪細胞，會降低細胞的成脂分化能力，而成脂分化能力下降是燒傷后脂肪分解代謝變化的主要原因之一。如何能有效的改善燒傷后脂肪代謝，有待更深入的研究。
