引用本文： 王運濤, 吳小濤, 王鋒, 洪鑫, 鮑軍平, 朱磊. 過早衰老髓核細胞微環境中BMSCs的生物學行為研究. 中國修復重建外科雜志, 2014, 28(6): 758-762. doi: 10.7507/1002-1892.20140168 復制
BMSCs移植為退變椎間盤的細胞重建及功能恢復提供了一種全新治療策略，已顯示出巨大潛能[1-4]。但退變椎間盤由于存在生長因子匱乏、營養障礙、異常細胞接觸等應激因素[5-6]，可能會導致移植的BMSCs干細胞特性發生改變，從而不利于退變椎間盤生物學修復。與多次分裂后端粒縮短引起的復制性衰老不同，誘發細胞分裂停滯的過早衰老主要受細胞微環境中多種應激因素影響[7-8]。本研究擬對過早衰老髓核細胞（nucleus pulposus cells，NPCs）微環境中BMSCs的生物學行為進行探討，明確其部分生物學特性，為退變椎間盤的生物學修復奠定實驗基礎。
1 材料與方法
1.1 主要試劑及儀器
胰蛋白酶、DMEM/F12培養基（GIBCO公司，美國）；FBS（HyClone公司，美國）；細胞計數試劑盒8（cell counting kit 8，CCK-8；日本同仁化學研究所）；細胞周期檢測試劑盒（杭州聯科生物技術有限公司）；BrdU增殖檢測試劑盒（eBioscience公司，美國）；衰老相關β半乳糖苷酶（senescence associated β-galactosidase，SA-β-gal）檢測試劑盒（上海碧云天生物技術研究所）。
Transwell共培養體系（Greiner Bio-one公司，德國）；倒置相差顯微鏡（Zeiss公司，德國）；細胞培養箱（Herabus公司，德國）；H-9500型透射電鏡（Hitachi公司，日本）；Accuri C6流式細胞儀（BD公司，美國）。
1.2 人NPCs與BMSCs共培養
1.2.1 人NPCs分離培養
經患者知情同意，于2012年9月－12月東南大學附屬中大醫院骨科收集退變髓核標本12例。其中男7例，女5例；年齡20～64歲，平均43.2歲。均因腰椎間盤突出癥行后路顯微內窺鏡下腰椎間盤摘除術，其中L4、5 8例，L5、S1 4例。退變Pfirrmann分級：Ⅲ級6例，Ⅳ級6例。按文獻[3]方法分離培養細胞，并經甲苯胺藍染色檢測細胞聚集蛋白聚糖的表達、免疫細胞化學染色檢測Ⅱ型膠原表達，鑒定培養細胞為NPCs。
1.2.2 人BMSCs分離培養
經患者知情同意，于2012年9月－12月東南大學附屬中大醫院骨科收集正常骨髓標本6例。其中男4例，女2例；年齡25～57歲平均35.6歲。跟骨骨折4例，骨盆骨折2例；均排除糖尿病、高血壓、腦梗死等基礎疾病。按文獻[3]方法，分離培養細胞，并經流式細胞儀檢測細胞表面分子CD34、CD45、CD13的表達，鑒定培養細胞為BMSCs。
1.2.3 人NPCs與BMSCs共培養
采用Transwell共培養體系，取第1代NPCs和第3代BMSCs行非接觸共培養。上室培養NPCs，下室培養BMSCs，中間以聚碳酸酯透水膜（孔隙0.4 μm）分隔。根據NPCs∶BMSCs不同比例將實驗分為A組（75%∶ 25%）、B組（50%∶50%）和C組（0∶100%）。NPCs過早衰老誘導方法[5]：待細胞融合達80%，PBS洗滌細胞2次，A、B組上室NPCs內加入100 μmol/L H2O2處理2 h，PBS洗滌細胞2次，繼續同前培養。
1.3 觀測指標
1.3.1 BMSCs形態學觀察
① 各組培養過程中采用倒置相差顯微鏡觀察BMSCs形態變化。② 取培養6 d的各組BMSCs，以400 × g離心5 min后收集，用冷PBS洗滌2次，2.5%冷戊二醛固定，4℃過夜；同上法離心5 min，PBS洗滌2次，梯度乙醇脫水處理2次，100%丙酮處理15 min；再將細胞包埋于多孔橡膠包埋模板中，烘干后行超薄切片并透射電鏡觀察。
1.3.2 BMSCs增殖能力檢測
① CCK-8法檢測細胞活力：取培養3、6 d的各組BMSCs，按5 000個/孔密度接種于96孔板，以含10%FBS的DMEM/F12培養基培養48 h；換液，每孔加入CCK-8工作液10 μL，混勻，培養箱中孵育1 h，酶標儀檢測450 nm波長處吸光度（A）值。設置培養基為空白對照組。根據以下公式計算細胞存活率：（A組或B組A值－空白對照組A值） /（C組A值－空白對照組A值）×100%。
② 流式細胞儀檢測細胞周期：取培養3、6 d的各組BMSCs，用無血清DMEM/F12培養基孵育，同步化24 h；換液，以含10%FBS的DMEM/F12培養基培養48 h；收集細胞，75%乙醇、20℃固定24 h；同上法離心5 min，收集細胞，揮干乙醇，加入含50 μg/mL溴化乙錠和100 μg/mL RNase A的染色工作液，室溫、避光染色30 min，流式細胞儀檢測細胞周期。
③ BrdU標記流式檢測DNA代謝：取培養3、6 d的各組BMSCs，用無血清DMEM/F12培養基孵育，同步化24 h；換液，以含10%FBS的DMEM/F12培養基培養48 h；加入終濃度0.01 mmol/L的BrdU，37℃孵育40 min；收集細胞，75%乙醇、20℃固定24 h；同上法離心5 min，收集細胞，揮干乙醇，加Rinse Buffer洗2次，加0.1 mL FITC標記的BrdU抗體孵育30 min，補加0.9 mL Rinse Buffer，流式細胞儀檢測摻入細胞中的BrdU含量。
1.3.3 SA-β-gal活性檢測
取培養6 d的各組BMSCs，PBS洗2次，加入1 mL SA-β-gal染色固定液室溫固定15 min；吸棄固定液，PBS洗2次，加入1 mL染色工作液（配制方法：SA-β-gal染色液A 10 μL，SA-β-gal染色液B 10 μL，SA-β-gal染色液C 930 μL，X-gal溶液50 μL），37℃染色過夜；吸棄工作液，加70%甘油并封固。光鏡下觀察細胞染色情況，藍染細胞為SA-β-gal陽性細胞。隨機選取5個高倍視野，計數100個細胞，計算陽性染色細胞百分比。
1.4 統計學方法
采用SPSS16.0統計軟件進行分析。數據以均數 ± 標準差表示，組間比較采用方差分析，兩兩比較采用q檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 BMSCs形態學觀察
倒置相差顯微鏡觀察示，C組培養過程中BMSCs分布均勻，呈長梭形和集落樣生長，胞體飽滿。A、B組在培養過程中陸續有細胞死亡，換液時偶見細胞成片脫落，細胞分布疏松；尤其是在A組，混雜的三角形或大多角形細胞增多，體積較大，細胞質與細胞核比例增加，細胞質內顆粒或空泡狀物質增多。見圖 1。
圖1
倒置相差顯微鏡觀察培養6 d各組BMSCs形態（×100） ? A組 ? B組 ? C組 ? ?透射電鏡觀察示，培養6 d，A、B組中均可見典型衰老形態的細胞，其核膜內折，核染色質濃縮；細胞質內可見大量空泡，線粒體體積增大、數量減少。C組細胞核大，以類圓形為主，核膜光滑，細胞質與細胞核比例大；細胞質內線粒體豐富。見圖 2。
2.2 BMSCs增殖能力檢測
2.2.1 CCK-8檢測細胞活力
培養3 d A組BMSCs的A值明顯低于B、C組，差異有統計學意義（P＜ 0.05），B、C組間差異無統計學意義（P＞ 0.05）；A、B組細胞存活率分別為69.7% ± 3.5%和90.8% ± 2.7%，差異有統計學意義（t= -9.343，P=0.000）。培養6 d 3組間A值比較差異均有統計學意義（P＜ 0.05）；A、B組細胞存活率分別為66.3% ± 3.1%和80.0% ± 5.3%，差異有統計學意義（t= -4.596，P=0.004）。見表 1。
表1
培養后各時間點BMSCs增殖能力檢測（n=4，2.2.2 流式細胞儀分析細胞周期
培養3 d，A組G1期細胞比例明顯高于B、C組，S期細胞比例明顯低于B、C組，差異有統計學意義（P＜ 0.05）；A組G2期細胞比例與B、C組比較差異無統計學意義（P＞ 0.05）；B、C組間各細胞周期分布差異均無統計學意義（P＞ 0.05）。培養6 d，A組細胞約81.0%停滯于G1期，S期及G2期細胞比例減小，與B、C組比較各細胞周期分布差異均有統計學意義（P＜ 0.05）；B組細胞停滯于G1期的比例亦增加至約74.4%，與C組比較各細胞周期分布差異均有統計學意義（P＜ 0.05）。見表 1。
2.2.3 BrdU標記流式檢測DNA代謝
培養3、6 d，A組摻入的BrdU含量均明顯低于B、C組，差異有統計學意義（P＜ 0.05）；B、C組間3 d時差異無統計學意義（P＞ 0.05），6 d時B組明顯低于C組，差異有統計學意義（P＜ 0.05）。見表 1。
2.3 SA-β-gal活性檢測
光鏡下觀察示，C組細胞胞體飽滿，立體感強，基本不著色；A、B組細胞SA-β-gal藍染清晰，A組染色程度高于B組（圖 3）。A、B、C組陽性染色細胞百分比分別為71.4% ± 7.1%、54.6% ± 7.6%和16.6% ± 3.0%，3組間比較差異均有統計學意義（P＜ 0.05）。
3 討論
源于中胚層的BMSCs是一類多潛能干細胞，它具有強大的增殖能力和免疫調節能力，同時在適宜環境下具有多向分化潛能[1, 9-10]；BMSCs移植修復椎間盤退變具有良好應用前景[1-3]。但采用BMSCs移植對退變椎間盤進行生物學修復與重建是一個復雜而精細的過程，如何保證該過程中BMSCs的生物活性及生物學功能穩定性，直接關系到其后期臨床應用的有效性，由于椎間盤退變起源于髓核[11-13]，因此有必要對退變髓核微環境中BMSCs的生物學行為進行探討。
影響干細胞移植療效的主要因素之一是新的微環境導致的細胞自身過早衰老[7, 14]。研究發現，將老年小鼠中已衰老的生殖干細胞移植入年輕小鼠后，其功能得以恢復，并可長時間保持未衰老狀態[15]；而將從年輕大鼠獲得的干細胞移植入老年心肌梗死大鼠心臟后其功能迅速衰退，修復心肌能力下降[16]。BMSCs也不例外，老年個體來源的BMSCs移植療效低于年輕個體來源的BMSCs[14, 17]。在體外用不同濃度H2O2溶液處理BMSCs[18]，發現亞致死氧化應激狀態下BMSCs增殖速度下降，SA-β-gal特異性高表達，細胞呈典型衰老特征，而低氧化應激狀態下BMSCs增殖速度和細胞形態無變化，說明盡管BMSCs表現出了良好的氧化應激耐受性，但特定的細胞微環境可誘導其發生過早衰老。我們將氧化應激誘導的NPCs與BMSCs共培養發現，BMSCs呈現衰老表型：細胞體積增大、細胞扁平，細胞質和細胞核比例增加，核膜內折、核染色質濃縮，細胞質內顆粒或空泡狀物質增多；進一步檢測發現SA-β-gal活性上調。說明BMSCs作為種子細胞對損傷的NPCs進行修復同時，也受到衰老NPCs營造的微環境影響，其自身生物學行為也會發生相應改變。
椎間盤退變是一個多因素參與的慢性過程，遺傳因素、炎性因子、細胞凋亡、營養障礙等均與椎間盤退變相關，細胞的過早衰老在此過程中起核心作用[19-20]。衰老NPCs不僅滯留在G1期停止分裂導致細胞數量丟失，同時還大量表達炎性因子和基質降解酶，惡化鄰近正常細胞賴以生存的微環境，產生更大的破壞效應[12, 20-21]。Transwell共培養體系在實現NPCs與BMSCs非接觸的同時，允許細胞分泌因子自由通過作用于彼此。我們將NPCs與BMSCs按照一定比例進行共培養，發現過早衰老的NPCs通過旁分泌效應下調了共培養的BMSCs增殖能力，且NPCs數量上的優勢使得共培養的BMSCs更早表現出衰老特征。說明衰老的NPCs微環境不利于發揮BMSCs生物學修復功能。
盡管本研究所使用的NPCs與BMSCs來自于不同患者，未考慮遺傳因素對共培養結果的影響，同時氧化應激誘導的NPCs并不能完全模擬椎間盤退變環境下NPCs的自然狀態，但仍在一定程度上反映了在損傷NPCs修復過程中，BMSCs所處的環境因素對其生物學行為有影響。另外，導致BMSCs生物學行為發生改變的NPCs微環境還需進一步量化，其發生機制也有待進一步探討。
BMSCs移植為退變椎間盤的細胞重建及功能恢復提供了一種全新治療策略，已顯示出巨大潛能[1-4]。但退變椎間盤由于存在生長因子匱乏、營養障礙、異常細胞接觸等應激因素[5-6]，可能會導致移植的BMSCs干細胞特性發生改變，從而不利于退變椎間盤生物學修復。與多次分裂后端粒縮短引起的復制性衰老不同，誘發細胞分裂停滯的過早衰老主要受細胞微環境中多種應激因素影響[7-8]。本研究擬對過早衰老髓核細胞（nucleus pulposus cells，NPCs）微環境中BMSCs的生物學行為進行探討，明確其部分生物學特性，為退變椎間盤的生物學修復奠定實驗基礎。
1 材料與方法
1.1 主要試劑及儀器
胰蛋白酶、DMEM/F12培養基（GIBCO公司，美國）；FBS（HyClone公司，美國）；細胞計數試劑盒8（cell counting kit 8，CCK-8；日本同仁化學研究所）；細胞周期檢測試劑盒（杭州聯科生物技術有限公司）；BrdU增殖檢測試劑盒（eBioscience公司，美國）；衰老相關β半乳糖苷酶（senescence associated β-galactosidase，SA-β-gal）檢測試劑盒（上海碧云天生物技術研究所）。
Transwell共培養體系（Greiner Bio-one公司，德國）；倒置相差顯微鏡（Zeiss公司，德國）；細胞培養箱（Herabus公司，德國）；H-9500型透射電鏡（Hitachi公司，日本）；Accuri C6流式細胞儀（BD公司，美國）。
1.2 人NPCs與BMSCs共培養
1.2.1 人NPCs分離培養
經患者知情同意，于2012年9月－12月東南大學附屬中大醫院骨科收集退變髓核標本12例。其中男7例，女5例；年齡20～64歲，平均43.2歲。均因腰椎間盤突出癥行后路顯微內窺鏡下腰椎間盤摘除術，其中L4、5 8例，L5、S1 4例。退變Pfirrmann分級：Ⅲ級6例，Ⅳ級6例。按文獻[3]方法分離培養細胞，并經甲苯胺藍染色檢測細胞聚集蛋白聚糖的表達、免疫細胞化學染色檢測Ⅱ型膠原表達，鑒定培養細胞為NPCs。
1.2.2 人BMSCs分離培養
經患者知情同意，于2012年9月－12月東南大學附屬中大醫院骨科收集正常骨髓標本6例。其中男4例，女2例；年齡25～57歲平均35.6歲。跟骨骨折4例，骨盆骨折2例；均排除糖尿病、高血壓、腦梗死等基礎疾病。按文獻[3]方法，分離培養細胞，并經流式細胞儀檢測細胞表面分子CD34、CD45、CD13的表達，鑒定培養細胞為BMSCs。
1.2.3 人NPCs與BMSCs共培養
采用Transwell共培養體系，取第1代NPCs和第3代BMSCs行非接觸共培養。上室培養NPCs，下室培養BMSCs，中間以聚碳酸酯透水膜（孔隙0.4 μm）分隔。根據NPCs∶BMSCs不同比例將實驗分為A組（75%∶ 25%）、B組（50%∶50%）和C組（0∶100%）。NPCs過早衰老誘導方法[5]：待細胞融合達80%，PBS洗滌細胞2次，A、B組上室NPCs內加入100 μmol/L H2O2處理2 h，PBS洗滌細胞2次，繼續同前培養。
1.3 觀測指標
1.3.1 BMSCs形態學觀察
① 各組培養過程中采用倒置相差顯微鏡觀察BMSCs形態變化。② 取培養6 d的各組BMSCs，以400 × g離心5 min后收集，用冷PBS洗滌2次，2.5%冷戊二醛固定，4℃過夜；同上法離心5 min，PBS洗滌2次，梯度乙醇脫水處理2次，100%丙酮處理15 min；再將細胞包埋于多孔橡膠包埋模板中，烘干后行超薄切片并透射電鏡觀察。
1.3.2 BMSCs增殖能力檢測
① CCK-8法檢測細胞活力：取培養3、6 d的各組BMSCs，按5 000個/孔密度接種于96孔板，以含10%FBS的DMEM/F12培養基培養48 h；換液，每孔加入CCK-8工作液10 μL，混勻，培養箱中孵育1 h，酶標儀檢測450 nm波長處吸光度（A）值。設置培養基為空白對照組。根據以下公式計算細胞存活率：（A組或B組A值－空白對照組A值） /（C組A值－空白對照組A值）×100%。
② 流式細胞儀檢測細胞周期：取培養3、6 d的各組BMSCs，用無血清DMEM/F12培養基孵育，同步化24 h；換液，以含10%FBS的DMEM/F12培養基培養48 h；收集細胞，75%乙醇、20℃固定24 h；同上法離心5 min，收集細胞，揮干乙醇，加入含50 μg/mL溴化乙錠和100 μg/mL RNase A的染色工作液，室溫、避光染色30 min，流式細胞儀檢測細胞周期。
③ BrdU標記流式檢測DNA代謝：取培養3、6 d的各組BMSCs，用無血清DMEM/F12培養基孵育，同步化24 h；換液，以含10%FBS的DMEM/F12培養基培養48 h；加入終濃度0.01 mmol/L的BrdU，37℃孵育40 min；收集細胞，75%乙醇、20℃固定24 h；同上法離心5 min，收集細胞，揮干乙醇，加Rinse Buffer洗2次，加0.1 mL FITC標記的BrdU抗體孵育30 min，補加0.9 mL Rinse Buffer，流式細胞儀檢測摻入細胞中的BrdU含量。
1.3.3 SA-β-gal活性檢測
取培養6 d的各組BMSCs，PBS洗2次，加入1 mL SA-β-gal染色固定液室溫固定15 min；吸棄固定液，PBS洗2次，加入1 mL染色工作液（配制方法：SA-β-gal染色液A 10 μL，SA-β-gal染色液B 10 μL，SA-β-gal染色液C 930 μL，X-gal溶液50 μL），37℃染色過夜；吸棄工作液，加70%甘油并封固。光鏡下觀察細胞染色情況，藍染細胞為SA-β-gal陽性細胞。隨機選取5個高倍視野，計數100個細胞，計算陽性染色細胞百分比。
1.4 統計學方法
采用SPSS16.0統計軟件進行分析。數據以均數 ± 標準差表示，組間比較采用方差分析，兩兩比較采用q檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 BMSCs形態學觀察
倒置相差顯微鏡觀察示，C組培養過程中BMSCs分布均勻，呈長梭形和集落樣生長，胞體飽滿。A、B組在培養過程中陸續有細胞死亡，換液時偶見細胞成片脫落，細胞分布疏松；尤其是在A組，混雜的三角形或大多角形細胞增多，體積較大，細胞質與細胞核比例增加，細胞質內顆粒或空泡狀物質增多。見圖 1。
圖1
倒置相差顯微鏡觀察培養6 d各組BMSCs形態（×100） ? A組 ? B組 ? C組 ? ?透射電鏡觀察示，培養6 d，A、B組中均可見典型衰老形態的細胞，其核膜內折，核染色質濃縮；細胞質內可見大量空泡，線粒體體積增大、數量減少。C組細胞核大，以類圓形為主，核膜光滑，細胞質與細胞核比例大；細胞質內線粒體豐富。見圖 2。
2.2 BMSCs增殖能力檢測
2.2.1 CCK-8檢測細胞活力
培養3 d A組BMSCs的A值明顯低于B、C組，差異有統計學意義（P＜ 0.05），B、C組間差異無統計學意義（P＞ 0.05）；A、B組細胞存活率分別為69.7% ± 3.5%和90.8% ± 2.7%，差異有統計學意義（t= -9.343，P=0.000）。培養6 d 3組間A值比較差異均有統計學意義（P＜ 0.05）；A、B組細胞存活率分別為66.3% ± 3.1%和80.0% ± 5.3%，差異有統計學意義（t= -4.596，P=0.004）。見表 1。
表1
培養后各時間點BMSCs增殖能力檢測（n=4，2.2.2 流式細胞儀分析細胞周期
培養3 d，A組G1期細胞比例明顯高于B、C組，S期細胞比例明顯低于B、C組，差異有統計學意義（P＜ 0.05）；A組G2期細胞比例與B、C組比較差異無統計學意義（P＞ 0.05）；B、C組間各細胞周期分布差異均無統計學意義（P＞ 0.05）。培養6 d，A組細胞約81.0%停滯于G1期，S期及G2期細胞比例減小，與B、C組比較各細胞周期分布差異均有統計學意義（P＜ 0.05）；B組細胞停滯于G1期的比例亦增加至約74.4%，與C組比較各細胞周期分布差異均有統計學意義（P＜ 0.05）。見表 1。
2.2.3 BrdU標記流式檢測DNA代謝
培養3、6 d，A組摻入的BrdU含量均明顯低于B、C組，差異有統計學意義（P＜ 0.05）；B、C組間3 d時差異無統計學意義（P＞ 0.05），6 d時B組明顯低于C組，差異有統計學意義（P＜ 0.05）。見表 1。
2.3 SA-β-gal活性檢測
光鏡下觀察示，C組細胞胞體飽滿，立體感強，基本不著色；A、B組細胞SA-β-gal藍染清晰，A組染色程度高于B組（圖 3）。A、B、C組陽性染色細胞百分比分別為71.4% ± 7.1%、54.6% ± 7.6%和16.6% ± 3.0%，3組間比較差異均有統計學意義（P＜ 0.05）。
3 討論
源于中胚層的BMSCs是一類多潛能干細胞，它具有強大的增殖能力和免疫調節能力，同時在適宜環境下具有多向分化潛能[1, 9-10]；BMSCs移植修復椎間盤退變具有良好應用前景[1-3]。但采用BMSCs移植對退變椎間盤進行生物學修復與重建是一個復雜而精細的過程，如何保證該過程中BMSCs的生物活性及生物學功能穩定性，直接關系到其后期臨床應用的有效性，由于椎間盤退變起源于髓核[11-13]，因此有必要對退變髓核微環境中BMSCs的生物學行為進行探討。
影響干細胞移植療效的主要因素之一是新的微環境導致的細胞自身過早衰老[7, 14]。研究發現，將老年小鼠中已衰老的生殖干細胞移植入年輕小鼠后，其功能得以恢復，并可長時間保持未衰老狀態[15]；而將從年輕大鼠獲得的干細胞移植入老年心肌梗死大鼠心臟后其功能迅速衰退，修復心肌能力下降[16]。BMSCs也不例外，老年個體來源的BMSCs移植療效低于年輕個體來源的BMSCs[14, 17]。在體外用不同濃度H2O2溶液處理BMSCs[18]，發現亞致死氧化應激狀態下BMSCs增殖速度下降，SA-β-gal特異性高表達，細胞呈典型衰老特征，而低氧化應激狀態下BMSCs增殖速度和細胞形態無變化，說明盡管BMSCs表現出了良好的氧化應激耐受性，但特定的細胞微環境可誘導其發生過早衰老。我們將氧化應激誘導的NPCs與BMSCs共培養發現，BMSCs呈現衰老表型：細胞體積增大、細胞扁平，細胞質和細胞核比例增加，核膜內折、核染色質濃縮，細胞質內顆粒或空泡狀物質增多；進一步檢測發現SA-β-gal活性上調。說明BMSCs作為種子細胞對損傷的NPCs進行修復同時，也受到衰老NPCs營造的微環境影響，其自身生物學行為也會發生相應改變。
椎間盤退變是一個多因素參與的慢性過程，遺傳因素、炎性因子、細胞凋亡、營養障礙等均與椎間盤退變相關，細胞的過早衰老在此過程中起核心作用[19-20]。衰老NPCs不僅滯留在G1期停止分裂導致細胞數量丟失，同時還大量表達炎性因子和基質降解酶，惡化鄰近正常細胞賴以生存的微環境，產生更大的破壞效應[12, 20-21]。Transwell共培養體系在實現NPCs與BMSCs非接觸的同時，允許細胞分泌因子自由通過作用于彼此。我們將NPCs與BMSCs按照一定比例進行共培養，發現過早衰老的NPCs通過旁分泌效應下調了共培養的BMSCs增殖能力，且NPCs數量上的優勢使得共培養的BMSCs更早表現出衰老特征。說明衰老的NPCs微環境不利于發揮BMSCs生物學修復功能。
盡管本研究所使用的NPCs與BMSCs來自于不同患者，未考慮遺傳因素對共培養結果的影響，同時氧化應激誘導的NPCs并不能完全模擬椎間盤退變環境下NPCs的自然狀態，但仍在一定程度上反映了在損傷NPCs修復過程中，BMSCs所處的環境因素對其生物學行為有影響。另外，導致BMSCs生物學行為發生改變的NPCs微環境還需進一步量化，其發生機制也有待進一步探討。
