引用本文： 笪琳萃, 龔梅, 王旻, 解慧琪. 新型交聯方法在生物衍生材料中的應用進展. 中國修復重建外科雜志, 2014, 28(6): 777-783. doi: 10.7507/1002-1892.20140172 復制
對于因先天缺失、運動損傷、外傷、疾病等所致的組織損傷或缺損，組織工程技術已逐漸成為重要修復手段[1]。該技術將來還可能為目前尚無法治愈的疾病和組織變性提供解決方案，對人類健康具有深遠影響。目前，生物衍生材料在組織工程中的研究和應用最為廣泛[2]，包括天然細胞外基質（extracellular matrix，ECM）、同種異體組織、膠原、殼聚糖、絲素蛋白、海藻酸鹽等[3]。
生物衍生材料因具有良好的生物相容性、易降解且降解產物無毒副作用、炎性反應低、可誘導和促進組織結構再生和修復等特點，常作為生物支架促進組織和器官重塑[2-5]。然而，生物衍生材料在提取過程中常需使用中性鹽、酸、堿或蛋白酶等，會破壞其天然交聯網絡結構，導致熱穩定性、機械強度和耐水性能無法滿足應用需要[6]。同時直接提取的生物衍生材料存在易降解失效、有結構功能障礙及誘發免疫反應等缺陷，也限制了其臨床應用[7-8]。為解決上述問題，國內外學者們對生物衍生材料進行了交聯或表面處理的研究，以制備出更適合臨床應用的組織工程產品[6, 9]。
傳統的合成交聯劑，如戊二醛、多聚環氧化合物、碳二亞胺等，雖可增強支架材料的機械性能，但存在長期穩定性低、細胞毒性較強、反應速率難以控制，或中間產物不穩定等缺陷[7, 10]。近年來，研究者們開始嘗試其他交聯方法，如光化學交聯、酶交聯以及使用生物交聯劑等對材料進行改性。現對新型交聯方法在生物衍生材料研究領域的應用進展進行綜述，并對各種交聯方法的交聯特點進行討論。
1 化學交聯法
化學交聯法是指在光、熱、高能輻射、機械力、超聲波和交聯劑等的作用下，使高分子化合物間通過化學鍵聯結而形成交聯網絡的方法。生物衍生材料中的生物大分子也可通過該方法發生交聯反應。
1.1 光氧化交聯法
ECM或純膠原中的某些氨基酸能在光敏劑存在情況下，通過光照射（平常只限于紫外線及可見光譜的波長，即200～800 nm）被特異地氧化，發生交聯反應。激活的光敏劑可通過電子轉移或奪氫反應形成游離自由基，這些游離自由基既可直接與目標分子發生共價交聯，也可將能量轉移給氧分子生成單重態氧，進而氧化周圍的目標分子[11]。該法特點是：① 可通過控制激光能量、功率密度、能量密度以及光敏劑濃度等參數來控制交聯反應進程；② 具有一定的空間選擇性；③ 交聯時間短，且交聯效率高達80%；④ 與其他交聯方法相比毒性較小[11]。蛋白質中的色氨酸、酪氨酸、組氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸等均可發生光氧化反應。
Ramesh等[12]將人隱靜脈脫細胞后，以亞甲藍為光敏感劑，紫外光照射下進行光氧化交聯，得到了熔融溫度為126℃、焓值為183.5 J/g、機械強度為250%的支架材料；他們將BALB/c 3T3細胞接種于支架材料上未見形態異常，接種7 d開始細胞明顯增殖，表明其細胞毒性小；將交聯的脫細胞人隱靜脈植入雄性綿羊左側頸內靜脈，術后不進行抗凝治療，術后24周形成具有平滑肌和完整內皮的血管結構，肉眼未見血栓形成，管腔直徑保持不變，說明其能誘導組織再生且具有良好的血液相容性和組織相容性。因此，Ramesh等認為任意脫細胞的人體靜脈均可通過光氧化交聯法制備小尺寸的血管移植物。Lü等[13]將光氧化交聯的脫細胞牛頸靜脈導管植入犬體內，重建了肺動脈和右心室的連接；術后6個月，交聯后的支架材料表現出良好的血流動力學性能和抗鈣化能力，且其血管壁和瓣膜仍較柔軟、光滑。
然而，材料是否能發生光氧化交聯反應取決于其化學和光學特性，有些生物衍生材料如富含蛋白多糖的組織就不適合采用該法交聯。Chan[11]指出，只有既含有能與光敏劑反應的官能團，但自身光學性能又不影響光敏劑對光吸收的生物衍生材料才適合用該法交聯。
1.2 高能輻照交聯法
高能輻照交聯法是指通過電子束照射、γ光子照射等高能輻照使高分子鏈段發生交聯的過程。其交聯原理是：高分子溶液在電子束或γ光子照射下產生自由基，然后不同鏈段上的自由基重新結合形成共價鍵，達到交聯目的[14-15]。該法的交聯過程可控性高、無毒性添加劑，且消毒過程可與交聯過程同時進行[10, 16]。但是，高能輻照產生的自由基可能會破壞支架材料中的生物活性成分，所以含有生長因子等活性物質的生物衍生材料，如脫細胞豬小腸黏膜下層不適合采用該法交聯[14]。
Zhou等[17]發現，將明膠、羧甲基殼聚糖和β-磷酸三鈣的混合溶液先超聲20 min，再在劑量為30 kGy條件下輻照，可獲得β-磷酸三鈣分布均一、孔徑均勻且相互連通、力學性能和降解時間適宜的多孔材料；進一步將材料植入比格犬下頜骨，術后4周未見傷口感染、壞死、水腫以及嚴重炎性反應，micro-CT可觀察到大量骨組織再生，證實其具有良好的生物相容性。Yang等[10]利用γ光子照射制備了不同配比的明膠/羧甲基殼聚糖水凝膠，研究其應用于傷口愈合的可能性。結果表明，該方法制備的水凝膠孔隙均勻且相互貫通，細胞毒性為0級，且NIH 3T3成纖維細胞能在凝膠上生長良好，該凝膠還具有較好的保水性能（10～700 g/ g干膠）、與軟組織相近的壓縮模量以及優良可控的生物降解性能。Huang等[15]還將羧甲基殼聚糖/明膠比例分別為10∶0、6∶4、4∶6、0∶10的水凝膠進行輻照交聯，結果發現，交聯后4∶6組的壓縮模量為70 kPa，顯示了良好的機械性能；同時以不含水凝膠的透明薄膜敷料作為空白對照，將各組材料分別植入全層皮膚缺損創面的SD大鼠模型，10∶0組和6∶4組水凝膠均在術后3周內完全降解，0∶10組幾乎未降解，只有4∶6組水凝膠在術后3周降解了50%，降解性能最佳；術后3、6 d，4∶6組水凝膠的肉芽組織厚于空白對照組（P＜ 0.05）；術后9、12、15 d，4∶6組水凝膠的傷口愈合率顯著高于空白對照組（P＜ 0.05）。由此可見，交聯后的凝膠材料具有良好的生物相容性，可通過誘導肉芽組織生長和加速再上皮化來促進傷口愈合。
1.3 生物交聯劑
生物交聯劑是指來源于生物材料、分子中具有2 個或2個以上活性基團，并且可與其他分子上的氨基、巰基、羥基等發生共價結合而產生交聯作用的試劑。常見生物交聯劑有去甲二氫愈創木酸、京尼平、多醛基葡聚糖、褐藻膠醛等。
1.3.1 去甲二氫愈創木酸
去甲二氫愈創木酸是從綠檀等常青灌木中提取的天然產物，具有抗氧化、抗腫瘤、抗病毒、消炎等多種生物活性[9]。其交聯機制是：去甲二氫愈創木酸末端的兒茶酚基團氧化為有活性的醌基，氧化后的單體既可自身聚合生成聚去甲二氫愈創木酸，也可與蛋白質的自由氨基通過Michael加成反應形成共價鍵，從而穩定生物衍生材料結構，改善其理化性能[18-20]。
有研究表明，去甲二氫愈創木酸可作為一種生物相容性好的低毒交聯劑交聯膠原蛋白。Koob等[18]利用去甲二氫愈創木酸交聯牛腱Ⅰ型膠原，交聯后Ⅰ型膠原纖維的拉伸強度和剛度隨交聯劑用量的增加而增加，且極限抗張強度和彈性模量與天然肌腱相當。Koob等[19]還發現經去甲二氫愈創木酸交聯后的明膠水凝膠熱穩定性從低于37℃增加至80℃以上，且不再溶于離液劑。Lü等[7]發現去甲二氫愈創木酸交聯后的脫細胞心臟瓣膜最大拉伸強度達（17.2 ± 1.7） MPa，是未交聯組的2倍，且高于戊二醛組；最高彈性模量為（21.1 ± 2.6）MPa，與戊二醛組基本一致；交聯的瓣膜支架于PBS中浸泡120 d后，其多孔結構和最大拉伸強度基本保持不變；掃描電鏡結果顯示，內皮細胞能在交聯的支架材料表面上黏附并保持正常形態。這些結果表明，經去甲二氫愈創木酸交聯后的瓣膜支架細胞相容性好，且力學強度、抗酶解性和儲存穩定性得到明顯提高。Ju等[21-22]發現去甲二氫愈創木酸交聯膠原支架可提高植入式葡萄糖傳感器的生物相容性。他們將牛腱Ⅰ型膠原包被于葡萄糖傳感器后分別用去甲二氫愈創木酸和戊二醛處理，得到交聯的膠原支架[21]。然后將其植入大鼠皮下組織，術后4周未見物理變形，炎性反應小；雖然去甲二氫愈創木酸處理組傳感器的靈敏度稍低于無支架的對照組傳感器，但比單純戊二醛處理組更為理想[22]。由此可見，去甲二氫愈創木酸交聯的膠原支架可減少植入物的異物反應，從而延長其使用壽命。
1.3.2 京尼平
京尼平是由茜草科植物梔子中提取的環烯醚萜類化合物，也可由京尼平苷酶解得到[23]，分子式為C11H14O5[24]。其富含的活性羥基和羧基能與含有自由氨基的生物衍生材料發生反應[25-26]。其交聯機制是：① 京尼平上的烯碳原子受到氨基的親核進攻而開環，生成雜環胺化合物；② 京尼平上的酯鍵與氨基發生取代反應，形成分子內或分子間的聚合環狀結構[27-28]。
京尼平已被廣泛應用于ECM、絲素蛋白、明膠和殼聚糖等生物衍生材料的交聯制備工藝。Koch等[8]采用京尼平、戊二醛、碳二亞胺交聯管狀脫細胞豬食管支架，并將其植入SD大鼠模型；僅京尼平組的巨噬細胞浸潤程度較輕，且促進炎性反應的CD163型巨噬細胞顯著減少、皮下組織的成纖維細胞比例增加，說明京尼平可有效抑制移植排斥反應和炎性反應。Silva等[29]利用京尼平交聯殼聚糖和蠶絲素蛋白，凍干后獲得了結構規整的殼聚糖/絲素蛋白海綿；交聯的海綿上細胞存活率接近100%，顯示極低的細胞毒性；并能促進ATDC5細胞的黏附、增殖及軟骨樣ECM分泌，可用作軟骨組織工程的支架材料。Yan等[30]通過對京尼平交聯的膠原/殼聚糖多孔支架材料的研究發現，京尼平交聯可抑制Ⅰ型膠原酶的酶解，有效提升支架材料的生物穩定性，而且支架材料的彈性模量與京尼平的使用濃度成正相關。Jin等[31]還發現京尼平交聯的豬心包斷裂伸長率與拉伸載荷顯著增加，拉伸強度高于碳二亞胺交聯組而低于未交聯組；此外，京尼平交聯的支架材料還有助于受損組織功能的恢復。Chen等[32]用京尼平交聯的明膠導管成功修復了10 mm長大鼠坐骨神經缺損；組織學觀察顯示，大量雪旺細胞包圍的再生無髓神經纖維在術后6周橋接缺損區域；肌肉動作電位曲線的峰波幅和波面積在術后6周和8周均明顯增加，說明神經功能得到一定程度恢復。
但是，梔子果實中的京尼平成分僅占0.005%～ 0.01%，京尼平苷中也只占3.06%～4.12%，盡管已有成熟的提取方法，但提取過程仍相對復雜[33]。有研究表明，京尼平可能會影響細胞的基因表達，且其低毒性具有一定種屬和細胞特異性[34]。京尼平在水溶液中不穩定，且交聯產物顏色深、交聯時間較長[35]。此外，市售的京尼平價格為150～200元/g，與其他交聯劑相比較昂貴[34]。上述不足在一定程度上限制了京尼平的廣泛應用。
1.3.3 氧化海藻酸鈉
海藻酸鈉的羥基基團可被高碘酸鈉氧化，生成氧化海藻酸鈉。它屬于多官能團的高分子交聯劑，含有以醛基為主的多種可供交聯的官能團，是有效的蛋白質或亞基交聯劑[36-37]。氧化海藻酸鈉的價格相對低廉，氧化度＜ 50%時的細胞毒性為0～2級，氧化度越高其細胞毒性越強[37]。其交聯機制[36]與戊二醛的交聯機制相似，即氧化海藻酸鈉的醛基在水中與富含氨基、羥基的分子（如蛋白質、含胺多糖等）反應，形成Schiff堿后，再與其他分子反應形成立體網狀結構。
Balakrishnan等[38]在弱堿性條件下，利用氧化海藻酸鈉交聯明膠，獲得了可注射的降解型生物支架材料；膠凝時間一般隨氧化海藻酸鈉、明膠以及硼砂的濃度增加而減少，組織的交聯程度隨藻酸鹽的氧化程度增加而增加，而溶脹比和溶脹程度則隨氧化程度的增加而降低；37℃下用交聯材料浸提液孵育L929小鼠成纖維細胞24 h，93%的細胞代謝活躍，與空白對照組（含血清的DMEM細胞）無顯著差異，顯示極低的細胞毒性。Xu等[36]采用氧化海藻酸鈉、戊二醛和多聚環氧化合物3種交聯劑分別處理脫細胞豬主動脈，結果顯示3組材料的交聯系數均隨交聯時間增加而顯著提高，反應7 h后達峰值；氧化海藻酸鈉組的交聯速率和交聯指數最佳，其機械性能與戊二醛組相當并優于多聚環氧化合物；而且氧化海藻酸鈉交聯組的自然結構保存完好，細胞毒性顯著低于戊二醛和多聚環氧化合物交聯的組織。李莉等[5]還發現與京尼平相比，氧化海藻酸鈉處理血管組織，其交聯時間更短、交聯速率更快且交聯程度更佳；交聯后的組織力學性能更接近于新鮮組織，且細胞毒性和細胞黏附能力均與京尼平相似。因而，可以認為氧化海藻酸鈉是一種有效的生物組織交聯劑。
1.3.4 多醛基葡聚糖
多醛基葡聚糖（氧化葡聚糖）是葡聚糖適度氧化生成的高分子葡萄糖聚合物，它能與具有游離氨基的大分子物質發生交聯反應，交聯機制與氧化海藻酸鈉相似[39]。如明膠的賴氨酸和羥賴氨酸的氨基殘基就可與多醛基葡聚糖反應生成Schiff堿。相同溫度、時間下，葡聚糖的氧化度與氧化劑高碘酸鈉的濃度相關。而葡聚糖的氧化度越高，醛基的暴露程度就越大，多醛基葡聚糖的交聯度也隨之增高。
多醛基葡聚糖交聯生物衍生材料的優點有交聯效率高、機械性能好以及炎性反應弱等，主要不足是細胞毒性相比其他生物交聯劑較強。Draye等[40]制備了多醛基葡聚糖交聯的明膠傷口敷料，體外實驗結果表明，交聯敷料的細胞毒性在可接受范圍內；將敷料植入小鼠皮下只引起較弱且逐漸消退的炎性反應，未見細胞變性或異常的細胞形貌，說明其具有良好的生物相容性。Mateo等[41]還發現用多醛基葡聚糖交聯得到的固定化腈水解酶的活力回收可達50%～60%，而戊二醛交聯則導致酶完全失活；而且多醛基葡聚糖固定的青霉素G酰化酶的活力回收可達到90%。這可能是由于多醛基葡聚糖的大分子結構不能穿透蛋白活性位點，因而不能與催化必需的氨基酸殘基反應。同理，多醛基葡聚糖交聯的支架材料上的某些活性成分也可能不會被破壞，但目前未見相關研究報道。
此外，可發生化學交聯的生物交聯劑還有橄欖苦苷[42]、藻酸[43]以及植酸[44]等。研究表明，它們均具有良好的細胞相容性和血液相容性，交聯產物具有理想的機械性能。因此，它們也適合作為交聯劑應用于生物醫學領域。
2 物理交聯法
物理交聯的生物衍生材料是指由于分子纏繞、鹽鍵、氫鍵及疏水作用等存在而形成的網絡結構。通過離子的相互作用力交聯是典型的物理交聯。聚電解質如殼聚糖、海藻酸鹽等，可與帶相反電荷的多價離子或聚電解質通過離子的相互作用而鍵合，形成物理交聯型水凝膠[45]。
Nie等[46]使用Na+交聯魔芋葡甘聚糖/殼聚糖復合材料，提高其生物穩定性，并將制得的支架材料用于骨組織修復。Kuo等[47]將D-葡萄糖酸-δ-內酯作為Ca2+的載體，制備了凝膠速率可控、結構均一的海藻酸鹽水凝膠，該凝膠的機械性能取決于交聯時各組分的配比；他們發現，凝膠速率低的水凝膠更加均一且機械強度更高；凝膠的壓縮模量和強度隨藻酸鹽濃度、總鈣含量、藻酸鹽的相對分子質量和古洛糖醛酸含量增加而增加。值得注意的是，Ca2+與海藻酸鹽的交聯反應是可逆的。Gillette等[48]發現可將檸檬酸鈉作為Ca2+螯合劑奪取海藻酸鹽交聯網絡中的Ca2+，使其發生交聯反應的逆反應。他們利用這一特性制備了膠原/海藻酸鹽雙組分水凝膠，通過反復改變海藻酸鹽的交聯程度研究三維ECM的動態變化對細胞行為的影響。兩種帶異種電荷的聚電解質也可通過離子的相互作用交聯[49]，其結合強度高于氫鍵、范德華力等次級鍵，且具有可逆性，安全隱患較小，但是聚電解質的選擇難度較高[50]。
通過氫鍵進行交聯也是物理交聯法的一個分支，如原花青素分子中的酚羥基可與蛋白肽鏈中的酰胺基等基團形成氫鍵，達到交聯改性的目的[51]。研究表明[52]，原花青素交聯的材料力學性能、組織變性溫度、抗酶解能力等均有所改善。而且，He等[6]通過傅里葉變換紅外光譜、原子力顯微鏡等測試分析，發現原花青素交聯處理的膠原蛋白三螺旋構象并未破壞，且改善了膠原蛋白膜的疏水性能和熱穩定性能。槲皮素分子中的酚羥基也可與生物衍生材料中蛋白質的羰基、羥基等自由基團形成氫鍵交聯[53]。Zhai等[53]評價了槲皮素交聯的脫細胞豬主動脈瓣，結果表明槲皮素交聯的主動脈瓣不僅抗鈣化、抗中性粒細胞膠原酶酶解，而且其拉伸強度優于戊二醛交聯的主動脈瓣，在D-Hank溶液浸泡30 d后其拉伸強度和彈性無明顯損失。槲皮素對血管內皮細胞的毒性閾值為1 μg/mL，其細胞毒性比戊二醛低100倍。
此外，溫敏凝膠如殼聚糖則可在接近低臨界溶解溫度時因分子運動加劇，分子鏈相互纏繞而發生液態和凝膠態的相互轉變[45, 50, 54]。但是，在物理交聯型水凝膠中，分子間的纏繞、疏水相互作用或離子鍵合區域也會形成簇團結構，因此造成凝膠的不均勻性，同時自由鏈端和鏈環也會產生瞬時的網絡缺陷[45]。
3 生物交聯法
一些酶如轉谷氨酰胺酶[55]、辣根過氧化物酶[56]、酪氨酸酶[57-58]、賴氨酰氧化酶[59]等可在特定的pH值和溫度下催化生物衍生材料發生交聯反應[60]，這種交聯方法稱為酶交聯法。它具有酶催化反應的所有優點，如高效、高選擇性、交聯速率可控、反應條件溫和等，還可避免有毒交聯劑的帶入[61]。但是其高選擇性也在一定程度上限制了在生物衍生材料交聯改性中的應用，如微生物轉谷氨酰胺酶可以交聯Ⅰ型膠原，卻無法交聯天然膠原，如牛皮膠原蛋白粉[62]。
轉谷氨酰胺酶又稱谷氨酰胺胺酶，參與細胞黏附、分化、死亡和維護ECM穩定性等多種生理功能，是一種依賴Ca2+催化酰基轉移反應的酶[61]。它以肽鍵中谷氨酰胺殘基的γ-羧酰胺基作為酰基的供體，以多肽鏈中賴氨酰殘基ε-氨基作為酰基的受體，形成蛋白質分子內和分子間的酰胺鍵，使蛋白質分子發生交聯，維護組織的穩定性，提高材料的機械性能[61]。轉谷氨酰胺酶家族成員--組織型轉谷氨酰胺酶對創傷愈合有促進作用，組織損傷區域積累的組織型轉谷氨酰胺酶可交聯ECM中某些成分，尤其是膠原蛋白和纖連蛋白，加速其沉積速率，還可通過影響TGF-β1的激活來減輕炎性反應，因此它本身可能就是一種促進傷口愈合、防止瘢痕形成的治療方法[63]。
Westhaus等[64]利用轉谷氨酰胺酶的Ca2+依賴型催化機制，設計了原位交聯體系。他將脂質體作為Ca2+的載體，將其與纖維蛋白原以及Ca2+依賴型轉谷氨酰胺酶制備成液態混合物，該液態混合物可在37℃迅速凝膠化，其原理是脂質體在37℃時不穩定，釋放的Ca2+激活轉谷氨酰胺酶；這種凝膠系統可通過注射方式修復受損組織。Chau等[65]用組織型轉谷氨酰胺酶和微生物轉谷氨酰胺酶處理Ⅰ型膠原，改善膠原的細胞相容性。與未處理的膠原相比，人成骨細胞和人包皮成纖維細胞均能在支架材料上更好黏附、鋪展和分化；人成骨細胞的ALP活性以及骨橋蛋白表達量顯著增高，且隨著轉谷氨酰胺酶的濃度增加而增加；此外，酶交聯還能有效抑制細胞內源蛋白酶的酶解。Lee等[66]還發現用轉谷氨酰胺酶處理的Ⅰ型膠原剛度增加，而材料交聯前后的孔隙率和孔徑無變化。
此外，酶交聯法還可與物理交聯法聯合使用。Wen等[67]先利用轉谷氨酰胺酶交聯明膠/海藻酸鹽中的明膠成分，再利用Ca2+交聯海藻酸鹽成分，制備了具有互穿聚合物網絡結構的材料。
4 結論與展望
近年來，生物衍生材料的研發取得了很大進展，其中新發現的可用于材料制備的交聯劑和交聯方法為生物衍生材料研究作出了巨大貢獻。各種交聯方法均有一定局限性，我們可以針對特定的生物衍生材料選擇合適交聯方法，使其在保持優良生物相容性和組織修復能力的同時，獲得良好的機械性能、抗降解性能等。如含有不穩定生物活性物質或活細胞的生物衍生材料往往要求溫和的反應條件且無有機溶劑、交聯劑殘留；為避免殘留的交聯劑使材料中活性物質變性，保證水凝膠所包埋物質的完整性，我們可采用酶交聯或物理交聯法如離子交聯對材料進行交聯改性。對于雙組分或多組分的生物衍生復合材料，可能需聯合使用兩種或多種交聯方法。
雖然這些交聯方法仍存在不足，但是它們交聯的生物衍生材料的細胞毒性均較傳統化學交聯劑低，生物相容性好，且顯著改善了材料的各項性能，如力學性能和降解性能等。它們為生物衍生材料的交聯改性提供了更多選擇，有助于得到更適用于臨床的組織工程產品。相信在國內外研究者的共同努力下，隨著各種交聯機制研究的不斷深入和交聯方法的不斷完善，有望更精確控制材料的交聯度，更大程度降低細胞毒性和免疫原性，獲得更適合臨床應用的生物衍生材料，進一步推動轉化醫學發展。
對于因先天缺失、運動損傷、外傷、疾病等所致的組織損傷或缺損，組織工程技術已逐漸成為重要修復手段[1]。該技術將來還可能為目前尚無法治愈的疾病和組織變性提供解決方案，對人類健康具有深遠影響。目前，生物衍生材料在組織工程中的研究和應用最為廣泛[2]，包括天然細胞外基質（extracellular matrix，ECM）、同種異體組織、膠原、殼聚糖、絲素蛋白、海藻酸鹽等[3]。
生物衍生材料因具有良好的生物相容性、易降解且降解產物無毒副作用、炎性反應低、可誘導和促進組織結構再生和修復等特點，常作為生物支架促進組織和器官重塑[2-5]。然而，生物衍生材料在提取過程中常需使用中性鹽、酸、堿或蛋白酶等，會破壞其天然交聯網絡結構，導致熱穩定性、機械強度和耐水性能無法滿足應用需要[6]。同時直接提取的生物衍生材料存在易降解失效、有結構功能障礙及誘發免疫反應等缺陷，也限制了其臨床應用[7-8]。為解決上述問題，國內外學者們對生物衍生材料進行了交聯或表面處理的研究，以制備出更適合臨床應用的組織工程產品[6, 9]。
傳統的合成交聯劑，如戊二醛、多聚環氧化合物、碳二亞胺等，雖可增強支架材料的機械性能，但存在長期穩定性低、細胞毒性較強、反應速率難以控制，或中間產物不穩定等缺陷[7, 10]。近年來，研究者們開始嘗試其他交聯方法，如光化學交聯、酶交聯以及使用生物交聯劑等對材料進行改性。現對新型交聯方法在生物衍生材料研究領域的應用進展進行綜述，并對各種交聯方法的交聯特點進行討論。
1 化學交聯法
化學交聯法是指在光、熱、高能輻射、機械力、超聲波和交聯劑等的作用下，使高分子化合物間通過化學鍵聯結而形成交聯網絡的方法。生物衍生材料中的生物大分子也可通過該方法發生交聯反應。
1.1 光氧化交聯法
ECM或純膠原中的某些氨基酸能在光敏劑存在情況下，通過光照射（平常只限于紫外線及可見光譜的波長，即200～800 nm）被特異地氧化，發生交聯反應。激活的光敏劑可通過電子轉移或奪氫反應形成游離自由基，這些游離自由基既可直接與目標分子發生共價交聯，也可將能量轉移給氧分子生成單重態氧，進而氧化周圍的目標分子[11]。該法特點是：① 可通過控制激光能量、功率密度、能量密度以及光敏劑濃度等參數來控制交聯反應進程；② 具有一定的空間選擇性；③ 交聯時間短，且交聯效率高達80%；④ 與其他交聯方法相比毒性較小[11]。蛋白質中的色氨酸、酪氨酸、組氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸等均可發生光氧化反應。
Ramesh等[12]將人隱靜脈脫細胞后，以亞甲藍為光敏感劑，紫外光照射下進行光氧化交聯，得到了熔融溫度為126℃、焓值為183.5 J/g、機械強度為250%的支架材料；他們將BALB/c 3T3細胞接種于支架材料上未見形態異常，接種7 d開始細胞明顯增殖，表明其細胞毒性小；將交聯的脫細胞人隱靜脈植入雄性綿羊左側頸內靜脈，術后不進行抗凝治療，術后24周形成具有平滑肌和完整內皮的血管結構，肉眼未見血栓形成，管腔直徑保持不變，說明其能誘導組織再生且具有良好的血液相容性和組織相容性。因此，Ramesh等認為任意脫細胞的人體靜脈均可通過光氧化交聯法制備小尺寸的血管移植物。Lü等[13]將光氧化交聯的脫細胞牛頸靜脈導管植入犬體內，重建了肺動脈和右心室的連接；術后6個月，交聯后的支架材料表現出良好的血流動力學性能和抗鈣化能力，且其血管壁和瓣膜仍較柔軟、光滑。
然而，材料是否能發生光氧化交聯反應取決于其化學和光學特性，有些生物衍生材料如富含蛋白多糖的組織就不適合采用該法交聯。Chan[11]指出，只有既含有能與光敏劑反應的官能團，但自身光學性能又不影響光敏劑對光吸收的生物衍生材料才適合用該法交聯。
1.2 高能輻照交聯法
高能輻照交聯法是指通過電子束照射、γ光子照射等高能輻照使高分子鏈段發生交聯的過程。其交聯原理是：高分子溶液在電子束或γ光子照射下產生自由基，然后不同鏈段上的自由基重新結合形成共價鍵，達到交聯目的[14-15]。該法的交聯過程可控性高、無毒性添加劑，且消毒過程可與交聯過程同時進行[10, 16]。但是，高能輻照產生的自由基可能會破壞支架材料中的生物活性成分，所以含有生長因子等活性物質的生物衍生材料，如脫細胞豬小腸黏膜下層不適合采用該法交聯[14]。
Zhou等[17]發現，將明膠、羧甲基殼聚糖和β-磷酸三鈣的混合溶液先超聲20 min，再在劑量為30 kGy條件下輻照，可獲得β-磷酸三鈣分布均一、孔徑均勻且相互連通、力學性能和降解時間適宜的多孔材料；進一步將材料植入比格犬下頜骨，術后4周未見傷口感染、壞死、水腫以及嚴重炎性反應，micro-CT可觀察到大量骨組織再生，證實其具有良好的生物相容性。Yang等[10]利用γ光子照射制備了不同配比的明膠/羧甲基殼聚糖水凝膠，研究其應用于傷口愈合的可能性。結果表明，該方法制備的水凝膠孔隙均勻且相互貫通，細胞毒性為0級，且NIH 3T3成纖維細胞能在凝膠上生長良好，該凝膠還具有較好的保水性能（10～700 g/ g干膠）、與軟組織相近的壓縮模量以及優良可控的生物降解性能。Huang等[15]還將羧甲基殼聚糖/明膠比例分別為10∶0、6∶4、4∶6、0∶10的水凝膠進行輻照交聯，結果發現，交聯后4∶6組的壓縮模量為70 kPa，顯示了良好的機械性能；同時以不含水凝膠的透明薄膜敷料作為空白對照，將各組材料分別植入全層皮膚缺損創面的SD大鼠模型，10∶0組和6∶4組水凝膠均在術后3周內完全降解，0∶10組幾乎未降解，只有4∶6組水凝膠在術后3周降解了50%，降解性能最佳；術后3、6 d，4∶6組水凝膠的肉芽組織厚于空白對照組（P＜ 0.05）；術后9、12、15 d，4∶6組水凝膠的傷口愈合率顯著高于空白對照組（P＜ 0.05）。由此可見，交聯后的凝膠材料具有良好的生物相容性，可通過誘導肉芽組織生長和加速再上皮化來促進傷口愈合。
1.3 生物交聯劑
生物交聯劑是指來源于生物材料、分子中具有2 個或2個以上活性基團，并且可與其他分子上的氨基、巰基、羥基等發生共價結合而產生交聯作用的試劑。常見生物交聯劑有去甲二氫愈創木酸、京尼平、多醛基葡聚糖、褐藻膠醛等。
1.3.1 去甲二氫愈創木酸
去甲二氫愈創木酸是從綠檀等常青灌木中提取的天然產物，具有抗氧化、抗腫瘤、抗病毒、消炎等多種生物活性[9]。其交聯機制是：去甲二氫愈創木酸末端的兒茶酚基團氧化為有活性的醌基，氧化后的單體既可自身聚合生成聚去甲二氫愈創木酸，也可與蛋白質的自由氨基通過Michael加成反應形成共價鍵，從而穩定生物衍生材料結構，改善其理化性能[18-20]。
有研究表明，去甲二氫愈創木酸可作為一種生物相容性好的低毒交聯劑交聯膠原蛋白。Koob等[18]利用去甲二氫愈創木酸交聯牛腱Ⅰ型膠原，交聯后Ⅰ型膠原纖維的拉伸強度和剛度隨交聯劑用量的增加而增加，且極限抗張強度和彈性模量與天然肌腱相當。Koob等[19]還發現經去甲二氫愈創木酸交聯后的明膠水凝膠熱穩定性從低于37℃增加至80℃以上，且不再溶于離液劑。Lü等[7]發現去甲二氫愈創木酸交聯后的脫細胞心臟瓣膜最大拉伸強度達（17.2 ± 1.7） MPa，是未交聯組的2倍，且高于戊二醛組；最高彈性模量為（21.1 ± 2.6）MPa，與戊二醛組基本一致；交聯的瓣膜支架于PBS中浸泡120 d后，其多孔結構和最大拉伸強度基本保持不變；掃描電鏡結果顯示，內皮細胞能在交聯的支架材料表面上黏附并保持正常形態。這些結果表明，經去甲二氫愈創木酸交聯后的瓣膜支架細胞相容性好，且力學強度、抗酶解性和儲存穩定性得到明顯提高。Ju等[21-22]發現去甲二氫愈創木酸交聯膠原支架可提高植入式葡萄糖傳感器的生物相容性。他們將牛腱Ⅰ型膠原包被于葡萄糖傳感器后分別用去甲二氫愈創木酸和戊二醛處理，得到交聯的膠原支架[21]。然后將其植入大鼠皮下組織，術后4周未見物理變形，炎性反應小；雖然去甲二氫愈創木酸處理組傳感器的靈敏度稍低于無支架的對照組傳感器，但比單純戊二醛處理組更為理想[22]。由此可見，去甲二氫愈創木酸交聯的膠原支架可減少植入物的異物反應，從而延長其使用壽命。
1.3.2 京尼平
京尼平是由茜草科植物梔子中提取的環烯醚萜類化合物，也可由京尼平苷酶解得到[23]，分子式為C11H14O5[24]。其富含的活性羥基和羧基能與含有自由氨基的生物衍生材料發生反應[25-26]。其交聯機制是：① 京尼平上的烯碳原子受到氨基的親核進攻而開環，生成雜環胺化合物；② 京尼平上的酯鍵與氨基發生取代反應，形成分子內或分子間的聚合環狀結構[27-28]。
京尼平已被廣泛應用于ECM、絲素蛋白、明膠和殼聚糖等生物衍生材料的交聯制備工藝。Koch等[8]采用京尼平、戊二醛、碳二亞胺交聯管狀脫細胞豬食管支架，并將其植入SD大鼠模型；僅京尼平組的巨噬細胞浸潤程度較輕，且促進炎性反應的CD163型巨噬細胞顯著減少、皮下組織的成纖維細胞比例增加，說明京尼平可有效抑制移植排斥反應和炎性反應。Silva等[29]利用京尼平交聯殼聚糖和蠶絲素蛋白，凍干后獲得了結構規整的殼聚糖/絲素蛋白海綿；交聯的海綿上細胞存活率接近100%，顯示極低的細胞毒性；并能促進ATDC5細胞的黏附、增殖及軟骨樣ECM分泌，可用作軟骨組織工程的支架材料。Yan等[30]通過對京尼平交聯的膠原/殼聚糖多孔支架材料的研究發現，京尼平交聯可抑制Ⅰ型膠原酶的酶解，有效提升支架材料的生物穩定性，而且支架材料的彈性模量與京尼平的使用濃度成正相關。Jin等[31]還發現京尼平交聯的豬心包斷裂伸長率與拉伸載荷顯著增加，拉伸強度高于碳二亞胺交聯組而低于未交聯組；此外，京尼平交聯的支架材料還有助于受損組織功能的恢復。Chen等[32]用京尼平交聯的明膠導管成功修復了10 mm長大鼠坐骨神經缺損；組織學觀察顯示，大量雪旺細胞包圍的再生無髓神經纖維在術后6周橋接缺損區域；肌肉動作電位曲線的峰波幅和波面積在術后6周和8周均明顯增加，說明神經功能得到一定程度恢復。
但是，梔子果實中的京尼平成分僅占0.005%～ 0.01%，京尼平苷中也只占3.06%～4.12%，盡管已有成熟的提取方法，但提取過程仍相對復雜[33]。有研究表明，京尼平可能會影響細胞的基因表達，且其低毒性具有一定種屬和細胞特異性[34]。京尼平在水溶液中不穩定，且交聯產物顏色深、交聯時間較長[35]。此外，市售的京尼平價格為150～200元/g，與其他交聯劑相比較昂貴[34]。上述不足在一定程度上限制了京尼平的廣泛應用。
1.3.3 氧化海藻酸鈉
海藻酸鈉的羥基基團可被高碘酸鈉氧化，生成氧化海藻酸鈉。它屬于多官能團的高分子交聯劑，含有以醛基為主的多種可供交聯的官能團，是有效的蛋白質或亞基交聯劑[36-37]。氧化海藻酸鈉的價格相對低廉，氧化度＜ 50%時的細胞毒性為0～2級，氧化度越高其細胞毒性越強[37]。其交聯機制[36]與戊二醛的交聯機制相似，即氧化海藻酸鈉的醛基在水中與富含氨基、羥基的分子（如蛋白質、含胺多糖等）反應，形成Schiff堿后，再與其他分子反應形成立體網狀結構。
Balakrishnan等[38]在弱堿性條件下，利用氧化海藻酸鈉交聯明膠，獲得了可注射的降解型生物支架材料；膠凝時間一般隨氧化海藻酸鈉、明膠以及硼砂的濃度增加而減少，組織的交聯程度隨藻酸鹽的氧化程度增加而增加，而溶脹比和溶脹程度則隨氧化程度的增加而降低；37℃下用交聯材料浸提液孵育L929小鼠成纖維細胞24 h，93%的細胞代謝活躍，與空白對照組（含血清的DMEM細胞）無顯著差異，顯示極低的細胞毒性。Xu等[36]采用氧化海藻酸鈉、戊二醛和多聚環氧化合物3種交聯劑分別處理脫細胞豬主動脈，結果顯示3組材料的交聯系數均隨交聯時間增加而顯著提高，反應7 h后達峰值；氧化海藻酸鈉組的交聯速率和交聯指數最佳，其機械性能與戊二醛組相當并優于多聚環氧化合物；而且氧化海藻酸鈉交聯組的自然結構保存完好，細胞毒性顯著低于戊二醛和多聚環氧化合物交聯的組織。李莉等[5]還發現與京尼平相比，氧化海藻酸鈉處理血管組織，其交聯時間更短、交聯速率更快且交聯程度更佳；交聯后的組織力學性能更接近于新鮮組織，且細胞毒性和細胞黏附能力均與京尼平相似。因而，可以認為氧化海藻酸鈉是一種有效的生物組織交聯劑。
1.3.4 多醛基葡聚糖
多醛基葡聚糖（氧化葡聚糖）是葡聚糖適度氧化生成的高分子葡萄糖聚合物，它能與具有游離氨基的大分子物質發生交聯反應，交聯機制與氧化海藻酸鈉相似[39]。如明膠的賴氨酸和羥賴氨酸的氨基殘基就可與多醛基葡聚糖反應生成Schiff堿。相同溫度、時間下，葡聚糖的氧化度與氧化劑高碘酸鈉的濃度相關。而葡聚糖的氧化度越高，醛基的暴露程度就越大，多醛基葡聚糖的交聯度也隨之增高。
多醛基葡聚糖交聯生物衍生材料的優點有交聯效率高、機械性能好以及炎性反應弱等，主要不足是細胞毒性相比其他生物交聯劑較強。Draye等[40]制備了多醛基葡聚糖交聯的明膠傷口敷料，體外實驗結果表明，交聯敷料的細胞毒性在可接受范圍內；將敷料植入小鼠皮下只引起較弱且逐漸消退的炎性反應，未見細胞變性或異常的細胞形貌，說明其具有良好的生物相容性。Mateo等[41]還發現用多醛基葡聚糖交聯得到的固定化腈水解酶的活力回收可達50%～60%，而戊二醛交聯則導致酶完全失活；而且多醛基葡聚糖固定的青霉素G酰化酶的活力回收可達到90%。這可能是由于多醛基葡聚糖的大分子結構不能穿透蛋白活性位點，因而不能與催化必需的氨基酸殘基反應。同理，多醛基葡聚糖交聯的支架材料上的某些活性成分也可能不會被破壞，但目前未見相關研究報道。
此外，可發生化學交聯的生物交聯劑還有橄欖苦苷[42]、藻酸[43]以及植酸[44]等。研究表明，它們均具有良好的細胞相容性和血液相容性，交聯產物具有理想的機械性能。因此，它們也適合作為交聯劑應用于生物醫學領域。
2 物理交聯法
物理交聯的生物衍生材料是指由于分子纏繞、鹽鍵、氫鍵及疏水作用等存在而形成的網絡結構。通過離子的相互作用力交聯是典型的物理交聯。聚電解質如殼聚糖、海藻酸鹽等，可與帶相反電荷的多價離子或聚電解質通過離子的相互作用而鍵合，形成物理交聯型水凝膠[45]。
Nie等[46]使用Na+交聯魔芋葡甘聚糖/殼聚糖復合材料，提高其生物穩定性，并將制得的支架材料用于骨組織修復。Kuo等[47]將D-葡萄糖酸-δ-內酯作為Ca2+的載體，制備了凝膠速率可控、結構均一的海藻酸鹽水凝膠，該凝膠的機械性能取決于交聯時各組分的配比；他們發現，凝膠速率低的水凝膠更加均一且機械強度更高；凝膠的壓縮模量和強度隨藻酸鹽濃度、總鈣含量、藻酸鹽的相對分子質量和古洛糖醛酸含量增加而增加。值得注意的是，Ca2+與海藻酸鹽的交聯反應是可逆的。Gillette等[48]發現可將檸檬酸鈉作為Ca2+螯合劑奪取海藻酸鹽交聯網絡中的Ca2+，使其發生交聯反應的逆反應。他們利用這一特性制備了膠原/海藻酸鹽雙組分水凝膠，通過反復改變海藻酸鹽的交聯程度研究三維ECM的動態變化對細胞行為的影響。兩種帶異種電荷的聚電解質也可通過離子的相互作用交聯[49]，其結合強度高于氫鍵、范德華力等次級鍵，且具有可逆性，安全隱患較小，但是聚電解質的選擇難度較高[50]。
通過氫鍵進行交聯也是物理交聯法的一個分支，如原花青素分子中的酚羥基可與蛋白肽鏈中的酰胺基等基團形成氫鍵，達到交聯改性的目的[51]。研究表明[52]，原花青素交聯的材料力學性能、組織變性溫度、抗酶解能力等均有所改善。而且，He等[6]通過傅里葉變換紅外光譜、原子力顯微鏡等測試分析，發現原花青素交聯處理的膠原蛋白三螺旋構象并未破壞，且改善了膠原蛋白膜的疏水性能和熱穩定性能。槲皮素分子中的酚羥基也可與生物衍生材料中蛋白質的羰基、羥基等自由基團形成氫鍵交聯[53]。Zhai等[53]評價了槲皮素交聯的脫細胞豬主動脈瓣，結果表明槲皮素交聯的主動脈瓣不僅抗鈣化、抗中性粒細胞膠原酶酶解，而且其拉伸強度優于戊二醛交聯的主動脈瓣，在D-Hank溶液浸泡30 d后其拉伸強度和彈性無明顯損失。槲皮素對血管內皮細胞的毒性閾值為1 μg/mL，其細胞毒性比戊二醛低100倍。
此外，溫敏凝膠如殼聚糖則可在接近低臨界溶解溫度時因分子運動加劇，分子鏈相互纏繞而發生液態和凝膠態的相互轉變[45, 50, 54]。但是，在物理交聯型水凝膠中，分子間的纏繞、疏水相互作用或離子鍵合區域也會形成簇團結構，因此造成凝膠的不均勻性，同時自由鏈端和鏈環也會產生瞬時的網絡缺陷[45]。
3 生物交聯法
一些酶如轉谷氨酰胺酶[55]、辣根過氧化物酶[56]、酪氨酸酶[57-58]、賴氨酰氧化酶[59]等可在特定的pH值和溫度下催化生物衍生材料發生交聯反應[60]，這種交聯方法稱為酶交聯法。它具有酶催化反應的所有優點，如高效、高選擇性、交聯速率可控、反應條件溫和等，還可避免有毒交聯劑的帶入[61]。但是其高選擇性也在一定程度上限制了在生物衍生材料交聯改性中的應用，如微生物轉谷氨酰胺酶可以交聯Ⅰ型膠原，卻無法交聯天然膠原，如牛皮膠原蛋白粉[62]。
轉谷氨酰胺酶又稱谷氨酰胺胺酶，參與細胞黏附、分化、死亡和維護ECM穩定性等多種生理功能，是一種依賴Ca2+催化酰基轉移反應的酶[61]。它以肽鍵中谷氨酰胺殘基的γ-羧酰胺基作為酰基的供體，以多肽鏈中賴氨酰殘基ε-氨基作為酰基的受體，形成蛋白質分子內和分子間的酰胺鍵，使蛋白質分子發生交聯，維護組織的穩定性，提高材料的機械性能[61]。轉谷氨酰胺酶家族成員--組織型轉谷氨酰胺酶對創傷愈合有促進作用，組織損傷區域積累的組織型轉谷氨酰胺酶可交聯ECM中某些成分，尤其是膠原蛋白和纖連蛋白，加速其沉積速率，還可通過影響TGF-β1的激活來減輕炎性反應，因此它本身可能就是一種促進傷口愈合、防止瘢痕形成的治療方法[63]。
Westhaus等[64]利用轉谷氨酰胺酶的Ca2+依賴型催化機制，設計了原位交聯體系。他將脂質體作為Ca2+的載體，將其與纖維蛋白原以及Ca2+依賴型轉谷氨酰胺酶制備成液態混合物，該液態混合物可在37℃迅速凝膠化，其原理是脂質體在37℃時不穩定，釋放的Ca2+激活轉谷氨酰胺酶；這種凝膠系統可通過注射方式修復受損組織。Chau等[65]用組織型轉谷氨酰胺酶和微生物轉谷氨酰胺酶處理Ⅰ型膠原，改善膠原的細胞相容性。與未處理的膠原相比，人成骨細胞和人包皮成纖維細胞均能在支架材料上更好黏附、鋪展和分化；人成骨細胞的ALP活性以及骨橋蛋白表達量顯著增高，且隨著轉谷氨酰胺酶的濃度增加而增加；此外，酶交聯還能有效抑制細胞內源蛋白酶的酶解。Lee等[66]還發現用轉谷氨酰胺酶處理的Ⅰ型膠原剛度增加，而材料交聯前后的孔隙率和孔徑無變化。
此外，酶交聯法還可與物理交聯法聯合使用。Wen等[67]先利用轉谷氨酰胺酶交聯明膠/海藻酸鹽中的明膠成分，再利用Ca2+交聯海藻酸鹽成分，制備了具有互穿聚合物網絡結構的材料。
4 結論與展望
近年來，生物衍生材料的研發取得了很大進展，其中新發現的可用于材料制備的交聯劑和交聯方法為生物衍生材料研究作出了巨大貢獻。各種交聯方法均有一定局限性，我們可以針對特定的生物衍生材料選擇合適交聯方法，使其在保持優良生物相容性和組織修復能力的同時，獲得良好的機械性能、抗降解性能等。如含有不穩定生物活性物質或活細胞的生物衍生材料往往要求溫和的反應條件且無有機溶劑、交聯劑殘留；為避免殘留的交聯劑使材料中活性物質變性，保證水凝膠所包埋物質的完整性，我們可采用酶交聯或物理交聯法如離子交聯對材料進行交聯改性。對于雙組分或多組分的生物衍生復合材料，可能需聯合使用兩種或多種交聯方法。
雖然這些交聯方法仍存在不足，但是它們交聯的生物衍生材料的細胞毒性均較傳統化學交聯劑低，生物相容性好，且顯著改善了材料的各項性能，如力學性能和降解性能等。它們為生物衍生材料的交聯改性提供了更多選擇，有助于得到更適用于臨床的組織工程產品。相信在國內外研究者的共同努力下，隨著各種交聯機制研究的不斷深入和交聯方法的不斷完善，有望更精確控制材料的交聯度，更大程度降低細胞毒性和免疫原性，獲得更適合臨床應用的生物衍生材料，進一步推動轉化醫學發展。