引用本文： 王磊, 段答, 趙振宇, 滕曉華, 劉波, 葛麗特, 盧明. 嗅鞘細胞無血清上清液誘導C17.2神經干細胞定向分化及分化后細胞活力檢測. 中國修復重建外科雜志, 2014, 28(5): 633-638. doi: 10.7507/1002-1892.20140140 復制
神經干細胞（neural stem cells，NSCs）是一類能自我更新、增殖及向3種神經類型細胞分化的成體干細胞，在中樞神經系統損傷后的神經修復和再生中具有重要作用。研究表明，NSCs的分化方向受局部微環境調控，包括周圍相聯系的各種細胞、細胞外基質和體內各種細胞因子等[1-6]，其中主要調控機制為各種細胞分泌的細胞因子、蛋白及細胞間的相互作用。
NSCs與神經元生長、發育所需局部微環境并不完全相同，經NSCs誘導分化的終末細胞（神經元、星形膠質細胞和少突膠質細胞）在誘導環境下存活是其發揮細胞治療作用的前提。同時，誘導后的細胞需維持一定活力，才能發揮其細胞功能。由于神經細胞對組織周圍微環境要求極為苛刻，因此構建一個既能誘導NSCs向神經元定向分化，又能維持分化后神經細胞活力的誘導環境具有重要意義。
嗅鞘細胞（olfactory ensheathing cells，OECs）是一種來源于嗅神經及嗅球神經層，功能介于雪旺細胞和少突膠質細胞之間的一種特殊膠質細胞，其分泌的諸多細胞因子，如腦源性神經生長因子、睫狀神經營養因子、NGF、神經營養素3等，為NSCs的神經元分化、存活提供了物質支持[7-10]。我們前期研究中，采用OECs無血清培養基上清液成功誘導大鼠NSCs、人臍血MSCs向神經元分化，且誘導的神經元具有活躍的電生理特性[11-12]；但是，關于OECs對NSCs分化后的細胞是否具有支持作用卻鮮有報道。為此，本次研究通過使用OECs無血清培養基上清液體外誘導C17.2 NSCs定向分化，旨在觀察其對NSCs分化后細胞活力的影響。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
新生3 d昆明小鼠8只，雌雄不限，體重3～5 g，由中南大學動物實驗部提供。C17.2 NSCs系由中國科學院藥物研究所李佳老師贈予。
H-DMEM/F12培養基（Gibco公司，美國）；FBS（HyClone公司，美國）；多聚賴氨酸、阿糖胞苷（cytosine arabinoside，AraC）、NGF受體（NGF receptor，NGFR）p75抗體（Sigma公司，美國）；兔抗小鼠β-微管蛋白 Ⅲ（β-tubulin-Ⅲ）一抗（Abcam 公司，美國）；兔抗小鼠微管相關蛋白2（microtubule-associated protein 2，MAP-2）一抗（Protein Tech公司，美國）；兔抗小鼠巢蛋白（Nestin）一抗（Abcam 公司，美國）；β-actin一抗（Protein Tech公司，美國）；免疫熒光二抗、DAPI（上海碧云天生物技術研究所）。 熒光顯微鏡（Leica公司，德國）； 717S全自動生化分析儀（Hitachi公司，日本）；酶聯免疫檢測儀（BD公司，美國）；倒置顯微鏡（Olympus公司，日本）；Quantity One軟件（Bio-Rad公司，美國）。
1.2 實驗方法
1.2.1 C17.2 NSCs培養及鑒定
將第1代C17.2 NSCs置于預鋪多聚賴氨酸、含15%FBS的H-DMEM/F12培養基，于37℃、5%CO2培養箱培養[13]。倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況。采用Nestin免疫熒光染色鑒定NSCs，Nestin陽性表達呈綠染。每3～5 天傳代培養純化，傳至第3代，待細胞生長融合至80%時進行誘導分化實驗。
1.2.2 小鼠OECs培養及上清液制備
參考文獻[3]方法培養小鼠OECs：取8只新生3 d昆明小鼠，絡合碘消毒液溺死，剪開頭部及頸部皮膚，充分暴露顱骨，再用眼科剪插入枕骨大孔，沿正中線剪開顱骨，向兩側撕開顱骨充分暴露兩側大腦半球、小腦及嗅球，剝取嗅球。預冷D-Hank’s液清洗3次，解剖顯微鏡下剝離嗅球表面膜及血管，眼科剪剪碎，37℃以0.25%胰蛋白酶及0.03%膠原酶消化5 min，含10%FBS的DMEM終止消化，吹打后細胞篩過濾。以離心半徑10 cm、1 000 r/min離心5 min，棄上清；以含10%FBS的DMEM重懸細胞，接種于培養瓶；48 h后全量換液，并調整細胞密度為5 ×104個/mL，接種于預鋪多聚賴氨酸的培養瓶中；于37℃、5%CO2培養箱培養。倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況，采用NGFR p75免疫熒光染色鑒定OECs，p75陽性表達呈綠染。待細胞生長融合至80%時棄培養基，PBS清洗3次，加入無血清DMEM培養基，孵育24 h，同上法離心15 min，收集上清液，-20℃保存備用。
1.2.3 誘導分組
實驗分為實驗組、對照組及空白組。實驗組及對照組：取生長達80%融合后的第3 代C17.2 NSCs，棄含血清培養基，PBS清洗3次，分別加入100%濃度OECs無血清上清液、H-DMEM/F12培養基誘導培養。空白對照組：采用含15%FBS的H-DMEM/F12培養基培養的正常第3代C17.2 NSCs。倒置顯微鏡下觀察各組細胞生長情況。實驗組及對照組于誘導5 d后、空白對照組于對應時間點取細胞進行觀察。
1.3 觀測指標
1.3.1 免疫熒光染色鑒定
收集各組細胞，經90%乙醇固定，PBS清洗3次，分別加入一抗MAP-2（1∶1 000）、β-tubulin-Ⅲ （1∶1 000）4℃過夜，常溫下加入免疫熒光二抗孵育1 h，清洗3次后滴加DAPI染核，熒光顯微鏡下觀察，MAP-2陽性表達呈綠染，β-tubulin-Ⅲ為紅染。
1.3.2 Western
blot檢測收集各組細胞，采用SDS Sample buffer裂解，Bradford蛋白定量。取蛋白50 μg，10%Tris-甘氨酸SDS-PAGE凝膠電泳2 h，轉膜，分別加入Nestin、β-tubulin-Ⅲ、MAP-2抗體（1∶1 000），4℃孵育過夜，TBST洗膜3次。以1∶2 000比例稀釋二抗，TBST洗膜3次，于暗室加1 mL顯影A、B混合液，根據熒光強度選擇不同曝光時間，掃描儀獲取熒光圖譜。采用Quantity One軟件分析免疫條帶，以目的蛋白與內參β-actin的吸光度（A）值比值作為目的蛋白的相對表達量。
1.3.3 乳酸脫氫酶（lactate
dehydrogenase，LDH）測定收集各組細胞上清液0.5 mL，過濾后用全自動生化分析儀測定LDH含量，按照以下公式計算LDH漏出率，LDH漏出率=實驗組或對照組LDH值/空白對照組LDH值×100%。實驗重復5次。
1.3.4 MTT法檢測細胞活力
誘導后5 d，各組培養孔中加入25 μL MTT，37℃孵育4 h ，加入100 μL裂解緩沖液，用酶聯免疫檢測儀在570 nm波長處測定其A值，以實驗組、對照組A值與空白對照組A值的百分比，表示細胞活力。實驗重復5次。
1.4 統計學方法
采用SPSS17.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 細胞形態學觀察及鑒定
倒置顯微鏡下觀察示，C17.2 NSCs呈不規則形態，有突起，貼壁緊密（圖 1 a）；免疫熒光染色示細胞均表達NSCs標志物Nestin（圖 1 b）。培養7 d，OECs以圓形、梭形為主，呈雙極或多極狀，突起細長（圖 1 c）；免疫熒光染色NGFR p75陽性表達，培養細胞為OECs（圖 1 d）。
圖1
細胞形態學觀察及鑒定 ? C17.2 NSCs形態觀察（倒置顯微鏡×100） ? C17.2 NSCs的Nestin免疫熒光染色觀察（熒光顯微鏡×100） ? OECs形態觀察（倒置顯微鏡×100） ? OECs的NGFR p75免疫熒光染色觀察（熒光顯微鏡×100） ? ?2.2 誘導后細胞形態學觀察及免疫熒光染色鑒定
實驗組：誘導后24 h，倒置顯微鏡下觀察見細胞胞體開始收縮，呈圓形、多角形、錐形，兩極有類似樹突、軸突突起，細胞之間突起相互連接，交織成網；3 d后，分化的細胞明顯增多，突觸增長。誘導5 d免疫熒光染色示分化后細胞β-tubulin-Ⅲ、MAP-2均呈陽性，提示已分化為神經元。
對照組：誘導后24 h，倒置顯微鏡下觀察見細胞胞體略收縮，但形態無明顯改變； 3 d后，大多數細胞胞體皺縮，細胞核質濃縮，部分細胞已裂解、破碎。誘導5 d 免疫熒光染色示細胞均無β-tubulin-Ⅲ和MAP-2表達。
空白對照組：誘導后24 h，倒置顯微鏡下觀察見細胞扁平，形態不規則，貼壁緊密，細胞增多，可見分裂象；3 d后，細胞形態較前無顯著變化，生長至100%融合，細胞密度大，接觸緊密。誘導5 d免疫熒光染色示細胞均無β-tubulin-Ⅲ和MAP-2表達。見圖 2、3。
2.3 Western blot檢測
與對照組及空白對照組比較，實驗組中NSCs標志物Nestin蛋白表達明顯減少，神經元標志物β-tubulin-Ⅲ和MAP-2表達增加，差異均有統計學意義（P＜ 0.05）。對照組與空白對照組比較，差異均無統計學意義（P＞ 0.05）。見表 1、圖 4。
表1
各組細胞Nestin、β-tubulin-Ⅲ和MAP-2蛋白表達比較（n=3，
圖4
Western blot檢測各組細胞Nestin、β-tubulin-Ⅲ和MAP-2蛋白表達 1：空白對照組 2： 對照組 3：實驗組
Figure4.
The protein expressions of Nestin,β-tubulin-Ⅲ,and MAP-2 in each group by Western blot 1: Blank control group 2: Control group 3: Experimental group
2.4 LDH及細胞活力檢測
空白對照組LDH漏出率及細胞活力均為100%。實驗組LDH漏出率為130.60% ± 6.86%，顯著低于對照組的178.20% ± 5.44%，比較差異有統計學意義（P＜ 0.05）；兩組與空白對照組比較，差異均有統計學意義（P＜ 0.05）。實驗組細胞活力為62.20% ± 3.82%，顯著高于對照組的18.00% ± 3.83%，比較差異有統計學意義（P＜ 0.05）；兩組與空白對照組比較，差異均有統計學意義（P＜ 0.05）。
3 討論
目前，對于中樞神經系統損傷所致機體功能障礙仍無較好的治療手段和康復方法[14-15]，NSCs移植為神經系統疾病治療帶來新希望。但移植后NSCs存在成活率低、大部分向膠質細胞分化等問題。OECs作為一種特殊類型的神經膠質細胞，能分泌大量神經營養因子，如腦源性神經生長因子、NGF、GDNF、睫狀神經營養因子等，這些神經營養因子和細胞外基質相互協調，為NSCs自我更新和促進其向神經元分化及軸突生長提供良好微環境[16-19]。OECs不僅促進NSCs分化為具有功能的神經元，還能促進軸突延伸和穿越膠質瘢痕，從而促進神經修復和功能重建[19-22]；此外，我們前期應用SDS-PAGE分離和高通量液相串聯質譜結合的蛋白質組學技術，從OECs條件培養基中得到168個分泌蛋白質，并建立了OECs分泌蛋白庫，發現除上述神經營養因子之外，還有一些OECs分泌的蛋白可能對NSCs分化起調控作用[23]。因此，OECs所具有的營養支持作用一方面能支持NSCs生長，另一方面能促進NSCs向神經元定向分化，與NSCs在神經修復上達到功能互補，更大程度促進移植NSCs成活及向神經元分化。值得注意的是，既往對于NSCs向神經元定向分化的研究多注重于神經元陽性分化率，而對于分化后的神經元是否能在分化環境中存活以及是否能保持一定細胞活力從而發揮細胞功能卻少有研究。本研究在采用OECs無血清上清液體外誘導C17.2 NSCs定向分化的基礎上，同時對誘導后細胞活力進行檢測，以期完善OECs誘導NSCs向神經元分化的理論，為臨床聯合應用OECs和NSCs移植治療中樞神經損傷提供理論依據。
C17.2細胞是一種永生化的NSCs株，來源于新生小鼠小腦外顆粒層，是用逆轉錄病毒將v-myc和β-半乳糖苷酶轉染后篩選得到的具有永生化、多潛能、能被體內追蹤特性的NSCs[24-25]。因此C17.2細胞是一種理想的NSCs模型，廣泛應用于NSCs的相關研究。本研究用100%濃度OECs無血清上清液成功誘導C17.2 NSCs向神經元分化，并通過免疫熒光染色和Western blot法證實分化后的細胞表達兩種神經元特異性標志物β-tubulin-Ⅲ和MAP-2。培養液LDH含量檢測提示，與空白對照組相比，誘導后實驗組和對照組LDH漏出率均不同程度增高，表明在誘導過程中有部分細胞死亡，LDH釋放至培養液中。同時MTT細胞活力檢測結果表明，在誘導后實驗組及對照組細胞活力也有不同程度降低。但實驗組LDH漏出率顯著低于對照組，而細胞活力高于對照組，差異均有統計學意義，提示OECs無血清上清液對分化后細胞存活具有一定支持作用。
綜上述，本研究結果表明含有OECs分泌蛋白的無血清上清液能誘導NSCs向神經元分化，同時OECs分泌蛋白對分化后的神經細胞具有一定支持作用，為臨床應用OECs聯合NSCs移植治療中樞神經系統疾病奠定了實驗基礎。
神經干細胞（neural stem cells，NSCs）是一類能自我更新、增殖及向3種神經類型細胞分化的成體干細胞，在中樞神經系統損傷后的神經修復和再生中具有重要作用。研究表明，NSCs的分化方向受局部微環境調控，包括周圍相聯系的各種細胞、細胞外基質和體內各種細胞因子等[1-6]，其中主要調控機制為各種細胞分泌的細胞因子、蛋白及細胞間的相互作用。
NSCs與神經元生長、發育所需局部微環境并不完全相同，經NSCs誘導分化的終末細胞（神經元、星形膠質細胞和少突膠質細胞）在誘導環境下存活是其發揮細胞治療作用的前提。同時，誘導后的細胞需維持一定活力，才能發揮其細胞功能。由于神經細胞對組織周圍微環境要求極為苛刻，因此構建一個既能誘導NSCs向神經元定向分化，又能維持分化后神經細胞活力的誘導環境具有重要意義。
嗅鞘細胞（olfactory ensheathing cells，OECs）是一種來源于嗅神經及嗅球神經層，功能介于雪旺細胞和少突膠質細胞之間的一種特殊膠質細胞，其分泌的諸多細胞因子，如腦源性神經生長因子、睫狀神經營養因子、NGF、神經營養素3等，為NSCs的神經元分化、存活提供了物質支持[7-10]。我們前期研究中，采用OECs無血清培養基上清液成功誘導大鼠NSCs、人臍血MSCs向神經元分化，且誘導的神經元具有活躍的電生理特性[11-12]；但是，關于OECs對NSCs分化后的細胞是否具有支持作用卻鮮有報道。為此，本次研究通過使用OECs無血清培養基上清液體外誘導C17.2 NSCs定向分化，旨在觀察其對NSCs分化后細胞活力的影響。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
新生3 d昆明小鼠8只，雌雄不限，體重3～5 g，由中南大學動物實驗部提供。C17.2 NSCs系由中國科學院藥物研究所李佳老師贈予。
H-DMEM/F12培養基（Gibco公司，美國）；FBS（HyClone公司，美國）；多聚賴氨酸、阿糖胞苷（cytosine arabinoside，AraC）、NGF受體（NGF receptor，NGFR）p75抗體（Sigma公司，美國）；兔抗小鼠β-微管蛋白 Ⅲ（β-tubulin-Ⅲ）一抗（Abcam 公司，美國）；兔抗小鼠微管相關蛋白2（microtubule-associated protein 2，MAP-2）一抗（Protein Tech公司，美國）；兔抗小鼠巢蛋白（Nestin）一抗（Abcam 公司，美國）；β-actin一抗（Protein Tech公司，美國）；免疫熒光二抗、DAPI（上海碧云天生物技術研究所）。 熒光顯微鏡（Leica公司，德國）； 717S全自動生化分析儀（Hitachi公司，日本）；酶聯免疫檢測儀（BD公司，美國）；倒置顯微鏡（Olympus公司，日本）；Quantity One軟件（Bio-Rad公司，美國）。
1.2 實驗方法
1.2.1 C17.2 NSCs培養及鑒定
將第1代C17.2 NSCs置于預鋪多聚賴氨酸、含15%FBS的H-DMEM/F12培養基，于37℃、5%CO2培養箱培養[13]。倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況。采用Nestin免疫熒光染色鑒定NSCs，Nestin陽性表達呈綠染。每3～5 天傳代培養純化，傳至第3代，待細胞生長融合至80%時進行誘導分化實驗。
1.2.2 小鼠OECs培養及上清液制備
參考文獻[3]方法培養小鼠OECs：取8只新生3 d昆明小鼠，絡合碘消毒液溺死，剪開頭部及頸部皮膚，充分暴露顱骨，再用眼科剪插入枕骨大孔，沿正中線剪開顱骨，向兩側撕開顱骨充分暴露兩側大腦半球、小腦及嗅球，剝取嗅球。預冷D-Hank’s液清洗3次，解剖顯微鏡下剝離嗅球表面膜及血管，眼科剪剪碎，37℃以0.25%胰蛋白酶及0.03%膠原酶消化5 min，含10%FBS的DMEM終止消化，吹打后細胞篩過濾。以離心半徑10 cm、1 000 r/min離心5 min，棄上清；以含10%FBS的DMEM重懸細胞，接種于培養瓶；48 h后全量換液，并調整細胞密度為5 ×104個/mL，接種于預鋪多聚賴氨酸的培養瓶中；于37℃、5%CO2培養箱培養。倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況，采用NGFR p75免疫熒光染色鑒定OECs，p75陽性表達呈綠染。待細胞生長融合至80%時棄培養基，PBS清洗3次，加入無血清DMEM培養基，孵育24 h，同上法離心15 min，收集上清液，-20℃保存備用。
1.2.3 誘導分組
實驗分為實驗組、對照組及空白組。實驗組及對照組：取生長達80%融合后的第3 代C17.2 NSCs，棄含血清培養基，PBS清洗3次，分別加入100%濃度OECs無血清上清液、H-DMEM/F12培養基誘導培養。空白對照組：采用含15%FBS的H-DMEM/F12培養基培養的正常第3代C17.2 NSCs。倒置顯微鏡下觀察各組細胞生長情況。實驗組及對照組于誘導5 d后、空白對照組于對應時間點取細胞進行觀察。
1.3 觀測指標
1.3.1 免疫熒光染色鑒定
收集各組細胞，經90%乙醇固定，PBS清洗3次，分別加入一抗MAP-2（1∶1 000）、β-tubulin-Ⅲ （1∶1 000）4℃過夜，常溫下加入免疫熒光二抗孵育1 h，清洗3次后滴加DAPI染核，熒光顯微鏡下觀察，MAP-2陽性表達呈綠染，β-tubulin-Ⅲ為紅染。
1.3.2 Western
blot檢測收集各組細胞，采用SDS Sample buffer裂解，Bradford蛋白定量。取蛋白50 μg，10%Tris-甘氨酸SDS-PAGE凝膠電泳2 h，轉膜，分別加入Nestin、β-tubulin-Ⅲ、MAP-2抗體（1∶1 000），4℃孵育過夜，TBST洗膜3次。以1∶2 000比例稀釋二抗，TBST洗膜3次，于暗室加1 mL顯影A、B混合液，根據熒光強度選擇不同曝光時間，掃描儀獲取熒光圖譜。采用Quantity One軟件分析免疫條帶，以目的蛋白與內參β-actin的吸光度（A）值比值作為目的蛋白的相對表達量。
1.3.3 乳酸脫氫酶（lactate
dehydrogenase，LDH）測定收集各組細胞上清液0.5 mL，過濾后用全自動生化分析儀測定LDH含量，按照以下公式計算LDH漏出率，LDH漏出率=實驗組或對照組LDH值/空白對照組LDH值×100%。實驗重復5次。
1.3.4 MTT法檢測細胞活力
誘導后5 d，各組培養孔中加入25 μL MTT，37℃孵育4 h ，加入100 μL裂解緩沖液，用酶聯免疫檢測儀在570 nm波長處測定其A值，以實驗組、對照組A值與空白對照組A值的百分比，表示細胞活力。實驗重復5次。
1.4 統計學方法
采用SPSS17.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 細胞形態學觀察及鑒定
倒置顯微鏡下觀察示，C17.2 NSCs呈不規則形態，有突起，貼壁緊密（圖 1 a）；免疫熒光染色示細胞均表達NSCs標志物Nestin（圖 1 b）。培養7 d，OECs以圓形、梭形為主，呈雙極或多極狀，突起細長（圖 1 c）；免疫熒光染色NGFR p75陽性表達，培養細胞為OECs（圖 1 d）。
圖1
細胞形態學觀察及鑒定 ? C17.2 NSCs形態觀察（倒置顯微鏡×100） ? C17.2 NSCs的Nestin免疫熒光染色觀察（熒光顯微鏡×100） ? OECs形態觀察（倒置顯微鏡×100） ? OECs的NGFR p75免疫熒光染色觀察（熒光顯微鏡×100） ? ?2.2 誘導后細胞形態學觀察及免疫熒光染色鑒定
實驗組：誘導后24 h，倒置顯微鏡下觀察見細胞胞體開始收縮，呈圓形、多角形、錐形，兩極有類似樹突、軸突突起，細胞之間突起相互連接，交織成網；3 d后，分化的細胞明顯增多，突觸增長。誘導5 d免疫熒光染色示分化后細胞β-tubulin-Ⅲ、MAP-2均呈陽性，提示已分化為神經元。
對照組：誘導后24 h，倒置顯微鏡下觀察見細胞胞體略收縮，但形態無明顯改變； 3 d后，大多數細胞胞體皺縮，細胞核質濃縮，部分細胞已裂解、破碎。誘導5 d 免疫熒光染色示細胞均無β-tubulin-Ⅲ和MAP-2表達。
空白對照組：誘導后24 h，倒置顯微鏡下觀察見細胞扁平，形態不規則，貼壁緊密，細胞增多，可見分裂象；3 d后，細胞形態較前無顯著變化，生長至100%融合，細胞密度大，接觸緊密。誘導5 d免疫熒光染色示細胞均無β-tubulin-Ⅲ和MAP-2表達。見圖 2、3。
2.3 Western blot檢測
與對照組及空白對照組比較，實驗組中NSCs標志物Nestin蛋白表達明顯減少，神經元標志物β-tubulin-Ⅲ和MAP-2表達增加，差異均有統計學意義（P＜ 0.05）。對照組與空白對照組比較，差異均無統計學意義（P＞ 0.05）。見表 1、圖 4。
表1
各組細胞Nestin、β-tubulin-Ⅲ和MAP-2蛋白表達比較（n=3，
圖4
Western blot檢測各組細胞Nestin、β-tubulin-Ⅲ和MAP-2蛋白表達 1：空白對照組 2： 對照組 3：實驗組
Figure4.
The protein expressions of Nestin,β-tubulin-Ⅲ,and MAP-2 in each group by Western blot 1: Blank control group 2: Control group 3: Experimental group
2.4 LDH及細胞活力檢測
空白對照組LDH漏出率及細胞活力均為100%。實驗組LDH漏出率為130.60% ± 6.86%，顯著低于對照組的178.20% ± 5.44%，比較差異有統計學意義（P＜ 0.05）；兩組與空白對照組比較，差異均有統計學意義（P＜ 0.05）。實驗組細胞活力為62.20% ± 3.82%，顯著高于對照組的18.00% ± 3.83%，比較差異有統計學意義（P＜ 0.05）；兩組與空白對照組比較，差異均有統計學意義（P＜ 0.05）。
3 討論
目前，對于中樞神經系統損傷所致機體功能障礙仍無較好的治療手段和康復方法[14-15]，NSCs移植為神經系統疾病治療帶來新希望。但移植后NSCs存在成活率低、大部分向膠質細胞分化等問題。OECs作為一種特殊類型的神經膠質細胞，能分泌大量神經營養因子，如腦源性神經生長因子、NGF、GDNF、睫狀神經營養因子等，這些神經營養因子和細胞外基質相互協調，為NSCs自我更新和促進其向神經元分化及軸突生長提供良好微環境[16-19]。OECs不僅促進NSCs分化為具有功能的神經元，還能促進軸突延伸和穿越膠質瘢痕，從而促進神經修復和功能重建[19-22]；此外，我們前期應用SDS-PAGE分離和高通量液相串聯質譜結合的蛋白質組學技術，從OECs條件培養基中得到168個分泌蛋白質，并建立了OECs分泌蛋白庫，發現除上述神經營養因子之外，還有一些OECs分泌的蛋白可能對NSCs分化起調控作用[23]。因此，OECs所具有的營養支持作用一方面能支持NSCs生長，另一方面能促進NSCs向神經元定向分化，與NSCs在神經修復上達到功能互補，更大程度促進移植NSCs成活及向神經元分化。值得注意的是，既往對于NSCs向神經元定向分化的研究多注重于神經元陽性分化率，而對于分化后的神經元是否能在分化環境中存活以及是否能保持一定細胞活力從而發揮細胞功能卻少有研究。本研究在采用OECs無血清上清液體外誘導C17.2 NSCs定向分化的基礎上，同時對誘導后細胞活力進行檢測，以期完善OECs誘導NSCs向神經元分化的理論，為臨床聯合應用OECs和NSCs移植治療中樞神經損傷提供理論依據。
C17.2細胞是一種永生化的NSCs株，來源于新生小鼠小腦外顆粒層，是用逆轉錄病毒將v-myc和β-半乳糖苷酶轉染后篩選得到的具有永生化、多潛能、能被體內追蹤特性的NSCs[24-25]。因此C17.2細胞是一種理想的NSCs模型，廣泛應用于NSCs的相關研究。本研究用100%濃度OECs無血清上清液成功誘導C17.2 NSCs向神經元分化，并通過免疫熒光染色和Western blot法證實分化后的細胞表達兩種神經元特異性標志物β-tubulin-Ⅲ和MAP-2。培養液LDH含量檢測提示，與空白對照組相比，誘導后實驗組和對照組LDH漏出率均不同程度增高，表明在誘導過程中有部分細胞死亡，LDH釋放至培養液中。同時MTT細胞活力檢測結果表明，在誘導后實驗組及對照組細胞活力也有不同程度降低。但實驗組LDH漏出率顯著低于對照組，而細胞活力高于對照組，差異均有統計學意義，提示OECs無血清上清液對分化后細胞存活具有一定支持作用。
綜上述，本研究結果表明含有OECs分泌蛋白的無血清上清液能誘導NSCs向神經元分化，同時OECs分泌蛋白對分化后的神經細胞具有一定支持作用，為臨床應用OECs聯合NSCs移植治療中樞神經系統疾病奠定了實驗基礎。
