引用本文： 費筠, 謝洪彬, 王云帥, 齊暉, 鄧春艷, 任莉莉, 李富榮. 損傷胰腺組織提取液誘導大鼠BMSCs分化為胰島素分泌細胞的研究. 中國修復重建外科雜志, 2014, 28(5): 625-632. doi: 10.7507/1002-1892.20140139 復制
MSCs是來源于中胚層具有多向分化潛能的干細胞，在一定誘導條件下，來源于各組織中的MSCs均可分化為有功能的胰島素分泌細胞（insulin producing cells，IPCs）[1-3]。目前常用的體外誘導成體干細胞向IPCs分化的方案主要有3種：轉基因法[4]、可溶性誘導因子或小分子化合物誘導法[5]和共培養法[6]。MSCs的分化受其遺傳程序和周圍微環境共同控制，如何在體外模擬類胰腺發育分化的微環境是解決其分化為IPCs的關鍵。本研究以損傷胰腺組織提取液作為誘導劑，在誘導大鼠BMSCs分化為IPCs過程中，動態監測胰腺發育相關基因和蛋白的表達，評估誘導分化效率和成熟度，以明確損傷胰腺組織提取液能否使大鼠BMSCs高效定向誘導分化為IPCs，為篩選高效定向的誘導劑提供依據。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
4周齡（2只）和6周齡（80只）SD大鼠，雌雄各半，體重120～150 g，均購自廣東省實驗動物中心，飼養于SPF級動物實驗室（暨南大學第二臨床醫學院實驗動物中心）。
L-DMEM培養基、FBS、0.25%胰蛋白酶（GIBCO公司，美國）；BCA試劑盒（Pierce公司，美國）；Trizol、引物、FITC標記驢抗山羊多抗（Invitrogen公司，美國）；第1鏈cDNA合成試劑盒（Fermentas公司，加拿大）；熒光定量PCR試劑盒（Qiagen公司，德國）；雙硫腙（dithizone，DTZ）、Triton X-100（Sigma公司，美國）；胰島素促進因子1（pancreatic duodenal homeobox 1，PDX-1）兔抗大鼠多克隆抗體（Abcam公司，英國）；C肽兔抗大鼠多克隆抗體、胰島素兔抗大鼠單克隆抗體、兔單克隆抗體同型對照（Cell signaling公司，美國）；生長抑素兔抗大鼠多克隆抗體（ABR公司，美國）；Nkx6.1山羊抗大鼠多克隆抗體（Santa Cruz公司，美國）；PE標記山羊抗兔多抗（SouthernBiotech公司，美國）；FITC標記山羊抗兔多抗（Rockland公司，美國）；大鼠ELISA試劑盒（Mercodia公司，美國）；蛋白酶抑制劑（Roche公司，瑞士）。
ALTRA流式細胞儀（Beckman Coulter公司，美國）；0.22 μm濾膜（Millipore公司，美國）；倒置熒光顯微鏡（Nikon公司，日本）；CX41光學顯微鏡（Olympus公司，日本）；BioPhotometer plus核酸蛋白測定儀（Eppendorf公司，美國）；LightCycler 2.0 羅氏熒光定量PCR儀（Roche Diagnostic公司，德國）。
1.2 大鼠BMSCs分離、培養和鑒定
取2只4周齡SD大鼠的脛骨和股骨，參照文獻[7]方法分離、純化BMSCs，光鏡下觀察細胞形態。取純化的第3代BMSCs，采用流式細胞儀檢測BMSCs表面標記CD29、CD31、CD45、CD90和CD106表達；采用同型對照作空白對照。
1.3 胰腺組織提取液的制備
1.3.1 損傷胰腺組織提取液的制備
采用Hardikar等[8]方法制備損傷胰腺組織提取液：取40只6周齡SD大鼠，雌雄各半，以4%水合氯醛（2 mL/kg）腹腔注射麻醉，無菌條件下切除60%胰腺后關腹。48 h后處死大鼠，取殘存胰腺組織用預冷PBS溶液沖洗，然后置于含630 U/mg蛋白酶抑制劑的PBS溶液（10 μL∶1 mL）低溫勻漿，勻漿物于4℃低溫離心機中，以離心半徑8.5 cm、3 000 r/min離心10 min；取上清，以離心半徑8.5 cm、12 000 r/min離心20 min；取上清用0.22 μm濾膜過濾，經BCA試劑盒檢測蛋白濃度為（3.7 ± 0.2）mg/mL。分裝保存于-80℃，備用。
1.3.2 正常胰腺組織提取液的制備
取剩余40只6 周齡SD大鼠，同上法麻醉，無菌條件下開腹，胰腺不作任何處理，然后用絲線縫合腹壁全層。48 h后處死大鼠，取胰腺組織，按1.3.1方法處理。BCA試劑盒檢測蛋白濃度為（7.0 ± 0.3）mg/mL。分裝保存于-80℃，備用。
1.4 實驗分組及方法
取第3代BMSCs，按3 ×105個/孔密度接種于蓋有玻片的6孔板中，每孔加入3 mL含10%FBS的L-DMEM培養液，前5 d不換液，當細胞融合達80%時，按加入誘導液不同分為3組。損傷胰腺組織提取液誘導組（實驗組），每孔加入3 mL含400 μg/mL損傷胰腺組織提取液、10%FBS的L-DMEM培養基；正常胰腺組織提取液誘導組（正常對照組），每孔加入3 mL含400 μg/ mL正常胰腺組織提取液、10%FBS的L-DMEM培養基；空白對照組僅加入3 mL含10%FBS的L-DMEM培養基。每組誘導14 d，每3天換液1次。
1.5 觀測指標
1.5.1 細胞形態學觀察和DTZ染色觀察
倒置顯微鏡下觀察3組誘導分化過程中BMSCs形態變化。將誘導14 d的細胞團用PBS（pH7.4）洗2次后，加DTZ工作液（DTZ∶PBS=10 μL∶1 mL），置37℃、5%CO2孵箱中孵育15 min，倒置顯微鏡下觀察細胞著色情況。
1.5.2 免疫熒光染色觀察
誘導14 d后收集各組細胞，4%多聚甲醛固定10 min，PBS洗滌，0.3%Triton X-100處理10 min，5%牛血清白蛋白37℃封閉1 h，依次加入胰島素兔抗大鼠單克隆抗體、C肽兔抗大鼠多克隆抗體、PDX-1兔抗大鼠多克隆抗體、Nkx6.1山羊抗大鼠多克隆抗體、生長抑素兔抗大鼠多克隆抗體，37℃孵育1 h，漂洗。加入FITC標記驢抗山羊多抗、PE標記山羊抗兔多抗，37℃孵育1 h，漂洗后加入10 μg/mL DAPI復染細胞核，室溫下8 min，PBS洗3次。抗淬滅劑封片，熒光顯微鏡下觀察。
1.5.3 胰腺發育相關基因檢測
① RT-PCR檢測：誘導7、10、14 d后收集各組細胞，按Trizol說明書提取總RNA，經紫外分光光度計測定濃度和純度，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的質量。按第1鏈cDNA合成試劑盒說明書合成cDNA。PCR反應按照Platinum PCR 操作方案進行，反應體系50 μL，cDNA 2 μL，選取β-actin為內參，取5 μL PCR產物用1.5%普通瓊脂糖凝膠電泳后，凝膠電泳成像系統觀測成像情況。各基因引物序列、退火溫度及產物大小見表 1。同時用大鼠天然胰島作為陽性對照組，按研究室既往方法進行大鼠胰島的分離、純化[9]；分離后的胰島用含20%FBS的RPMI-1640培養，然后手工挑選1個直徑約為150 μm的大鼠天然胰島。② 實時熒光定量PCR：分別在誘導0、7、10、14 d收集各組細胞，按照熒光定量PCR試劑盒說明書，用LightCycler 2.0羅氏熒光定量PCR儀進行實時熒光定量PCR檢測。每個樣本同時設立3個平行管，以β-actin作為內參，采用2-ΔΔCt公式計算目的基因相對表達量，LightCycler Software 4.05（儀器自帶）分析計算結果。
表1
各基因RT-PCR引物序列
Table1.
Primer sequences of the related genes for RT-PCR
1.5.4 分化效率檢測
誘導14 d后收集各組細胞，調整細胞濃度為1 ×106個/mL。取100 μL細胞懸液，加入C肽兔抗大鼠多克隆抗體，4℃孵育30 min，PBS洗滌2次，加入FITC標記羊抗兔多抗，室溫孵育30 min，以離心半徑12.5 cm、1 000 r/min離心5 min，1%多聚甲醛重懸細胞，流式細胞儀檢測細胞C肽表達陽性率；設置同型對照管。
1.5.5 葡萄糖刺激實驗
誘導14 d后收集各組細胞，PBS洗滌，調整細胞濃度為1 ×105個/mL，將1 mL細胞懸液加入24孔板。同1.5.3方法取50個大鼠天然胰島作為陽性對照組。分別用含5.5 mmol/L或25.5 mmol/L葡萄糖的DMEM/F12培養液1 mL，對收集的各組細胞和大鼠天然胰島孵育1 h，收集培養液，用大鼠ELISA試劑盒檢測胰島素釋放水平。
1.6 統計學方法
采用SPSS10.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 BMSCs形態學觀察及鑒定
分離、純化后的BMSCs呈長梭形、漩渦狀生長。流式細胞儀檢測示，BMSCs表面標志CD29（98.8%）、CD90（98.4%）和CD106（92.2%）呈陽性表達，CD45（3.0%）和CD31（2.6%）呈陰性表達。結合細胞形態及干細胞表面標志檢測提示分離、純化的細胞為大鼠BMSCs。
2.2 誘導后細胞形態和DTZ染色觀察
誘導后，空白對照組和正常對照組BMSCs仍呈長梭形，漩渦狀生長，無明顯變化（圖 1 a、b）。實驗組BMSCs在3 d時明顯變短、變圓，細胞核明顯，出現較多細胞質；7 d時呈鑲嵌型生長，“鋪路石”樣（圖 1 c）；14 d部分細胞呈小團塊聚集生長，胰島樣細胞團形成（圖 1 d）。誘導14 d細胞 DTZ染色示，實驗組聚集成團的胰島樣細胞團呈棕紅色；空白對照組和正常對照組無著色。見圖 2。
圖1
BMSCs誘導過程中形態學變化（倒置顯微鏡×100） ? 正常對照組10 d ? 空白對照組10 d ? 實驗組7 d ? 實驗組14 d ? ?2.3 免疫熒光染色觀察
誘導14 d，免疫熒光染色示實驗組細胞PDX-1（紅色）、胰島素（紅色）、C肽（綠色）、生長抑素（紅色）和Nkx6.1（綠色）呈陽性表達；正常對照組和空白對照組細胞均未見陽性表達。見圖 3。
2.4 胰腺發育相關基因檢測
RT-PCR檢測示，誘導7、10、14 d空白對照組和正常對照組細胞均未見各相關基因表達。實驗組：誘導7、10 d可檢測到葡萄糖轉運蛋白2、神經元素3、胰島因子1、前蛋白轉化酶2、生長抑素表達，未見前蛋白轉化酶1、Nkx6.1表達；PDX-1在7 d時表達很弱，10 d時未見表達。14 d時，Nkx6.1開始表達，PDX-1表達明顯增強，葡萄糖轉運蛋白2、胰島因子1、前蛋白轉化酶2 持續表達，神經元素3表達有所減弱，而生長抑素幾乎不表達，前蛋白轉化酶1仍未檢測到。見圖 4。
圖4
RT-PCR檢測胰腺發育相關基因表達 M：Marker l：β-actin 2：PDX-1 3：葡萄糖轉運蛋白2 4：神經元素3 5：胰島因子1 6：Nkx6.1 7：前蛋白轉化酶1 8：前蛋白轉化酶2 9：生長抑素 ? 空白對照組 ? 實驗組7 d ? 實驗組10 d ? 實驗組14 d ? 陽性對照組 ? ?實時熒光定量PCR檢測示，實驗組誘導7 d PDX-1表達開始上調，10 d下降，14 d表達明顯上調；神經元素3、葡萄糖轉運蛋白2表達逐漸升高，10 d達高峰，14 d下降；胰島因子1、Nkx6.1表達隨時間延長逐漸升高；前蛋白轉化酶1表達也隨時間延長逐漸上調，10 d達高峰后開始下降，14 d時幾乎不表達；前蛋白轉化酶2、生長抑素表達在7 d時達高峰，然后逐漸下降。正常對照組和空白對照組各時間點均未檢測到各相關基因表達。見圖 5。
2.5 分化效率檢測
流式細胞儀檢測示，誘導14 d，實驗組C肽表達陽性率為13.8% ± 1.8%，正常對照組和空白對照組細胞均為1.6% ± 0.4%，實驗組顯著高于正常對照組和空白對照組，差異有統計學意義（P＜ 0.05）。
2.6 葡萄糖刺激實驗
實驗組高、低糖刺激的胰島素釋放水平分別為（0.966 ± 0.059）、（0.377 ± 0.059） mU/ L，正常對照組分別為（0.013 ± 0.003）、（0.009 ± 0.004） mU/L，空白對照組分別為（0.011 ± 0.002）、（0.007 ± 0.002） mU/ L，陽性對照組分別為（44.646 ± 3.781）、（7.406 ± 0.336） mU/ L。實驗組細胞高、低糖刺激胰島素釋放水平顯著高于正常對照組和空白對照組（P＜ 0.05）；但僅為陽性對照組的1/40和1/47，差異有統計學意義（P＜ 0.05）。實驗組高糖刺激下細胞胰島素釋放水平是低糖刺激下的4～6倍。
3 討論
BMSCs有很強的自我復制功能和多向分化潛能，具有取材容易、能發揮免疫抑制作用、體外易增殖等優點，成為誘導分化胰島細胞的最佳候選干細胞。Hardikar等[8]對鏈脲佐菌素誘導的糖尿病小鼠切除80%～90%胰腺，發現術后小鼠血糖仍能夠保持在正常范圍內，表明盡管在糖尿病條件下，殘存胰腺也具有較強的再生能力，能夠通過分泌一些細胞因子促使胰腺β細胞再生。接著他們又將胰腺切除后的小鼠胰腺組織提取液，經腹膜內注射至糖尿病大鼠體內，發現可降低血糖水平達190 d[10]。Kanitkar等[11]將大鼠胰腺細胞培養上清液經腹膜內注射至糖尿病大鼠體內，也發現可降低血糖水平，表明胰腺增生時會分泌大量促進胰島β細胞再生的細胞因子。研究表明，采用大鼠胰腺部分切除后的再生胰腺組織制備的條件培養基，可誘導大鼠BMSCs分化為IPCs[12]；并且，在BMSCs向胰島樣細胞誘導分化過程中加入損傷胰腺組織提取液，能明顯提高胰島素分泌水平[13]。與成年小鼠離體胰島、離散胰島細胞或小鼠β細胞株共培養，可促進胰腺干細胞分化為成熟β細胞[14]。我們前期研究利用兔胰腺組織與MSCs共培養，提示可促進MSCs向IPCs分化[15]，胰腺微環境對干細胞向胰島β細胞分化發揮重要作用。對損傷胰腺組織提取液進行蛋白組分析，發現存在促進胰腺發育和分化相關的轉錄蛋白[16]。
基于上述研究，本研究中我們單獨使用損傷胰腺組織提取液進行BMSCs誘導，結果顯示誘導14 d后細胞呈“鋪路石”樣，DTZ染色呈棕紅色，一些細胞開始表達胰島細胞表面標志；胰島β細胞發育關鍵因子在分化過程中呈時序性表達；免疫熒光染色示，誘導14 d后細胞表達成熟胰島β細胞的相關蛋白，提示分化后的細胞團具有胰島β細胞的生物特性。但免疫熒光染色結果顯示胰島D 細胞分泌的生長抑素也呈陽性表達，實時熒光定量PCR結果也證實生長抑素從誘導開始表達逐漸上調，到7 d時達高峰，之后逐漸下調，14 d時表達量約為0 d的8倍，表明誘導所獲得的陽性IPCs成熟度不夠[17]。流式細胞術分析分化細胞C肽表達陽性率為13.8% ± 1.8%，在低、高糖刺激下分化細胞釋放胰島素水平只有天然胰島的1/40和1/47，與大多數體外誘導分化后細胞胰島素分泌水平一致[18]。
利用損傷胰腺組織提取液可促進BMSCs誘導分化IPCs，主要與損傷胰腺組織所分泌的各種轉錄因子相關。我們既往對損傷胰腺組織提取液進行蛋白組學分析，發現存在與胰腺發育和分化相關的絲切蛋白、核苷二磷酸激酶A、過氧化物酶6和線粒體絲氨酸蛋白酶轉錄因子和可溶性蛋白[16]。雖然前期研究發現正常胰腺組織提取液也能促進干細胞向胰島細胞誘導分化[15]，這主要是通過正常胰腺微環境中細胞與細胞之間的相互作用來促進干細胞的發育與分化，但正常胰腺組織提取液內可能缺乏促進干細胞分化的轉錄因子和可溶性蛋白。因此，利用正常胰腺組織提取液與BMSCs共培養，未獲得IPCs。
本研究利用損傷胰腺組織提取液誘導分化所得IPCs并未完全分化成熟，主要表現在不能產生足夠的真胰島素，即胰島素原轉換障礙。前蛋白轉化酶1、2是胰島素原轉化為胰島素的兩個關鍵酶[19]，主要存在于胰腺的β細胞中，無論哪一種酶缺乏胰島素原均無法轉換為真胰島素，而能否分泌具有生物活性的成熟胰島素決定了IPCs是否能有效治療糖尿病。本研究中前蛋白轉化酶1在RT-PCR檢測中均未表達，說明誘導的IPCs存在胰島素原轉換障礙。這可能是轉分化效率低、成熟度差的原因。
干細胞體外誘導分化受其內在的遺傳程序和周圍微環境共同控制。因此，需要進一步研究如何將調控胰腺發育的基因表達和胰腺發育微環境兩個條件結合起來，使成體干細胞在體外高效定向分化成IPCs。
MSCs是來源于中胚層具有多向分化潛能的干細胞，在一定誘導條件下，來源于各組織中的MSCs均可分化為有功能的胰島素分泌細胞（insulin producing cells，IPCs）[1-3]。目前常用的體外誘導成體干細胞向IPCs分化的方案主要有3種：轉基因法[4]、可溶性誘導因子或小分子化合物誘導法[5]和共培養法[6]。MSCs的分化受其遺傳程序和周圍微環境共同控制，如何在體外模擬類胰腺發育分化的微環境是解決其分化為IPCs的關鍵。本研究以損傷胰腺組織提取液作為誘導劑，在誘導大鼠BMSCs分化為IPCs過程中，動態監測胰腺發育相關基因和蛋白的表達，評估誘導分化效率和成熟度，以明確損傷胰腺組織提取液能否使大鼠BMSCs高效定向誘導分化為IPCs，為篩選高效定向的誘導劑提供依據。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
4周齡（2只）和6周齡（80只）SD大鼠，雌雄各半，體重120～150 g，均購自廣東省實驗動物中心，飼養于SPF級動物實驗室（暨南大學第二臨床醫學院實驗動物中心）。
L-DMEM培養基、FBS、0.25%胰蛋白酶（GIBCO公司，美國）；BCA試劑盒（Pierce公司，美國）；Trizol、引物、FITC標記驢抗山羊多抗（Invitrogen公司，美國）；第1鏈cDNA合成試劑盒（Fermentas公司，加拿大）；熒光定量PCR試劑盒（Qiagen公司，德國）；雙硫腙（dithizone，DTZ）、Triton X-100（Sigma公司，美國）；胰島素促進因子1（pancreatic duodenal homeobox 1，PDX-1）兔抗大鼠多克隆抗體（Abcam公司，英國）；C肽兔抗大鼠多克隆抗體、胰島素兔抗大鼠單克隆抗體、兔單克隆抗體同型對照（Cell signaling公司，美國）；生長抑素兔抗大鼠多克隆抗體（ABR公司，美國）；Nkx6.1山羊抗大鼠多克隆抗體（Santa Cruz公司，美國）；PE標記山羊抗兔多抗（SouthernBiotech公司，美國）；FITC標記山羊抗兔多抗（Rockland公司，美國）；大鼠ELISA試劑盒（Mercodia公司，美國）；蛋白酶抑制劑（Roche公司，瑞士）。
ALTRA流式細胞儀（Beckman Coulter公司，美國）；0.22 μm濾膜（Millipore公司，美國）；倒置熒光顯微鏡（Nikon公司，日本）；CX41光學顯微鏡（Olympus公司，日本）；BioPhotometer plus核酸蛋白測定儀（Eppendorf公司，美國）；LightCycler 2.0 羅氏熒光定量PCR儀（Roche Diagnostic公司，德國）。
1.2 大鼠BMSCs分離、培養和鑒定
取2只4周齡SD大鼠的脛骨和股骨，參照文獻[7]方法分離、純化BMSCs，光鏡下觀察細胞形態。取純化的第3代BMSCs，采用流式細胞儀檢測BMSCs表面標記CD29、CD31、CD45、CD90和CD106表達；采用同型對照作空白對照。
1.3 胰腺組織提取液的制備
1.3.1 損傷胰腺組織提取液的制備
采用Hardikar等[8]方法制備損傷胰腺組織提取液：取40只6周齡SD大鼠，雌雄各半，以4%水合氯醛（2 mL/kg）腹腔注射麻醉，無菌條件下切除60%胰腺后關腹。48 h后處死大鼠，取殘存胰腺組織用預冷PBS溶液沖洗，然后置于含630 U/mg蛋白酶抑制劑的PBS溶液（10 μL∶1 mL）低溫勻漿，勻漿物于4℃低溫離心機中，以離心半徑8.5 cm、3 000 r/min離心10 min；取上清，以離心半徑8.5 cm、12 000 r/min離心20 min；取上清用0.22 μm濾膜過濾，經BCA試劑盒檢測蛋白濃度為（3.7 ± 0.2）mg/mL。分裝保存于-80℃，備用。
1.3.2 正常胰腺組織提取液的制備
取剩余40只6 周齡SD大鼠，同上法麻醉，無菌條件下開腹，胰腺不作任何處理，然后用絲線縫合腹壁全層。48 h后處死大鼠，取胰腺組織，按1.3.1方法處理。BCA試劑盒檢測蛋白濃度為（7.0 ± 0.3）mg/mL。分裝保存于-80℃，備用。
1.4 實驗分組及方法
取第3代BMSCs，按3 ×105個/孔密度接種于蓋有玻片的6孔板中，每孔加入3 mL含10%FBS的L-DMEM培養液，前5 d不換液，當細胞融合達80%時，按加入誘導液不同分為3組。損傷胰腺組織提取液誘導組（實驗組），每孔加入3 mL含400 μg/mL損傷胰腺組織提取液、10%FBS的L-DMEM培養基；正常胰腺組織提取液誘導組（正常對照組），每孔加入3 mL含400 μg/ mL正常胰腺組織提取液、10%FBS的L-DMEM培養基；空白對照組僅加入3 mL含10%FBS的L-DMEM培養基。每組誘導14 d，每3天換液1次。
1.5 觀測指標
1.5.1 細胞形態學觀察和DTZ染色觀察
倒置顯微鏡下觀察3組誘導分化過程中BMSCs形態變化。將誘導14 d的細胞團用PBS（pH7.4）洗2次后，加DTZ工作液（DTZ∶PBS=10 μL∶1 mL），置37℃、5%CO2孵箱中孵育15 min，倒置顯微鏡下觀察細胞著色情況。
1.5.2 免疫熒光染色觀察
誘導14 d后收集各組細胞，4%多聚甲醛固定10 min，PBS洗滌，0.3%Triton X-100處理10 min，5%牛血清白蛋白37℃封閉1 h，依次加入胰島素兔抗大鼠單克隆抗體、C肽兔抗大鼠多克隆抗體、PDX-1兔抗大鼠多克隆抗體、Nkx6.1山羊抗大鼠多克隆抗體、生長抑素兔抗大鼠多克隆抗體，37℃孵育1 h，漂洗。加入FITC標記驢抗山羊多抗、PE標記山羊抗兔多抗，37℃孵育1 h，漂洗后加入10 μg/mL DAPI復染細胞核，室溫下8 min，PBS洗3次。抗淬滅劑封片，熒光顯微鏡下觀察。
1.5.3 胰腺發育相關基因檢測
① RT-PCR檢測：誘導7、10、14 d后收集各組細胞，按Trizol說明書提取總RNA，經紫外分光光度計測定濃度和純度，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的質量。按第1鏈cDNA合成試劑盒說明書合成cDNA。PCR反應按照Platinum PCR 操作方案進行，反應體系50 μL，cDNA 2 μL，選取β-actin為內參，取5 μL PCR產物用1.5%普通瓊脂糖凝膠電泳后，凝膠電泳成像系統觀測成像情況。各基因引物序列、退火溫度及產物大小見表 1。同時用大鼠天然胰島作為陽性對照組，按研究室既往方法進行大鼠胰島的分離、純化[9]；分離后的胰島用含20%FBS的RPMI-1640培養，然后手工挑選1個直徑約為150 μm的大鼠天然胰島。② 實時熒光定量PCR：分別在誘導0、7、10、14 d收集各組細胞，按照熒光定量PCR試劑盒說明書，用LightCycler 2.0羅氏熒光定量PCR儀進行實時熒光定量PCR檢測。每個樣本同時設立3個平行管，以β-actin作為內參，采用2-ΔΔCt公式計算目的基因相對表達量，LightCycler Software 4.05（儀器自帶）分析計算結果。
表1
各基因RT-PCR引物序列
Table1.
Primer sequences of the related genes for RT-PCR
1.5.4 分化效率檢測
誘導14 d后收集各組細胞，調整細胞濃度為1 ×106個/mL。取100 μL細胞懸液，加入C肽兔抗大鼠多克隆抗體，4℃孵育30 min，PBS洗滌2次，加入FITC標記羊抗兔多抗，室溫孵育30 min，以離心半徑12.5 cm、1 000 r/min離心5 min，1%多聚甲醛重懸細胞，流式細胞儀檢測細胞C肽表達陽性率；設置同型對照管。
1.5.5 葡萄糖刺激實驗
誘導14 d后收集各組細胞，PBS洗滌，調整細胞濃度為1 ×105個/mL，將1 mL細胞懸液加入24孔板。同1.5.3方法取50個大鼠天然胰島作為陽性對照組。分別用含5.5 mmol/L或25.5 mmol/L葡萄糖的DMEM/F12培養液1 mL，對收集的各組細胞和大鼠天然胰島孵育1 h，收集培養液，用大鼠ELISA試劑盒檢測胰島素釋放水平。
1.6 統計學方法
采用SPSS10.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 BMSCs形態學觀察及鑒定
分離、純化后的BMSCs呈長梭形、漩渦狀生長。流式細胞儀檢測示，BMSCs表面標志CD29（98.8%）、CD90（98.4%）和CD106（92.2%）呈陽性表達，CD45（3.0%）和CD31（2.6%）呈陰性表達。結合細胞形態及干細胞表面標志檢測提示分離、純化的細胞為大鼠BMSCs。
2.2 誘導后細胞形態和DTZ染色觀察
誘導后，空白對照組和正常對照組BMSCs仍呈長梭形，漩渦狀生長，無明顯變化（圖 1 a、b）。實驗組BMSCs在3 d時明顯變短、變圓，細胞核明顯，出現較多細胞質；7 d時呈鑲嵌型生長，“鋪路石”樣（圖 1 c）；14 d部分細胞呈小團塊聚集生長，胰島樣細胞團形成（圖 1 d）。誘導14 d細胞 DTZ染色示，實驗組聚集成團的胰島樣細胞團呈棕紅色；空白對照組和正常對照組無著色。見圖 2。
圖1
BMSCs誘導過程中形態學變化（倒置顯微鏡×100） ? 正常對照組10 d ? 空白對照組10 d ? 實驗組7 d ? 實驗組14 d ? ?2.3 免疫熒光染色觀察
誘導14 d，免疫熒光染色示實驗組細胞PDX-1（紅色）、胰島素（紅色）、C肽（綠色）、生長抑素（紅色）和Nkx6.1（綠色）呈陽性表達；正常對照組和空白對照組細胞均未見陽性表達。見圖 3。
2.4 胰腺發育相關基因檢測
RT-PCR檢測示，誘導7、10、14 d空白對照組和正常對照組細胞均未見各相關基因表達。實驗組：誘導7、10 d可檢測到葡萄糖轉運蛋白2、神經元素3、胰島因子1、前蛋白轉化酶2、生長抑素表達，未見前蛋白轉化酶1、Nkx6.1表達；PDX-1在7 d時表達很弱，10 d時未見表達。14 d時，Nkx6.1開始表達，PDX-1表達明顯增強，葡萄糖轉運蛋白2、胰島因子1、前蛋白轉化酶2 持續表達，神經元素3表達有所減弱，而生長抑素幾乎不表達，前蛋白轉化酶1仍未檢測到。見圖 4。
圖4
RT-PCR檢測胰腺發育相關基因表達 M：Marker l：β-actin 2：PDX-1 3：葡萄糖轉運蛋白2 4：神經元素3 5：胰島因子1 6：Nkx6.1 7：前蛋白轉化酶1 8：前蛋白轉化酶2 9：生長抑素 ? 空白對照組 ? 實驗組7 d ? 實驗組10 d ? 實驗組14 d ? 陽性對照組 ? ?實時熒光定量PCR檢測示，實驗組誘導7 d PDX-1表達開始上調，10 d下降，14 d表達明顯上調；神經元素3、葡萄糖轉運蛋白2表達逐漸升高，10 d達高峰，14 d下降；胰島因子1、Nkx6.1表達隨時間延長逐漸升高；前蛋白轉化酶1表達也隨時間延長逐漸上調，10 d達高峰后開始下降，14 d時幾乎不表達；前蛋白轉化酶2、生長抑素表達在7 d時達高峰，然后逐漸下降。正常對照組和空白對照組各時間點均未檢測到各相關基因表達。見圖 5。
2.5 分化效率檢測
流式細胞儀檢測示，誘導14 d，實驗組C肽表達陽性率為13.8% ± 1.8%，正常對照組和空白對照組細胞均為1.6% ± 0.4%，實驗組顯著高于正常對照組和空白對照組，差異有統計學意義（P＜ 0.05）。
2.6 葡萄糖刺激實驗
實驗組高、低糖刺激的胰島素釋放水平分別為（0.966 ± 0.059）、（0.377 ± 0.059） mU/ L，正常對照組分別為（0.013 ± 0.003）、（0.009 ± 0.004） mU/L，空白對照組分別為（0.011 ± 0.002）、（0.007 ± 0.002） mU/ L，陽性對照組分別為（44.646 ± 3.781）、（7.406 ± 0.336） mU/ L。實驗組細胞高、低糖刺激胰島素釋放水平顯著高于正常對照組和空白對照組（P＜ 0.05）；但僅為陽性對照組的1/40和1/47，差異有統計學意義（P＜ 0.05）。實驗組高糖刺激下細胞胰島素釋放水平是低糖刺激下的4～6倍。
3 討論
BMSCs有很強的自我復制功能和多向分化潛能，具有取材容易、能發揮免疫抑制作用、體外易增殖等優點，成為誘導分化胰島細胞的最佳候選干細胞。Hardikar等[8]對鏈脲佐菌素誘導的糖尿病小鼠切除80%～90%胰腺，發現術后小鼠血糖仍能夠保持在正常范圍內，表明盡管在糖尿病條件下，殘存胰腺也具有較強的再生能力，能夠通過分泌一些細胞因子促使胰腺β細胞再生。接著他們又將胰腺切除后的小鼠胰腺組織提取液，經腹膜內注射至糖尿病大鼠體內，發現可降低血糖水平達190 d[10]。Kanitkar等[11]將大鼠胰腺細胞培養上清液經腹膜內注射至糖尿病大鼠體內，也發現可降低血糖水平，表明胰腺增生時會分泌大量促進胰島β細胞再生的細胞因子。研究表明，采用大鼠胰腺部分切除后的再生胰腺組織制備的條件培養基，可誘導大鼠BMSCs分化為IPCs[12]；并且，在BMSCs向胰島樣細胞誘導分化過程中加入損傷胰腺組織提取液，能明顯提高胰島素分泌水平[13]。與成年小鼠離體胰島、離散胰島細胞或小鼠β細胞株共培養，可促進胰腺干細胞分化為成熟β細胞[14]。我們前期研究利用兔胰腺組織與MSCs共培養，提示可促進MSCs向IPCs分化[15]，胰腺微環境對干細胞向胰島β細胞分化發揮重要作用。對損傷胰腺組織提取液進行蛋白組分析，發現存在促進胰腺發育和分化相關的轉錄蛋白[16]。
基于上述研究，本研究中我們單獨使用損傷胰腺組織提取液進行BMSCs誘導，結果顯示誘導14 d后細胞呈“鋪路石”樣，DTZ染色呈棕紅色，一些細胞開始表達胰島細胞表面標志；胰島β細胞發育關鍵因子在分化過程中呈時序性表達；免疫熒光染色示，誘導14 d后細胞表達成熟胰島β細胞的相關蛋白，提示分化后的細胞團具有胰島β細胞的生物特性。但免疫熒光染色結果顯示胰島D 細胞分泌的生長抑素也呈陽性表達，實時熒光定量PCR結果也證實生長抑素從誘導開始表達逐漸上調，到7 d時達高峰，之后逐漸下調，14 d時表達量約為0 d的8倍，表明誘導所獲得的陽性IPCs成熟度不夠[17]。流式細胞術分析分化細胞C肽表達陽性率為13.8% ± 1.8%，在低、高糖刺激下分化細胞釋放胰島素水平只有天然胰島的1/40和1/47，與大多數體外誘導分化后細胞胰島素分泌水平一致[18]。
利用損傷胰腺組織提取液可促進BMSCs誘導分化IPCs，主要與損傷胰腺組織所分泌的各種轉錄因子相關。我們既往對損傷胰腺組織提取液進行蛋白組學分析，發現存在與胰腺發育和分化相關的絲切蛋白、核苷二磷酸激酶A、過氧化物酶6和線粒體絲氨酸蛋白酶轉錄因子和可溶性蛋白[16]。雖然前期研究發現正常胰腺組織提取液也能促進干細胞向胰島細胞誘導分化[15]，這主要是通過正常胰腺微環境中細胞與細胞之間的相互作用來促進干細胞的發育與分化，但正常胰腺組織提取液內可能缺乏促進干細胞分化的轉錄因子和可溶性蛋白。因此，利用正常胰腺組織提取液與BMSCs共培養，未獲得IPCs。
本研究利用損傷胰腺組織提取液誘導分化所得IPCs并未完全分化成熟，主要表現在不能產生足夠的真胰島素，即胰島素原轉換障礙。前蛋白轉化酶1、2是胰島素原轉化為胰島素的兩個關鍵酶[19]，主要存在于胰腺的β細胞中，無論哪一種酶缺乏胰島素原均無法轉換為真胰島素，而能否分泌具有生物活性的成熟胰島素決定了IPCs是否能有效治療糖尿病。本研究中前蛋白轉化酶1在RT-PCR檢測中均未表達，說明誘導的IPCs存在胰島素原轉換障礙。這可能是轉分化效率低、成熟度差的原因。
干細胞體外誘導分化受其內在的遺傳程序和周圍微環境共同控制。因此，需要進一步研究如何將調控胰腺發育的基因表達和胰腺發育微環境兩個條件結合起來，使成體干細胞在體外高效定向分化成IPCs。
