引用本文： 馬林, 唐康來, 周兵華, 楊廣華, 陳萬, 穆米多, 袁成松. 機械牽伸對體外大鼠肌腱干細胞RhoA/Rho相關蛋白激酶分子表達的影響. 中國修復重建外科雜志, 2014, 28(5): 639-643. doi: 10.7507/1002-1892.20140141 復制
肌腱病是一種運動損傷性疾病，目前認為肌腱過度不合理使用是導致該病的主要原因。肌腱病的組織發生了大量異位骨化和脂肪化，其發生機制尚不明確。有學者發現，肌腱中存在具有干細胞性質的細胞，命名為肌腱干細胞（tendon stem cells，TSCs）[1-3]。當TSCs受到機械牽伸時，可向肌腱細胞、成骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞分化，參與肌腱病的發生發展[4-6]。
小GTP蛋白RhoA和其主要的效應分子Rho相關蛋白激酶（Rho associated protein kinases，ROCK）為機械敏感性分子，參與多種生物學效應，機械牽伸下可誘導細胞骨架的重塑[7-8]，引起細胞產生不同的生物學效應[9-10]。本研究通過對大鼠TSCs體外加載不同機械牽伸力，觀察細胞中RhoA/ROCK分子變化情況，以期為肌腱病發病機制研究提供新思路。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
2～3月齡雄性SD大鼠3只，體重200～250 g，由第三軍醫大學實驗動物中心提供。H-DMEM培養基、胰蛋白酶（HyClone公司，美國）；FBS（GIBCO公司，美國）；纖維連接蛋白、分散酶、Ⅰ型膠原酶（Sigma公司，美國）；抗RhoA抗體（Abcam公司，英國）；抗ROCK抗體、Western blot相關試劑盒、HiFi-MMLV cDNA第1鏈合成試劑盒、UltraSYBR Mixture、細胞計數試劑盒8（cell counting kit 8，CCK-8）、ECL試劑盒、BCA試劑盒（北京康為世紀生物科技有限公司）；RIPA裂解液（上海碧云天生物技術研究所）。倒置相差顯微鏡（Olympus公司，日本）；Quantity One軟件（Bio-Rad公司，美國）。微溝槽培養皿由本科室自制。
1.2 細胞牽伸器
細胞牽伸器由本科室自行研制，包括機械部分和電子控制部分[11]。電子控制部分控制牽伸的頻率和時間，采用可編程控制器配以專用程序，通過調節步進電機轉速來改變細胞培養皿的牽拉頻率。步進電機轉軸輸出的扭矩通過齒輪傳遞帶動主軸以設定的頻率及時間旋轉，主軸上的凸輪驅動硅樹脂細胞培養皿支架作往復運動，從而使貼附于培養皿表面的細胞獲得體外機械牽伸。不同牽伸應變量（4%、8%、12%）以牽伸位移距離表示，通過更換不同規格的機械凸輪實現（相應的凸輪位移距離分別為2.4、4.8、7.2 mm）。
1.3 大鼠TSCs分離培養
參照文獻[1, 12] 進行TSCs分離培養。取3只SD大鼠，無菌條件下取出跟腱組織，剪去腱鞘，PBS清洗3次；將肌腱組織剪碎，在37℃條件下，以3 mg/mL Ⅰ型膠原酶和4 mg/mL分散酶混合液消化1 h。收集細胞懸液，以300 × g離心8 min，棄上清，以含20%FBS的H-DMEM重懸細胞，按50個/cm2密度接種于培養瓶中，置于37℃、5%CO2細胞培養箱中培養，每3天換液1次，倒置相差顯微鏡下觀察細胞生長情況。當細胞融合達90%時進行傳代，取第2～3 代細胞進行實驗。經檢測干細胞表面標志物CD90、CD44、Oct-4、核干細胞因子和誘導成骨、成軟骨和成脂分化鑒定培養細胞為TSCs。
1.4 實驗分組及方法
為使TSCs更好地在微溝槽培養皿中貼壁生長，并防止牽伸后細胞脫落，接種細胞前微溝槽培養皿預鋪纖維連接蛋白。取2 mL纖維連結蛋白（10 μg/mL）加入微溝槽培養皿中，靜置30 min，吸出纖維連接蛋白，PBS溶液沖洗后備用[11]。
實驗分為3組，分別為4%牽伸組、8%牽伸組及對照組。取TSCs單細胞懸液，以2 ×104個/cm2密度接種于預鋪纖維連接蛋白的微溝槽培養皿中，37℃、5%CO2細胞培養箱中培養24 h，待細胞完全貼壁后沿培養皿長軸，對細胞進行單軸機械牽伸。根據不同應變量對TSCs分化方向影響的不同[4]，分別以牽伸應變量4%、8%（4%牽伸組、8%牽伸組）、牽伸頻率1 Hz、牽伸時間4 h/d進行牽伸，倒置相差顯微鏡下觀察牽伸后細胞形態變化。牽伸1、2、3 d后收集細胞，靜置24 h后進行觀測。對照組為未牽伸的TSCs，于對應時間點收集細胞進行以下觀測。
1.5 觀測指標
1.5.1 實時定量
PCR檢測RhoA、ROCK基因表達按照HiFi-MMLV cDNA第1鏈合成試劑盒和UltraSYBR Mixture說明書進行操作。RhoA上游引物：
5'-ATTGGCGCTTTTGGGTACATG-3'，下游引物：5'-GGCACCCCGACTTTTTCTTC-3'；ROCK上游引物：5'-AACGGAAGAACAGCAGAAATGG-3'，下游引物：5'-GCCGAATGGACTGGTTTTGTT-3'； β-actin上游引物：5'-TACCAGAAGGGCAGGATACAG-3'，下游引物：5'-TCCCGGCCAGCCAGGTCCA-3'。引物序列由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。
按以下條件擴增：95℃預變性8 min；95℃變性15 s、60℃退火、延伸1 min，35個循環。溶解曲線分析為95℃、15 s，60℃、1 min，95℃、15 s，60℃、15 s。采用2-ΔΔCt法分析目的基因相對表達量。實驗重復3次。
1.5.2 Western
blot檢測RhoA、ROCK蛋白表達參照RIPA裂解液說明書提取細胞蛋白，BCA法蛋白定量，SDS-PAGE凝膠電泳，聚偏氟乙烯膜轉膜，脫脂奶粉封閉，兔抗鼠一抗（1∶1 000）4℃過夜孵育，二抗室溫孵育2 h，洗膜，用ECL試劑盒顯影，應用Quantity One軟件分析蛋白表達水平。實驗重復3次。
1.5.3 細胞增殖檢測
參照CCK-8試劑盒說明書操作，在96孔板中每孔加入100 μL細胞懸液（含4 000個細胞），然后每孔加入10 μL CCK-8溶液，每個樣品6 個復孔。置于37℃、5%CO2細胞培養箱內孵育2 h，應用酶標儀在450 nm波長測定吸光度（A）值。實驗重復3次。
1.6 統計學方法
采用SPSS19.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Tukey HSD法；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 大鼠TSCs形態觀察
倒置相差顯微鏡下觀察示，第2代TSCs呈鵝卵石樣，聚集生長；接種于微溝槽培養皿后呈雜亂生長；牽伸后細胞貼壁良好，無脫落，并沿受力方向排列。見圖 1。
圖1
大鼠TSCs形態觀察 ? 第2代細胞培養3 d（倒置相差顯微鏡× 40） ? 第2代細胞培養3 d（倒置相差顯微鏡× 400） ? 牽伸前細胞在微溝槽培養皿中雜亂生長（倒置相差顯微鏡× 400） ? 8%牽伸組牽伸后1 d細胞沿微溝槽生長（倒置相差顯微鏡× 400） ? ?2.2 不同機械牽伸條件對TSCs中RhoA、ROCK基因表達的影響
各時間點，TSCs中RhoA、ROCK基因相對表達量均隨牽伸應變量的增加呈遞增趨勢，組間比較差異均有統計學意義（P＜ 0.05）。見圖 2。
2.3 不同機械牽伸條件對TSCs中RhoA、ROCK蛋白表達的影響
牽伸1 d時，3組間RhoA、ROCK蛋白表達水平相似，差異無統計學意義（P＞ 0.05）。2、3 d時，4%、8%牽伸組RhoA、ROCK蛋白表達水平顯著高于對照組，且隨牽伸應變量增加呈遞增趨勢；組間比較差異均有統計學意義（P＜ 0.05）。見圖 3、4。
圖3
Western blot檢測各組RhoA、ROCK蛋白表達 Mr：相對分子質量 1：對照組 2：4%牽伸組 3：8%牽伸組 ? 牽伸1 d ? 牽伸2 d ? 牽伸3 d ? ?2.4 不同機械牽伸條件對細胞增殖的影響
各時間點，8%牽伸組細胞增殖顯著低于4%牽伸組及對照組，差異有統計學意義（P＜ 0.05）；4%牽伸組與對照組比較，差異無統計學意義（P＞ 0.05）。見圖 5。
3 討論
研究發現，TSCs在適度機械牽伸條件下可向肌腱方向分化，過度牽伸條件下向非肌腱方向分化，但機械牽伸是如何將力學信號轉化為細胞內的化學信號誘導TSCs分化尚不清楚[13-15]。我們前期研究發現，肌腱細胞在異常牽伸條件下可分泌前列腺素E2、磷脂酶A2、環氧合酶等，引起細胞外基質的改變，這些改變可誘導TSCs向不同方向分化[16]。然而TSCs在機械牽伸條件下是如何產生生物學應答的呢？
研究顯示，機械牽伸可引起細胞外基質改變，作用于整合素家族，通過細胞RhoA/ROCK信號分子的改變引起一系列生物學應答。RhoA為一種小GTP蛋白，參與細胞的收縮、黏附及運動，尤其在細胞應力纖維裝配和黏附斑信號傳導中處于重要地位[17]。ROCK是Rho家族GTP激酶的主要下游效應物，有兩種亞型（ROCKⅠ和ROCKⅡ），廣泛參于細胞黏附、增殖、代謝、凋亡及細胞周期的調節等。RhoA/ROCK分子具有機械敏感性[18]，循環牽伸可使心肌細胞、成纖維細胞、MSCs的RhoA/ROCK分子表達水平上調。當受到外界應力時，RhoA/ROCK通過調節肌動蛋白和肌球蛋白，導致干細胞形狀變化，使干細胞向不同方向分化。Chen 等[19]研究發現，機械牽伸誘導BMSCs向成骨細胞表型分化過程中，RhoA/ROCK是重要的調節因子，參與介導細胞骨架肌動蛋白的組裝、細胞形態及軟骨細胞相關基因的表達。Shi等[20]對TSCs研究發現，在體外2%機械牽伸條件下，RhoA參與了細胞成骨分化的過程。Keung等[21]對神經干細胞研究發現，RhoA參與了神經干細胞的機械化學信號轉導和細胞分化的調節。
本研究采用自行研制的細胞循環牽伸系統，對TSCs采用不同的機械牽伸應變量，在不同時間點觀察RhoA/ROCK分子表達情況，初步分析RhoA/ROCK分子表達與不同機械牽伸條件的關系。結果提示，牽伸1 d后即引起RhoA、ROCK基因表達上調，并隨牽伸應變量的增加而增加，蛋白表達水平在牽伸2、3 d時增高，并且8%應變量變化較大。表明RhoA、ROCK信號分子的表達水平與牽伸應變量有關，但是更多的牽伸條件還需進一步研究。4%牽伸應變量在3 d的牽伸過程中對細胞增殖無顯著影響，而8%牽伸應變量抑制了細胞增殖。表明8%牽伸應變量對TSCs產生了過度牽伸的效果，影響了細胞增殖。
綜上述，體外循環牽伸可使TSCs中 RhoA/ROCK分子表達顯著增高，并且8%牽伸應變量對TSCs產生了過度牽伸的效果。然而牽伸時間對RhoA/ROCK分子表達的影響還不清楚，機械牽伸是否通過RhoA/ROCK分子影響TSCs增殖和分化尚需進一步研究。RhoA/ROCK分子表達調控有可能成為肌腱病發病機制研究領域新的信號分子。
肌腱病是一種運動損傷性疾病，目前認為肌腱過度不合理使用是導致該病的主要原因。肌腱病的組織發生了大量異位骨化和脂肪化，其發生機制尚不明確。有學者發現，肌腱中存在具有干細胞性質的細胞，命名為肌腱干細胞（tendon stem cells，TSCs）[1-3]。當TSCs受到機械牽伸時，可向肌腱細胞、成骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞分化，參與肌腱病的發生發展[4-6]。
小GTP蛋白RhoA和其主要的效應分子Rho相關蛋白激酶（Rho associated protein kinases，ROCK）為機械敏感性分子，參與多種生物學效應，機械牽伸下可誘導細胞骨架的重塑[7-8]，引起細胞產生不同的生物學效應[9-10]。本研究通過對大鼠TSCs體外加載不同機械牽伸力，觀察細胞中RhoA/ROCK分子變化情況，以期為肌腱病發病機制研究提供新思路。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
2～3月齡雄性SD大鼠3只，體重200～250 g，由第三軍醫大學實驗動物中心提供。H-DMEM培養基、胰蛋白酶（HyClone公司，美國）；FBS（GIBCO公司，美國）；纖維連接蛋白、分散酶、Ⅰ型膠原酶（Sigma公司，美國）；抗RhoA抗體（Abcam公司，英國）；抗ROCK抗體、Western blot相關試劑盒、HiFi-MMLV cDNA第1鏈合成試劑盒、UltraSYBR Mixture、細胞計數試劑盒8（cell counting kit 8，CCK-8）、ECL試劑盒、BCA試劑盒（北京康為世紀生物科技有限公司）；RIPA裂解液（上海碧云天生物技術研究所）。倒置相差顯微鏡（Olympus公司，日本）；Quantity One軟件（Bio-Rad公司，美國）。微溝槽培養皿由本科室自制。
1.2 細胞牽伸器
細胞牽伸器由本科室自行研制，包括機械部分和電子控制部分[11]。電子控制部分控制牽伸的頻率和時間，采用可編程控制器配以專用程序，通過調節步進電機轉速來改變細胞培養皿的牽拉頻率。步進電機轉軸輸出的扭矩通過齒輪傳遞帶動主軸以設定的頻率及時間旋轉，主軸上的凸輪驅動硅樹脂細胞培養皿支架作往復運動，從而使貼附于培養皿表面的細胞獲得體外機械牽伸。不同牽伸應變量（4%、8%、12%）以牽伸位移距離表示，通過更換不同規格的機械凸輪實現（相應的凸輪位移距離分別為2.4、4.8、7.2 mm）。
1.3 大鼠TSCs分離培養
參照文獻[1, 12] 進行TSCs分離培養。取3只SD大鼠，無菌條件下取出跟腱組織，剪去腱鞘，PBS清洗3次；將肌腱組織剪碎，在37℃條件下，以3 mg/mL Ⅰ型膠原酶和4 mg/mL分散酶混合液消化1 h。收集細胞懸液，以300 × g離心8 min，棄上清，以含20%FBS的H-DMEM重懸細胞，按50個/cm2密度接種于培養瓶中，置于37℃、5%CO2細胞培養箱中培養，每3天換液1次，倒置相差顯微鏡下觀察細胞生長情況。當細胞融合達90%時進行傳代，取第2～3 代細胞進行實驗。經檢測干細胞表面標志物CD90、CD44、Oct-4、核干細胞因子和誘導成骨、成軟骨和成脂分化鑒定培養細胞為TSCs。
1.4 實驗分組及方法
為使TSCs更好地在微溝槽培養皿中貼壁生長，并防止牽伸后細胞脫落，接種細胞前微溝槽培養皿預鋪纖維連接蛋白。取2 mL纖維連結蛋白（10 μg/mL）加入微溝槽培養皿中，靜置30 min，吸出纖維連接蛋白，PBS溶液沖洗后備用[11]。
實驗分為3組，分別為4%牽伸組、8%牽伸組及對照組。取TSCs單細胞懸液，以2 ×104個/cm2密度接種于預鋪纖維連接蛋白的微溝槽培養皿中，37℃、5%CO2細胞培養箱中培養24 h，待細胞完全貼壁后沿培養皿長軸，對細胞進行單軸機械牽伸。根據不同應變量對TSCs分化方向影響的不同[4]，分別以牽伸應變量4%、8%（4%牽伸組、8%牽伸組）、牽伸頻率1 Hz、牽伸時間4 h/d進行牽伸，倒置相差顯微鏡下觀察牽伸后細胞形態變化。牽伸1、2、3 d后收集細胞，靜置24 h后進行觀測。對照組為未牽伸的TSCs，于對應時間點收集細胞進行以下觀測。
1.5 觀測指標
1.5.1 實時定量
PCR檢測RhoA、ROCK基因表達按照HiFi-MMLV cDNA第1鏈合成試劑盒和UltraSYBR Mixture說明書進行操作。RhoA上游引物：
5'-ATTGGCGCTTTTGGGTACATG-3'，下游引物：5'-GGCACCCCGACTTTTTCTTC-3'；ROCK上游引物：5'-AACGGAAGAACAGCAGAAATGG-3'，下游引物：5'-GCCGAATGGACTGGTTTTGTT-3'； β-actin上游引物：5'-TACCAGAAGGGCAGGATACAG-3'，下游引物：5'-TCCCGGCCAGCCAGGTCCA-3'。引物序列由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。
按以下條件擴增：95℃預變性8 min；95℃變性15 s、60℃退火、延伸1 min，35個循環。溶解曲線分析為95℃、15 s，60℃、1 min，95℃、15 s，60℃、15 s。采用2-ΔΔCt法分析目的基因相對表達量。實驗重復3次。
1.5.2 Western
blot檢測RhoA、ROCK蛋白表達參照RIPA裂解液說明書提取細胞蛋白，BCA法蛋白定量，SDS-PAGE凝膠電泳，聚偏氟乙烯膜轉膜，脫脂奶粉封閉，兔抗鼠一抗（1∶1 000）4℃過夜孵育，二抗室溫孵育2 h，洗膜，用ECL試劑盒顯影，應用Quantity One軟件分析蛋白表達水平。實驗重復3次。
1.5.3 細胞增殖檢測
參照CCK-8試劑盒說明書操作，在96孔板中每孔加入100 μL細胞懸液（含4 000個細胞），然后每孔加入10 μL CCK-8溶液，每個樣品6 個復孔。置于37℃、5%CO2細胞培養箱內孵育2 h，應用酶標儀在450 nm波長測定吸光度（A）值。實驗重復3次。
1.6 統計學方法
采用SPSS19.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Tukey HSD法；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 大鼠TSCs形態觀察
倒置相差顯微鏡下觀察示，第2代TSCs呈鵝卵石樣，聚集生長；接種于微溝槽培養皿后呈雜亂生長；牽伸后細胞貼壁良好，無脫落，并沿受力方向排列。見圖 1。
圖1
大鼠TSCs形態觀察 ? 第2代細胞培養3 d（倒置相差顯微鏡× 40） ? 第2代細胞培養3 d（倒置相差顯微鏡× 400） ? 牽伸前細胞在微溝槽培養皿中雜亂生長（倒置相差顯微鏡× 400） ? 8%牽伸組牽伸后1 d細胞沿微溝槽生長（倒置相差顯微鏡× 400） ? ?2.2 不同機械牽伸條件對TSCs中RhoA、ROCK基因表達的影響
各時間點，TSCs中RhoA、ROCK基因相對表達量均隨牽伸應變量的增加呈遞增趨勢，組間比較差異均有統計學意義（P＜ 0.05）。見圖 2。
2.3 不同機械牽伸條件對TSCs中RhoA、ROCK蛋白表達的影響
牽伸1 d時，3組間RhoA、ROCK蛋白表達水平相似，差異無統計學意義（P＞ 0.05）。2、3 d時，4%、8%牽伸組RhoA、ROCK蛋白表達水平顯著高于對照組，且隨牽伸應變量增加呈遞增趨勢；組間比較差異均有統計學意義（P＜ 0.05）。見圖 3、4。
圖3
Western blot檢測各組RhoA、ROCK蛋白表達 Mr：相對分子質量 1：對照組 2：4%牽伸組 3：8%牽伸組 ? 牽伸1 d ? 牽伸2 d ? 牽伸3 d ? ?2.4 不同機械牽伸條件對細胞增殖的影響
各時間點，8%牽伸組細胞增殖顯著低于4%牽伸組及對照組，差異有統計學意義（P＜ 0.05）；4%牽伸組與對照組比較，差異無統計學意義（P＞ 0.05）。見圖 5。
3 討論
研究發現，TSCs在適度機械牽伸條件下可向肌腱方向分化，過度牽伸條件下向非肌腱方向分化，但機械牽伸是如何將力學信號轉化為細胞內的化學信號誘導TSCs分化尚不清楚[13-15]。我們前期研究發現，肌腱細胞在異常牽伸條件下可分泌前列腺素E2、磷脂酶A2、環氧合酶等，引起細胞外基質的改變，這些改變可誘導TSCs向不同方向分化[16]。然而TSCs在機械牽伸條件下是如何產生生物學應答的呢？
研究顯示，機械牽伸可引起細胞外基質改變，作用于整合素家族，通過細胞RhoA/ROCK信號分子的改變引起一系列生物學應答。RhoA為一種小GTP蛋白，參與細胞的收縮、黏附及運動，尤其在細胞應力纖維裝配和黏附斑信號傳導中處于重要地位[17]。ROCK是Rho家族GTP激酶的主要下游效應物，有兩種亞型（ROCKⅠ和ROCKⅡ），廣泛參于細胞黏附、增殖、代謝、凋亡及細胞周期的調節等。RhoA/ROCK分子具有機械敏感性[18]，循環牽伸可使心肌細胞、成纖維細胞、MSCs的RhoA/ROCK分子表達水平上調。當受到外界應力時，RhoA/ROCK通過調節肌動蛋白和肌球蛋白，導致干細胞形狀變化，使干細胞向不同方向分化。Chen 等[19]研究發現，機械牽伸誘導BMSCs向成骨細胞表型分化過程中，RhoA/ROCK是重要的調節因子，參與介導細胞骨架肌動蛋白的組裝、細胞形態及軟骨細胞相關基因的表達。Shi等[20]對TSCs研究發現，在體外2%機械牽伸條件下，RhoA參與了細胞成骨分化的過程。Keung等[21]對神經干細胞研究發現，RhoA參與了神經干細胞的機械化學信號轉導和細胞分化的調節。
本研究采用自行研制的細胞循環牽伸系統，對TSCs采用不同的機械牽伸應變量，在不同時間點觀察RhoA/ROCK分子表達情況，初步分析RhoA/ROCK分子表達與不同機械牽伸條件的關系。結果提示，牽伸1 d后即引起RhoA、ROCK基因表達上調，并隨牽伸應變量的增加而增加，蛋白表達水平在牽伸2、3 d時增高，并且8%應變量變化較大。表明RhoA、ROCK信號分子的表達水平與牽伸應變量有關，但是更多的牽伸條件還需進一步研究。4%牽伸應變量在3 d的牽伸過程中對細胞增殖無顯著影響，而8%牽伸應變量抑制了細胞增殖。表明8%牽伸應變量對TSCs產生了過度牽伸的效果，影響了細胞增殖。
綜上述，體外循環牽伸可使TSCs中 RhoA/ROCK分子表達顯著增高，并且8%牽伸應變量對TSCs產生了過度牽伸的效果。然而牽伸時間對RhoA/ROCK分子表達的影響還不清楚，機械牽伸是否通過RhoA/ROCK分子影響TSCs增殖和分化尚需進一步研究。RhoA/ROCK分子表達調控有可能成為肌腱病發病機制研究領域新的信號分子。
