引用本文： 白云城, 趙學凌, 周如丹, 周志化, 吳雪梅. 動物模型血栓長度及重量比較探索深靜脈血栓形成病變分期. 中國修復重建外科雜志, 2014, 28(4): 507-510. doi: 10.7507/1002-1892.20140114 復制
目前血栓起始、發展、消退等病理生理過程研究已達到分子水平，但具體機制仍未闡明[1-2]。研究認為，淤滯和缺氧導致的靜脈內皮細胞活化是靜脈血栓形成的起始點，分子標志為靜脈內皮細胞釋放的P-選擇素和血管性血友病因子分別與粒細胞釋放的P-選擇素糖蛋白配體1和血小板等成分特異性結合[3-4]。同時，內皮細胞活化導致血液循環中組織因子異常增多，啟動凝血途徑[5]；但在此過程中，參與血栓形成的各因素作用比例、是否還有其他因素參與，目前尚不清楚。另外，研究顯示與炎癥信號通路相關的中性粒細胞增多[6]、氧化應激相關信號通路開啟等分子事件[7]參與了血栓的發展過程，基質金屬蛋白酶家族[8]和纖溶系統[9]參與了血栓的消退過程，但血栓的發展、消退具體機制仍未闡明。動物模型是研究臨床疾病的重要基礎，本實驗選用SD大鼠作為造模動物，應用狹窄法結扎下腔靜脈，造成下腔靜脈血流淤滯，建立下腔靜脈血栓模型，通過比較造模后不同時間點血栓形成長度、重量變化，探討血栓起始、發展、消退等病變分期，為深靜脈血栓形成研究提供實驗依據。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要材料、儀器
健康清潔級雌性SD大鼠48只，體重180～ 230 g，由昆明醫科大學動物實驗中心提供。動物分籠飼養，均給予標準飼料喂養，自由飲水。
10%水合氯醛（昆明醫科大學第一附屬醫院制劑廠）；青霉素（華北制藥有限股份公司）。4-0、5-0愛惜康縫線[強生（中國）醫療器材有限公司]；530-119游標卡尺（精確度0.01 cm；三豐公司，日本）；BSA224S-CW分析天平（精確度0.000 1 g；賽多利斯公司，德國）；RM2235切片機（Leica公司，德國）；CS-V1型攤片烤片機由昆明醫科大學第三附屬醫院病理科提供；手術器械由昆明醫學院外科手術實驗室提 供。
1.2 狹窄法建立下腔靜脈血栓動物模型
取48只大鼠術前12 h禁食，自由飲水。10%水合氯醛（3.5 mL/kg）腹腔注射麻醉，參照文獻[10]方法結扎下腔靜脈，經大鼠腹部正中切口進腹，將小腸牽向術野左側，充分顯露下腔靜脈，打開后腹膜；確認左腎靜脈下方2 mm處的下腔靜脈結扎點，仔細游離下腔靜脈，逐一顯露左腎靜脈以下的下腔靜脈各分支至髂靜脈水平，并用5-0愛惜康縫線結扎各分支。結扎下腔靜脈分支后，在結扎點穿過5-0愛惜康縫線，另取1根4-0愛惜康縫線與下腔靜脈主干并排，5-0縫線方結打結后，抽出并排的4-0縫線，造成下腔靜脈管腔狹窄（圖 1）。操作結束后，確認大鼠呼吸、循環平穩，逐層關腹，皮下灑少許青霉素粉末。術后保持環境溫度約25℃，動物單籠飼養。
圖1
狹窄法建立大鼠下腔靜脈血栓模型示意圖 ? 左腎靜脈下方2 mm處穿過5-0縫線，另取1根4-0縫線與下腔靜脈主干并排 ? 5-0縫線方結打結，抽出4-0縫線 ? ?1.3 觀測指標
1.3.1 大體觀察
術后觀察動物的活動、進食及飲水情況；實驗期間觀察動物存活情況。
1.3.2 下腔靜脈血栓形成觀察
造模后2 h（n=5）、4 h（n=4）、6 h（n=5）、8 h（n=4）、12 h（n=4）、24 h（n=7）、48 h（n=6）、3 d（n=5）、7 d（n=5）、21 d（n=3），分別頸椎脫臼法處死大鼠并取材，游標卡尺測量靜脈血栓長度、分析天平稱量血栓重量。
1.3.3 組織學觀察
按上述時間點取下腔靜脈血栓組織標本，采用4%多聚甲醛固定24 h后，常規石蠟包埋，HE染色觀察。
1.4 統計學方法
采用SPSS17.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，各時間點間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 動物大體觀察
造模后大鼠精神、活動均可，進食及飲水正常。實驗期間無大鼠意外死亡，存活率為100%。
2.2 下腔靜脈血栓形成觀察
造模后2 h開始有血栓形成，典型的血栓形態包括白色血栓和紅色血栓，其中白色血栓主要成分為纖維素和血小板，位于血栓頭部（近心端）；紅色血栓主要成分為紅細胞，位于血栓尾部（遠心端）。造模后2、4 h血栓長度和重量比較差異無統計學意義（P＞ 0.05）；6 h血栓長度和重量顯著上升，6、8、12、24、48 h分別與2、4 h比較差異均有統計學意義（P＜ 0.05），6、8、12、24、48 h各時間點間比較差異無統計學意義（P＞ 0.05）；造模后3 d，血栓開始消退，血栓長度、重量較術后48 h均顯著降低（P＜ 0.05）；7 d血栓長度、重量較3 d進一步降低（P＜ 0.05）；21 d未觀察到血栓，此時下腔靜脈再通。見圖 2。
2.3 組織學觀察
造模后2 h有血栓形成，血管壁內皮細胞排列整齊，無纖維化增生及炎性細胞浸潤；6～48 h，隨造模時間延長，管腔內充血加劇，并有炎性細胞浸潤，以中性粒細胞為主，靜脈血管壁內皮細胞排列整齊；3 d可觀察到血栓機化現象（血栓周圍可見纖維化增生）；7 d血栓仍未完全消退，但機化現象進一步加劇；21 d下腔靜脈血管壁炎性細胞已不多見，血栓和機化的肉芽組織均已消退。見圖 3。
3 討論
血栓長度和重量屬于血栓物理性質的客觀依據，對血栓長度和重量分析是血栓研究的重要內容。稱量血栓重量時連同靜脈壁組織一起稱重，得到的血栓重量稱為“濕重”，已有研究表明不同動物個體靜脈壁組織重量差異對血栓重量分析無顯著影響[11]。因此，本研究中的血栓重量是指“濕重”，避免了剝離靜脈壁，為后續病理組織學觀察提供方便。
1846年Virchow提出血栓形成三大因素（血流狀態改變、靜脈內皮損傷、血液成分改變），奠定了靜脈血栓形成的理論基礎。目前動物血栓造模方法包括鉗夾靜脈組織、電解法刺激靜脈組織等，這些方法通過使靜脈內皮受損，內皮下組織與血液接觸引發血小板聚集，導致血栓形成[11]。這種侵入性造模方法與實際臨床病損有差異。目前觀點認為，手術創傷引起的全身應激狀態、靜脈血液淤滯等是深靜脈血栓形成的誘發因素，血液淤滯或缺氧導致的靜脈內皮細胞活化是血栓形成的觸發點[12-13]。在長時間臥床或制動患者，下肢靜脈血液淤滯，下腔靜脈系統的靜脈竇處于缺氧狀態，淤滯與缺氧相互促進，導致該處靜脈內皮細胞活化，啟動外源性凝血途徑引發血栓。因此引發靜脈血栓的起始事件是靜脈內皮細胞活化而非直接損傷[14]。近年，無血管內皮損傷的動物血栓模型建立方法在國際上已有報道，下腔靜脈結扎模型所選用的動物主要為嚙齒類和靈長類動物兩大類，嚙齒類動物以大鼠、小鼠為主[15-16]，靈長類動物多用狒狒[3]。參考文獻[10]方法，我們采用結扎下腔靜脈方法，限制下腔靜脈的血流引發血栓，建立靜脈內皮未受機械破壞的大鼠下腔靜脈血栓模型。
結扎下腔靜脈主要分為完全結扎法和狹窄法兩種。完全結扎法是完全阻斷下腔靜脈及其側支循環血流，下肢血液只能通過下腔靜脈后側屬支以及門靜脈系統回流，Zhou等[15]報道完全結扎大鼠下腔靜脈后，結扎點以下的靜脈血管迅速擴大膨脹，15 min后即可觀察到微血栓形成，約1 h后所有實驗組大鼠下腔靜脈內均可見到血栓。我們采用下腔靜脈狹窄法造模，結果顯示大鼠在造模后2 h形成血栓，實驗過程中大鼠均無意外死亡，成功建立了下腔靜脈血栓模型。狹窄法造模后的血管內仍有少量血流通過，狹窄導致的血液淤滯和缺氧促使內皮細胞活化，觸發了血栓形成，我們認為這是狹窄法造模成功的機制。在下腔靜脈管腔未完全結扎的情況下，可更好觀察血栓溶解和再通。臨床上將血栓堵塞血管的程度分為完全堵塞、部分堵塞和附壁血栓。完全結扎法完全阻斷了下腔靜脈的血流，僅適用于研究血栓完全堵塞的情況；但完全結扎法也有血栓形成穩定、成栓率高、成栓時間早等優點[17-18]，因此可根據研究側重點來選取適當的造模方 法。
本實驗結果顯示，在狹窄法造模后2 h，結扎點水平以下的下腔靜脈開始有血栓形成，血栓長度、重量隨造模時間延長而增加，造模后6～48 h血栓形成穩定，我們認為這段時間是血栓形成的穩定期或平臺期。造模后3 d，血栓開始出現消退，表現為血栓長度、重量顯著降低，組織學觀察示血栓開始出現機化，標志從此進入血栓消退、機化階段；造模后7 d血栓長度、重量進一步下降，說明血栓消退、機化進程仍在持續；至造模后21 d血栓完全消退，下腔靜脈再通。因此我們認為，大鼠狹窄法造模結束至造模后6 h是血栓形成的起始期，造模后6～48 h是血栓形成的穩定期，造模后3 d進入血栓消退期，至21 d血栓完全消退，下腔靜脈再通。由此我們確定了血栓病理生理過程中的關鍵時間段，為下一步研究提供了實驗依據，為深入研究血栓病理生理進程的分子事件和調控網絡奠定了實驗基礎。
目前血栓起始、發展、消退等病理生理過程研究已達到分子水平，但具體機制仍未闡明[1-2]。研究認為，淤滯和缺氧導致的靜脈內皮細胞活化是靜脈血栓形成的起始點，分子標志為靜脈內皮細胞釋放的P-選擇素和血管性血友病因子分別與粒細胞釋放的P-選擇素糖蛋白配體1和血小板等成分特異性結合[3-4]。同時，內皮細胞活化導致血液循環中組織因子異常增多，啟動凝血途徑[5]；但在此過程中，參與血栓形成的各因素作用比例、是否還有其他因素參與，目前尚不清楚。另外，研究顯示與炎癥信號通路相關的中性粒細胞增多[6]、氧化應激相關信號通路開啟等分子事件[7]參與了血栓的發展過程，基質金屬蛋白酶家族[8]和纖溶系統[9]參與了血栓的消退過程，但血栓的發展、消退具體機制仍未闡明。動物模型是研究臨床疾病的重要基礎，本實驗選用SD大鼠作為造模動物，應用狹窄法結扎下腔靜脈，造成下腔靜脈血流淤滯，建立下腔靜脈血栓模型，通過比較造模后不同時間點血栓形成長度、重量變化，探討血栓起始、發展、消退等病變分期，為深靜脈血栓形成研究提供實驗依據。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要材料、儀器
健康清潔級雌性SD大鼠48只，體重180～ 230 g，由昆明醫科大學動物實驗中心提供。動物分籠飼養，均給予標準飼料喂養，自由飲水。
10%水合氯醛（昆明醫科大學第一附屬醫院制劑廠）；青霉素（華北制藥有限股份公司）。4-0、5-0愛惜康縫線[強生（中國）醫療器材有限公司]；530-119游標卡尺（精確度0.01 cm；三豐公司，日本）；BSA224S-CW分析天平（精確度0.000 1 g；賽多利斯公司，德國）；RM2235切片機（Leica公司，德國）；CS-V1型攤片烤片機由昆明醫科大學第三附屬醫院病理科提供；手術器械由昆明醫學院外科手術實驗室提 供。
1.2 狹窄法建立下腔靜脈血栓動物模型
取48只大鼠術前12 h禁食，自由飲水。10%水合氯醛（3.5 mL/kg）腹腔注射麻醉，參照文獻[10]方法結扎下腔靜脈，經大鼠腹部正中切口進腹，將小腸牽向術野左側，充分顯露下腔靜脈，打開后腹膜；確認左腎靜脈下方2 mm處的下腔靜脈結扎點，仔細游離下腔靜脈，逐一顯露左腎靜脈以下的下腔靜脈各分支至髂靜脈水平，并用5-0愛惜康縫線結扎各分支。結扎下腔靜脈分支后，在結扎點穿過5-0愛惜康縫線，另取1根4-0愛惜康縫線與下腔靜脈主干并排，5-0縫線方結打結后，抽出并排的4-0縫線，造成下腔靜脈管腔狹窄（圖 1）。操作結束后，確認大鼠呼吸、循環平穩，逐層關腹，皮下灑少許青霉素粉末。術后保持環境溫度約25℃，動物單籠飼養。
圖1
狹窄法建立大鼠下腔靜脈血栓模型示意圖 ? 左腎靜脈下方2 mm處穿過5-0縫線，另取1根4-0縫線與下腔靜脈主干并排 ? 5-0縫線方結打結，抽出4-0縫線 ? ?1.3 觀測指標
1.3.1 大體觀察
術后觀察動物的活動、進食及飲水情況；實驗期間觀察動物存活情況。
1.3.2 下腔靜脈血栓形成觀察
造模后2 h（n=5）、4 h（n=4）、6 h（n=5）、8 h（n=4）、12 h（n=4）、24 h（n=7）、48 h（n=6）、3 d（n=5）、7 d（n=5）、21 d（n=3），分別頸椎脫臼法處死大鼠并取材，游標卡尺測量靜脈血栓長度、分析天平稱量血栓重量。
1.3.3 組織學觀察
按上述時間點取下腔靜脈血栓組織標本，采用4%多聚甲醛固定24 h后，常規石蠟包埋，HE染色觀察。
1.4 統計學方法
采用SPSS17.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，各時間點間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 動物大體觀察
造模后大鼠精神、活動均可，進食及飲水正常。實驗期間無大鼠意外死亡，存活率為100%。
2.2 下腔靜脈血栓形成觀察
造模后2 h開始有血栓形成，典型的血栓形態包括白色血栓和紅色血栓，其中白色血栓主要成分為纖維素和血小板，位于血栓頭部（近心端）；紅色血栓主要成分為紅細胞，位于血栓尾部（遠心端）。造模后2、4 h血栓長度和重量比較差異無統計學意義（P＞ 0.05）；6 h血栓長度和重量顯著上升，6、8、12、24、48 h分別與2、4 h比較差異均有統計學意義（P＜ 0.05），6、8、12、24、48 h各時間點間比較差異無統計學意義（P＞ 0.05）；造模后3 d，血栓開始消退，血栓長度、重量較術后48 h均顯著降低（P＜ 0.05）；7 d血栓長度、重量較3 d進一步降低（P＜ 0.05）；21 d未觀察到血栓，此時下腔靜脈再通。見圖 2。
2.3 組織學觀察
造模后2 h有血栓形成，血管壁內皮細胞排列整齊，無纖維化增生及炎性細胞浸潤；6～48 h，隨造模時間延長，管腔內充血加劇，并有炎性細胞浸潤，以中性粒細胞為主，靜脈血管壁內皮細胞排列整齊；3 d可觀察到血栓機化現象（血栓周圍可見纖維化增生）；7 d血栓仍未完全消退，但機化現象進一步加劇；21 d下腔靜脈血管壁炎性細胞已不多見，血栓和機化的肉芽組織均已消退。見圖 3。
3 討論
血栓長度和重量屬于血栓物理性質的客觀依據，對血栓長度和重量分析是血栓研究的重要內容。稱量血栓重量時連同靜脈壁組織一起稱重，得到的血栓重量稱為“濕重”，已有研究表明不同動物個體靜脈壁組織重量差異對血栓重量分析無顯著影響[11]。因此，本研究中的血栓重量是指“濕重”，避免了剝離靜脈壁，為后續病理組織學觀察提供方便。
1846年Virchow提出血栓形成三大因素（血流狀態改變、靜脈內皮損傷、血液成分改變），奠定了靜脈血栓形成的理論基礎。目前動物血栓造模方法包括鉗夾靜脈組織、電解法刺激靜脈組織等，這些方法通過使靜脈內皮受損，內皮下組織與血液接觸引發血小板聚集，導致血栓形成[11]。這種侵入性造模方法與實際臨床病損有差異。目前觀點認為，手術創傷引起的全身應激狀態、靜脈血液淤滯等是深靜脈血栓形成的誘發因素，血液淤滯或缺氧導致的靜脈內皮細胞活化是血栓形成的觸發點[12-13]。在長時間臥床或制動患者，下肢靜脈血液淤滯，下腔靜脈系統的靜脈竇處于缺氧狀態，淤滯與缺氧相互促進，導致該處靜脈內皮細胞活化，啟動外源性凝血途徑引發血栓。因此引發靜脈血栓的起始事件是靜脈內皮細胞活化而非直接損傷[14]。近年，無血管內皮損傷的動物血栓模型建立方法在國際上已有報道，下腔靜脈結扎模型所選用的動物主要為嚙齒類和靈長類動物兩大類，嚙齒類動物以大鼠、小鼠為主[15-16]，靈長類動物多用狒狒[3]。參考文獻[10]方法，我們采用結扎下腔靜脈方法，限制下腔靜脈的血流引發血栓，建立靜脈內皮未受機械破壞的大鼠下腔靜脈血栓模型。
結扎下腔靜脈主要分為完全結扎法和狹窄法兩種。完全結扎法是完全阻斷下腔靜脈及其側支循環血流，下肢血液只能通過下腔靜脈后側屬支以及門靜脈系統回流，Zhou等[15]報道完全結扎大鼠下腔靜脈后，結扎點以下的靜脈血管迅速擴大膨脹，15 min后即可觀察到微血栓形成，約1 h后所有實驗組大鼠下腔靜脈內均可見到血栓。我們采用下腔靜脈狹窄法造模，結果顯示大鼠在造模后2 h形成血栓，實驗過程中大鼠均無意外死亡，成功建立了下腔靜脈血栓模型。狹窄法造模后的血管內仍有少量血流通過，狹窄導致的血液淤滯和缺氧促使內皮細胞活化，觸發了血栓形成，我們認為這是狹窄法造模成功的機制。在下腔靜脈管腔未完全結扎的情況下，可更好觀察血栓溶解和再通。臨床上將血栓堵塞血管的程度分為完全堵塞、部分堵塞和附壁血栓。完全結扎法完全阻斷了下腔靜脈的血流，僅適用于研究血栓完全堵塞的情況；但完全結扎法也有血栓形成穩定、成栓率高、成栓時間早等優點[17-18]，因此可根據研究側重點來選取適當的造模方 法。
本實驗結果顯示，在狹窄法造模后2 h，結扎點水平以下的下腔靜脈開始有血栓形成，血栓長度、重量隨造模時間延長而增加，造模后6～48 h血栓形成穩定，我們認為這段時間是血栓形成的穩定期或平臺期。造模后3 d，血栓開始出現消退，表現為血栓長度、重量顯著降低，組織學觀察示血栓開始出現機化，標志從此進入血栓消退、機化階段；造模后7 d血栓長度、重量進一步下降，說明血栓消退、機化進程仍在持續；至造模后21 d血栓完全消退，下腔靜脈再通。因此我們認為，大鼠狹窄法造模結束至造模后6 h是血栓形成的起始期，造模后6～48 h是血栓形成的穩定期，造模后3 d進入血栓消退期，至21 d血栓完全消退，下腔靜脈再通。由此我們確定了血栓病理生理過程中的關鍵時間段，為下一步研究提供了實驗依據，為深入研究血栓病理生理進程的分子事件和調控網絡奠定了實驗基礎。
