引用本文： 拓振合, 趙琳, 王栓科, 魯永婷, 任廣鐵, 張蒼宇, 庾佳佳, 孫瑞, 汪靜. 組織工程骨膜及脫蛋白骨輔助支架修復兔橈骨大段骨缺損. 中國修復重建外科雜志, 2014, 28(4): 511-516. doi: 10.7507/1002-1892.20140115 復制
四肢長骨易受外界暴力致傷，也是骨腫瘤好發部位，加上感染及醫源性因素，致使長骨大段骨缺損患者數量巨大。傳統治療方法主要有自體、同種異體骨移植修復，但自體骨移植取骨量大、增加額外創傷和感染率，同種異體骨來源有限、生物活性差，且存在免疫排斥和傳染疾病等缺陷，限制了其臨床廣泛應用。近年來，骨組織工程的迅速發展為臨床治療長骨大段骨缺損帶來了希望[1]。本實驗將目前研究較為成熟的BMSCs成骨誘導后作為種子細胞復合豬小腸黏膜下層（small intestinal submucosa，SIS）構建組織工程骨膜，并以同種異體脫蛋白骨（deproteinized bone，DPB）作為組織工程骨膜的輔助內支撐物，探索其體內修復兔橈骨大段骨缺損的可行性，為將來臨床應用提供實驗依據。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
1月齡清潔級新西蘭大白兔3只，雌雄不限，體重0.5～0.6 kg；4月齡清潔級新西蘭大白兔60只，雌雄不限，體重2～3 kg；均由蘭州大學實驗動物中心提供。健康成年家豬1只，由蘭州市肉聯廠提供。
L/H-DMEM、FBS（HyClone公司，美國）；胰蛋白酶、地塞米松、維生素C、β-甘油磷酸鈉（Amresco公司，美國）。倒置相差顯微鏡（Olympus公司，日本）；掃描電鏡（JEOL公司，日本）。
1.2 組織工程骨膜制備
1.2.1 BMSCs分離與成骨誘導培養
取1月齡清潔級新西蘭大白兔3只，按文獻[2]方法分離培養BMSCs。消化收集第3代BMSCs，換用成骨誘導培養液（含10%FBS、10 mmol/L β-甘油磷酸鈉、50 mg/L維生素C、1 × 10-8 mol/L地塞米松的H-DMEM）繼續培養14 d，用于構建組織工程骨膜。倒置相差顯微鏡觀察原代及誘導后細胞形態學變化。
1.2.2 SIS制備
健康成年家豬處死后4 h內取小腸，按文獻[3]方法制備SIS，制成大小為4 cm × 4 cm。分別置入培養瓶中，每瓶1片，加入3 mL成骨誘導培養液；然后將培養瓶置于37℃、5%CO2及飽和濕度培養箱中預濕12 h后，更換成骨誘導培養液繼續預濕12 h，PBS反復沖洗3次備用。
1.2.3 組織工程骨膜體外構建
消化收集成骨誘導14 d的BMSCs，以離心半徑4.5 cm、1 000 r/min離心5 min，棄上清，調整細胞濃度為5 ×109個/L，立即用微量移液器滴加至培養瓶中的SIS上，每片50 μL。將培養瓶置于37℃、5%CO2及飽和濕度培養箱中靜置5 h，再加入3 mL成骨誘導培養液繼續培養7 d。
1.3 DPB及組織工程骨膜/DPB復合體制備
取4月齡清潔級新西蘭大白兔12只，空氣栓塞法處死后，切取雙側橈骨并去掉干骺端，在骨段上細密打孔若干后，按文獻[4]方法進行脫蛋白處理，去除抗原性，制成僅保留無機鹽成分的支架材料，封口塑料包裝后以60Co輻照消毒，作為組織工程骨膜輔助內支撐物。
無菌環境下，取生理鹽水浸泡8 h預濕處理后的DPB，用組織工程骨膜呈“外套狀”包被，兩端以可吸收縫線捆扎，使組織工程骨膜緊貼DPB，制備組織工程骨膜/DPB復合體。
1.4 動物模型制備及實驗分組
取4月齡清潔級新西蘭大白兔48只，隨機分成A、B、C、D 4組，每組12只。各組動物均以3%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）腹腔注射麻醉，俯臥位固定，于左前肢橈側中段作縱切口，逐層顯露橈骨中段，切除橈骨干3.5 cm長骨段，并徹底切除該段骨膜，制備左側橈骨大段骨缺損動物模型。A組于骨缺損處植入組織工程骨膜，植入的膜狀物拉伸呈圓桶狀纏繞于骨缺損兩斷端上，膜對合緣以7-0無創傷縫線縫合，兩端縫合固定于骨斷端殘余骨膜或周圍軟組織上，避免膜皺縮；B組于骨缺損處植入與缺損長度相等的DPB，緊嵌于兩斷端之間，接觸斷面打孔以可吸收縫線縫合固定；C組于骨缺損處植入組織工程骨膜/DPB復合體，同B組方法固定縫合；D組骨缺損處曠置，作為空白對照。1號絲線逐層縫合傷口。術后各組實驗動物左前肢以管型石膏作保護性制動，石膏開槽以便換藥及觀察，4周后拆除石膏。動物分籠飼養，術后連續3 d肌肉注射青霉素4萬U/d，預防感染。
1.5 觀測指標
1.5.1 材料大體及掃描電鏡觀察
對SIS、組織工程骨膜、DPB及組織工程骨膜/DPB復合體行大體觀察；對SIS和復合培養7 d的組織工程骨膜行掃描電鏡觀察。
1.5.2 實驗動物大體觀察
術后觀察實驗動物飲食、日常行為、切口情況及傷肢負重情況。
1.5.3 X線片觀察
各組分別于術后4、8、12周隨機取4只動物，對骨缺損區行X線片檢查，并按Lane等[5]影像學評分標準進行評分。
1.5.4 組織學觀察
各組于術后8周X線片檢查后隨機取4只動物，空氣栓塞法處死后，取骨缺損區組織標本常規固定、脫鈣、脫水、包埋、3～4 μm厚切片，行HE及Masson染色觀察。
1.6 統計學方法
采用SSPS17.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 細胞形態學觀察
原代BMSCs接種3 d呈短棒形、梭形及不規則形狀。第3代BMSCs經成骨誘導14 d后細胞體積增大，以三角形、方形及多邊形為主。見圖 1。
圖1
細胞形態學觀察（倒置相差顯微鏡×100） ? 原代接種3 d BMSCs ? 第3代BMSCs成骨誘導后14 d ? ?2.2 材料大體及掃描電鏡觀察
SIS呈白色，薄膜狀，厚度約100 μm；復合BMSCs構建的組織工程骨膜質地柔軟，韌性好，外形與生理骨膜相似；DPB呈白色，質硬脆，髓腔內中空；組織工程骨膜與DPB復合后，組織工程骨膜包繞DPB，透過組織工程骨膜DPB清晰可見。見圖 2。
掃描電鏡觀察示，單純SIS膠原纖維縱橫交錯；而復合培養7 d的組織工程骨膜可見SIS上黏附大量細胞。見圖 3。
2.3 實驗動物大體觀察
4組動物術后飲食及日常行為基本正常，切口對合良好，無紅腫。術后4周拆除石膏后，傷肢基本能負重行走。
2.4 X線片觀察
A組：術后4周骨缺損處有長柱狀新生骨形成，并與截骨斷端骨性融合，密度與正常骨相近；8周時新生骨量增多，并可見不規則骨髓腔；12周時骨髓腔已貫通。B組：術后4周可見植入的DPB，植入前DPB上所打的小孔清晰可見；8周時兩截骨斷端變鈍，有少許延長，并可見DPB降解跡象；12周時仍可見植入的DPB，與術后8周相比降解不明顯。C組：術后4周有新生骨組織包被DPB，DPB上的小孔已模糊；8周時已不見小孔，植入的組織工程骨膜/DPB復合體與截骨斷端有部分骨性融合；12周時植入的組織工程骨膜/DPB復合體與截骨斷端骨性融合，未見明顯的植入物DPB，新生骨可見串珠狀連續不規則骨髓腔。D組至12周時兩截骨斷端僅有少許骨性延長，骨缺損處無成骨征象，密度與周圍軟組織影相似。見圖 4。
各組X線片評分隨時間延長均逐漸遞增，組內各時間點間比較差異均有統計學意義（P＜ 0.05）。術后各時間點A、C組評分顯著高于B、D組，A組高于C組，B組高于D組，差異均有統計學意義（P＜ 0.05）。見表 1。
表1
術后各時間點各組X線片評分比較（n=4，2.5 組織學觀察
HE染色：A組骨缺損處有新骨形成，骨組織中可見血管腔及不規則髓腔樣結構，未見明顯異物巨噬細胞及淋巴細胞浸潤征象；B組骨缺損區未見明顯新骨生成，仍可見植入的DPB；C組骨缺損處有新骨形成并包被植入的DPB，骨組織中可見血管腔及不規則髓腔樣結構，DPB降解吸收跡象明顯，DPB量明顯少于B組；D組骨缺損處僅見膠原瘢痕組織形成。見圖 5。
Masson染色：A組骨缺損中段處可見大量藍染新生骨組織；B組骨缺損區仍可見植入的大量DPB，同時可見極少量新生骨；C組骨缺損處有較多藍染新骨形成并包被植入的DPB；D組僅見藍染的膠原纖維，未發現新生骨組織。見圖 6。
圖5
術后8周各組HE染色觀察（× 200） 黑箭頭示新生骨，白箭頭示DPB，紅箭頭示膠原瘢痕組織 ? A組 ? B組 ? C組 ? D組 ? ?3 討論
骨膜是致密的結締組織纖維膜，分為骨表面的骨外膜和骨髓腔面的骨內膜。骨膜細胞有MSCs的特性和良好的成骨、成軟骨分化潛能[6]，自體移植能夠生成骨和軟骨[7]，臨床已有骨膜移植修復骨缺損、骨不連的相關報道[8-9]。然而自體骨膜移植來源有限，并以犧牲自身正常組織為代價，同時供區存在感染等風險。構建組織工程骨膜應用于臨床有一定實用意義。
本課題組既往采用BMSCs成骨誘后接種于SIS制備組織工程骨膜[10]，顯示了較好骨缺損修復能力。本實驗中BMSCs與SIS復合培養7 d后掃描電鏡觀察見BMSCs大量黏附于SIS上，生長狀態良好，表明SIS與BMSCs之間具有良好的生物相容性，以BMSCs與SIS體外構建組織工程骨膜切實可行。
本研究動物實驗結果表明，組織工程骨膜在兔體內有很強的成骨能力，可以修復兔橈骨大段骨缺損。不足的是組織工程骨膜質軟，易受到肌肉等軟組織擠壓而變形，雖然在兔體內可修復橈骨大段骨缺損，但兔骨管腔直徑與人體長管狀骨相差較大，若組織工程骨膜植入體內，受擠壓變形后，可能不利于形成規則的長管狀骨。我們制備了DPB作為組織工程骨膜的輔助支架，設想隨著新骨生成，DPB不斷被吸收，其礦物質被新生骨組織所利用，達到支撐與促進新骨生成的作用。然而從本實驗結果看，C組骨形成、骨連接、骨塑形方面均差于A組。原因可能有以下三方面：首先，從X線片及組織學觀察結果看，DPB降解速度慢于組織工程骨膜新骨形成速度，因此制備的DPB對新骨形成起到空間位阻的負面作用，影響了組織工程骨膜在體內成骨；其次，目前普遍認為DPB只有載體作用，無成骨及成骨誘導作用，這一點與B組結果一致；第三，DPB雖然保留了原骨的三維網狀孔隙結構，但細胞長入必須依賴良好的營養物質供應，而體內只有距毛細血管20～200 μm的細胞才能通過彌散作用獲得營養[11]，故由于營養物質缺乏，細胞很難長入DPB，而單純組織工程骨膜在成骨同時建立了較完善的顯微脈管系統，保證了營養物質的供應。我們按文獻[4]方法制備的DPB質硬脆，強度差，究其原因可能是蛋白質和膠原纖維被徹底破壞。脫蛋白越完全，其生物相容性越好，但生物力學強度越差[12]。有學者通過改良方法制備DPB，盡量保留膠原蛋白，去除非膠原蛋白及肽類等，以達到降低抗原的同時保留力學強度[13]。
綜上述，體外構建組織工程骨膜切實可行，組織工程骨膜在兔體內有較強的成骨能力，可修復兔橈骨大段骨缺損，但DPB作為組織工程骨膜的輔助支架效果欠佳，有待進一步探索。在今后研究中，需要進一步進行改良、修飾DPB相關的實驗研究，使其有更好的力學強度及生物相容性，或者探索其他材料如金屬、生物降解陶瓷等作為組織工程骨膜的輔助支架。本實驗不足之處包括未進行新生骨骨密度測定及生物力學檢測等；以及種子細胞大量擴增后遺傳物質有無改變，成骨誘導后的細胞遠期生物安全性問題及組織工程骨膜體內成骨的機制等，均有待深入研究明確。
四肢長骨易受外界暴力致傷，也是骨腫瘤好發部位，加上感染及醫源性因素，致使長骨大段骨缺損患者數量巨大。傳統治療方法主要有自體、同種異體骨移植修復，但自體骨移植取骨量大、增加額外創傷和感染率，同種異體骨來源有限、生物活性差，且存在免疫排斥和傳染疾病等缺陷，限制了其臨床廣泛應用。近年來，骨組織工程的迅速發展為臨床治療長骨大段骨缺損帶來了希望[1]。本實驗將目前研究較為成熟的BMSCs成骨誘導后作為種子細胞復合豬小腸黏膜下層（small intestinal submucosa，SIS）構建組織工程骨膜，并以同種異體脫蛋白骨（deproteinized bone，DPB）作為組織工程骨膜的輔助內支撐物，探索其體內修復兔橈骨大段骨缺損的可行性，為將來臨床應用提供實驗依據。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
1月齡清潔級新西蘭大白兔3只，雌雄不限，體重0.5～0.6 kg；4月齡清潔級新西蘭大白兔60只，雌雄不限，體重2～3 kg；均由蘭州大學實驗動物中心提供。健康成年家豬1只，由蘭州市肉聯廠提供。
L/H-DMEM、FBS（HyClone公司，美國）；胰蛋白酶、地塞米松、維生素C、β-甘油磷酸鈉（Amresco公司，美國）。倒置相差顯微鏡（Olympus公司，日本）；掃描電鏡（JEOL公司，日本）。
1.2 組織工程骨膜制備
1.2.1 BMSCs分離與成骨誘導培養
取1月齡清潔級新西蘭大白兔3只，按文獻[2]方法分離培養BMSCs。消化收集第3代BMSCs，換用成骨誘導培養液（含10%FBS、10 mmol/L β-甘油磷酸鈉、50 mg/L維生素C、1 × 10-8 mol/L地塞米松的H-DMEM）繼續培養14 d，用于構建組織工程骨膜。倒置相差顯微鏡觀察原代及誘導后細胞形態學變化。
1.2.2 SIS制備
健康成年家豬處死后4 h內取小腸，按文獻[3]方法制備SIS，制成大小為4 cm × 4 cm。分別置入培養瓶中，每瓶1片，加入3 mL成骨誘導培養液；然后將培養瓶置于37℃、5%CO2及飽和濕度培養箱中預濕12 h后，更換成骨誘導培養液繼續預濕12 h，PBS反復沖洗3次備用。
1.2.3 組織工程骨膜體外構建
消化收集成骨誘導14 d的BMSCs，以離心半徑4.5 cm、1 000 r/min離心5 min，棄上清，調整細胞濃度為5 ×109個/L，立即用微量移液器滴加至培養瓶中的SIS上，每片50 μL。將培養瓶置于37℃、5%CO2及飽和濕度培養箱中靜置5 h，再加入3 mL成骨誘導培養液繼續培養7 d。
1.3 DPB及組織工程骨膜/DPB復合體制備
取4月齡清潔級新西蘭大白兔12只，空氣栓塞法處死后，切取雙側橈骨并去掉干骺端，在骨段上細密打孔若干后，按文獻[4]方法進行脫蛋白處理，去除抗原性，制成僅保留無機鹽成分的支架材料，封口塑料包裝后以60Co輻照消毒，作為組織工程骨膜輔助內支撐物。
無菌環境下，取生理鹽水浸泡8 h預濕處理后的DPB，用組織工程骨膜呈“外套狀”包被，兩端以可吸收縫線捆扎，使組織工程骨膜緊貼DPB，制備組織工程骨膜/DPB復合體。
1.4 動物模型制備及實驗分組
取4月齡清潔級新西蘭大白兔48只，隨機分成A、B、C、D 4組，每組12只。各組動物均以3%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）腹腔注射麻醉，俯臥位固定，于左前肢橈側中段作縱切口，逐層顯露橈骨中段，切除橈骨干3.5 cm長骨段，并徹底切除該段骨膜，制備左側橈骨大段骨缺損動物模型。A組于骨缺損處植入組織工程骨膜，植入的膜狀物拉伸呈圓桶狀纏繞于骨缺損兩斷端上，膜對合緣以7-0無創傷縫線縫合，兩端縫合固定于骨斷端殘余骨膜或周圍軟組織上，避免膜皺縮；B組于骨缺損處植入與缺損長度相等的DPB，緊嵌于兩斷端之間，接觸斷面打孔以可吸收縫線縫合固定；C組于骨缺損處植入組織工程骨膜/DPB復合體，同B組方法固定縫合；D組骨缺損處曠置，作為空白對照。1號絲線逐層縫合傷口。術后各組實驗動物左前肢以管型石膏作保護性制動，石膏開槽以便換藥及觀察，4周后拆除石膏。動物分籠飼養，術后連續3 d肌肉注射青霉素4萬U/d，預防感染。
1.5 觀測指標
1.5.1 材料大體及掃描電鏡觀察
對SIS、組織工程骨膜、DPB及組織工程骨膜/DPB復合體行大體觀察；對SIS和復合培養7 d的組織工程骨膜行掃描電鏡觀察。
1.5.2 實驗動物大體觀察
術后觀察實驗動物飲食、日常行為、切口情況及傷肢負重情況。
1.5.3 X線片觀察
各組分別于術后4、8、12周隨機取4只動物，對骨缺損區行X線片檢查，并按Lane等[5]影像學評分標準進行評分。
1.5.4 組織學觀察
各組于術后8周X線片檢查后隨機取4只動物，空氣栓塞法處死后，取骨缺損區組織標本常規固定、脫鈣、脫水、包埋、3～4 μm厚切片，行HE及Masson染色觀察。
1.6 統計學方法
采用SSPS17.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 細胞形態學觀察
原代BMSCs接種3 d呈短棒形、梭形及不規則形狀。第3代BMSCs經成骨誘導14 d后細胞體積增大，以三角形、方形及多邊形為主。見圖 1。
圖1
細胞形態學觀察（倒置相差顯微鏡×100） ? 原代接種3 d BMSCs ? 第3代BMSCs成骨誘導后14 d ? ?2.2 材料大體及掃描電鏡觀察
SIS呈白色，薄膜狀，厚度約100 μm；復合BMSCs構建的組織工程骨膜質地柔軟，韌性好，外形與生理骨膜相似；DPB呈白色，質硬脆，髓腔內中空；組織工程骨膜與DPB復合后，組織工程骨膜包繞DPB，透過組織工程骨膜DPB清晰可見。見圖 2。
掃描電鏡觀察示，單純SIS膠原纖維縱橫交錯；而復合培養7 d的組織工程骨膜可見SIS上黏附大量細胞。見圖 3。
2.3 實驗動物大體觀察
4組動物術后飲食及日常行為基本正常，切口對合良好，無紅腫。術后4周拆除石膏后，傷肢基本能負重行走。
2.4 X線片觀察
A組：術后4周骨缺損處有長柱狀新生骨形成，并與截骨斷端骨性融合，密度與正常骨相近；8周時新生骨量增多，并可見不規則骨髓腔；12周時骨髓腔已貫通。B組：術后4周可見植入的DPB，植入前DPB上所打的小孔清晰可見；8周時兩截骨斷端變鈍，有少許延長，并可見DPB降解跡象；12周時仍可見植入的DPB，與術后8周相比降解不明顯。C組：術后4周有新生骨組織包被DPB，DPB上的小孔已模糊；8周時已不見小孔，植入的組織工程骨膜/DPB復合體與截骨斷端有部分骨性融合；12周時植入的組織工程骨膜/DPB復合體與截骨斷端骨性融合，未見明顯的植入物DPB，新生骨可見串珠狀連續不規則骨髓腔。D組至12周時兩截骨斷端僅有少許骨性延長，骨缺損處無成骨征象，密度與周圍軟組織影相似。見圖 4。
各組X線片評分隨時間延長均逐漸遞增，組內各時間點間比較差異均有統計學意義（P＜ 0.05）。術后各時間點A、C組評分顯著高于B、D組，A組高于C組，B組高于D組，差異均有統計學意義（P＜ 0.05）。見表 1。
表1
術后各時間點各組X線片評分比較（n=4，2.5 組織學觀察
HE染色：A組骨缺損處有新骨形成，骨組織中可見血管腔及不規則髓腔樣結構，未見明顯異物巨噬細胞及淋巴細胞浸潤征象；B組骨缺損區未見明顯新骨生成，仍可見植入的DPB；C組骨缺損處有新骨形成并包被植入的DPB，骨組織中可見血管腔及不規則髓腔樣結構，DPB降解吸收跡象明顯，DPB量明顯少于B組；D組骨缺損處僅見膠原瘢痕組織形成。見圖 5。
Masson染色：A組骨缺損中段處可見大量藍染新生骨組織；B組骨缺損區仍可見植入的大量DPB，同時可見極少量新生骨；C組骨缺損處有較多藍染新骨形成并包被植入的DPB；D組僅見藍染的膠原纖維，未發現新生骨組織。見圖 6。
圖5
術后8周各組HE染色觀察（× 200） 黑箭頭示新生骨，白箭頭示DPB，紅箭頭示膠原瘢痕組織 ? A組 ? B組 ? C組 ? D組 ? ?3 討論
骨膜是致密的結締組織纖維膜，分為骨表面的骨外膜和骨髓腔面的骨內膜。骨膜細胞有MSCs的特性和良好的成骨、成軟骨分化潛能[6]，自體移植能夠生成骨和軟骨[7]，臨床已有骨膜移植修復骨缺損、骨不連的相關報道[8-9]。然而自體骨膜移植來源有限，并以犧牲自身正常組織為代價，同時供區存在感染等風險。構建組織工程骨膜應用于臨床有一定實用意義。
本課題組既往采用BMSCs成骨誘后接種于SIS制備組織工程骨膜[10]，顯示了較好骨缺損修復能力。本實驗中BMSCs與SIS復合培養7 d后掃描電鏡觀察見BMSCs大量黏附于SIS上，生長狀態良好，表明SIS與BMSCs之間具有良好的生物相容性，以BMSCs與SIS體外構建組織工程骨膜切實可行。
本研究動物實驗結果表明，組織工程骨膜在兔體內有很強的成骨能力，可以修復兔橈骨大段骨缺損。不足的是組織工程骨膜質軟，易受到肌肉等軟組織擠壓而變形，雖然在兔體內可修復橈骨大段骨缺損，但兔骨管腔直徑與人體長管狀骨相差較大，若組織工程骨膜植入體內，受擠壓變形后，可能不利于形成規則的長管狀骨。我們制備了DPB作為組織工程骨膜的輔助支架，設想隨著新骨生成，DPB不斷被吸收，其礦物質被新生骨組織所利用，達到支撐與促進新骨生成的作用。然而從本實驗結果看，C組骨形成、骨連接、骨塑形方面均差于A組。原因可能有以下三方面：首先，從X線片及組織學觀察結果看，DPB降解速度慢于組織工程骨膜新骨形成速度，因此制備的DPB對新骨形成起到空間位阻的負面作用，影響了組織工程骨膜在體內成骨；其次，目前普遍認為DPB只有載體作用，無成骨及成骨誘導作用，這一點與B組結果一致；第三，DPB雖然保留了原骨的三維網狀孔隙結構，但細胞長入必須依賴良好的營養物質供應，而體內只有距毛細血管20～200 μm的細胞才能通過彌散作用獲得營養[11]，故由于營養物質缺乏，細胞很難長入DPB，而單純組織工程骨膜在成骨同時建立了較完善的顯微脈管系統，保證了營養物質的供應。我們按文獻[4]方法制備的DPB質硬脆，強度差，究其原因可能是蛋白質和膠原纖維被徹底破壞。脫蛋白越完全，其生物相容性越好，但生物力學強度越差[12]。有學者通過改良方法制備DPB，盡量保留膠原蛋白，去除非膠原蛋白及肽類等，以達到降低抗原的同時保留力學強度[13]。
綜上述，體外構建組織工程骨膜切實可行，組織工程骨膜在兔體內有較強的成骨能力，可修復兔橈骨大段骨缺損，但DPB作為組織工程骨膜的輔助支架效果欠佳，有待進一步探索。在今后研究中，需要進一步進行改良、修飾DPB相關的實驗研究，使其有更好的力學強度及生物相容性，或者探索其他材料如金屬、生物降解陶瓷等作為組織工程骨膜的輔助支架。本實驗不足之處包括未進行新生骨骨密度測定及生物力學檢測等；以及種子細胞大量擴增后遺傳物質有無改變，成骨誘導后的細胞遠期生物安全性問題及組織工程骨膜體內成骨的機制等，均有待深入研究明確。
