引用本文： 魏富鑫, 王樂, 周治宇, 崔尚斌, 劉少喻, 鄒學農, 鐘銳, 梁子建. 恒河猴腰椎間盤缺血性退變模型的建立. 中國修復重建外科雜志, 2014, 28(4): 485-490. doi: 10.7507/1002-1892.20140109 復制
目前研究認為，椎間盤軟骨終板下骨的微循環障礙是導致椎間盤退變的重要原因之一[1]。因此建立一種可靠的椎體終板下骨缺血性腰椎間盤退變模型，可為研究椎間盤退變病因和治療提供理想研究平臺[2]。既往椎間盤退變動物模型主要是通過破壞椎間盤自身結構/生物力學環境或基因敲除技術獲得[3-8]，與人類椎間盤退變過程存在較大差異。鑒于椎間盤的營養主要來自于椎體終板下毛細血管，有學者提出采用穿刺兔腰椎椎體終板下骨注射去血管化藥物平陽霉素破壞微循環，進而破壞椎體血供誘發椎間盤退變，形成兔椎體終板下缺血模型[9]。然而，兔腰椎間盤退變模型不具有人類腰椎間盤退變特有的力學環境，與人類退變椎間盤生理仍存在差距。靈長類動物椎間盤結構與人類相似，為此本研究擬通過靈長類動物恒河猴椎體終板下骨注射平陽霉素誘導缺血性腰椎間盤退變，并以T1ρ-MRI自旋鎖定成像和T2-mapping技術[10-11]定量檢測動物模型椎間盤細胞外基質變化，結合病理學觀察評價其退變過程，為椎間盤退變相關研究以及臨床前試驗提供更為可靠的動物實驗模型。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要材料
正常清潔級雌性恒河猴12只，年齡4～6歲，平均5.1歲；體重4.4～6.1 kg，平均5.6 kg；由廣東藍島動物實驗中心提供。術前行X線片檢查排除脊柱畸形等異常。動物單籠飼養，室溫控制在25℃左右。平陽霉素粉針（8 mg/支；天津太河制藥有限公司）。17 G × 10 cm骨穿刺針（Angiomed 公司，德國）。
1.2 實驗動物處理
取12只實驗動物，以地西泮（2.5 mg/kg）和氯胺酮（10 mg/kg）肌肉注射麻醉，取仰臥位，行下腹部前外側斜切口腹膜外入路。沿腹外斜肌肌纖維方向分開，并依次按同一方向切斷和分離深層的腹內斜肌和腹橫肌，進入腹膜后隙，充分暴露腰椎椎體及椎間盤。于椎體側方中點并終板下0.5 cm處，平行于椎體終板及椎體冠狀面進針，用直徑1.5 mm的鉆頭鉆孔，深度達椎體橫徑的2/3（根據術前X線片測量）。鉆孔后，用針頭尾端黏有骨蠟的注射器進行注射，實驗組于L5、6椎間盤相鄰的上、下終板各緩慢注射平陽霉素（2 mg/mL）1 mL，對照組于同只動物L4、5椎間盤相鄰的上、下終板各緩慢注射生理鹽水1 mL；注射持續5 min，退出針頭骨蠟封閉鉆孔處。術前及手術結束時分別靜脈滴注頭孢曲松鈉（80 mg/kg），術后單籠自由喂養，通風，接受自然光。
1.3 觀測指標
1.3.1 MRI
檢查及圖像數據處理 術前及術后1、4、12周行MRI檢查，使用Philips 1.5 Tesla MRI儀（Philips公司，荷蘭）掃描，采用8通道腰椎線圈。T1WI和T2WI采用快速自旋回波脈沖序列，T2-mapping技術處理前的T2WI圖像采集采用多回波SE序列，T1ρ-mapping采用快速自旋鎖定脈沖序列，動態增強MRI采用矢狀位T1-脂肪抑制快速自旋回波序列。掃描參數：T1WI：回波時間12 ms，脈沖重復時間540 ms，視野（field of view，FOV）200 mm，層厚2～3 mm；T2WI：回波時間100 ms，脈沖重復時間1 900 ms；T1ρ-MRI掃描采用矢狀位，FOV 28 cm × 28 cm，層厚 3 cm，層間距0.3 cm，自旋鎖定時間設為15、30、45、 60 ms，獲取4組T1ρ-MRI圖像。并根據椎間盤退變Pfirrmann分級標準[12]，對恒河猴L4、5及L5、6椎間盤進行分 級。
將4組TSL不同的T1ρ-MRI圖像輸入T1ρ圖像處理程序（通過國際合作已由丹麥奧胡斯大學協助在本院安裝、測試與使用）自動處理，經T1ρ-mapping產生T1ρ圖，選定感興趣區域（range of interest，ROI），ROI為直徑5 mm圓圈，定位于髓核中央（圖 1），測量并記錄T1ρ弛豫時間值，T1ρ與TSL之間滿足指數方程關系S（TSL）= S0e-TSL/T1ρ[10]（S為自旋量子數、S0是未擴散加權的梯度脈沖的開始信號強度）。利用T2-mapping序列所得的圖像計算T2 map弛豫時間值，比較術前及術后椎間盤T1ρ和T2 map弛豫時間值。
圖1
恒河猴腰椎間盤T1ρ圖像以及髓核ROI選擇
Figure1.
T1ρ maps and the range of interest of the nucleus pulposus of rhesus macaques lumbar intervertebral disk
將術前和術后各時間點經椎間盤中份的T2WI 軸位像輸入骨科計算機影像分析系統（Philips公司，荷蘭），測量整個椎間盤和其內呈高信號區域的面積（顯示器亮度、對比度、色度、清晰度恒定，測量者與本實驗無關），每幅圖像重復測量3 次，取均值，計算椎間盤內高信號區域面積占整個椎間盤面積的百分比。
1.3.2 大體觀察及組織學觀察
術后4、12周完成 MRI檢查后，采用隨機數字法各取6只恒河猴，用相同手術方式取出實驗組和對照組椎間盤及其上、下軟骨終板，大體觀察標本顏色、周圍軟組織反應情況等。標本取與椎體矢狀面呈30°的剖面，40 g/L多聚甲醛固定1周后，Plank-Rycholo液脫鈣5～7 d，石蠟包埋、切片及再固定，系列乙醇脫水，石蠟包埋，5 μm厚組織切片，行HE染色觀察。
1.4 統計學方法
采用SPSS16.0統計軟件進行分析。數據以均數 ± 標準差表示，組內各時間點間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗；兩組間比較采用配對t檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 MRI 檢查及圖像數據處理
根據Pfirrmann 分級標準，實驗組術前及對照組各時間點椎間盤分級均為Ⅰ級；實驗組術后4周Ⅰ級8 例、Ⅱ級4例，術后12周Ⅱ級7例、Ⅲ級5例。對照組手術前后各時間點間椎間盤T1ρ、T2 map弛豫時間值與術前比較差異均無統計學意義（P＞ 0.05）。術后1 周，實驗組T1ρ弛豫時間值即開始下降，但與術前比較差異無統計學意義（P＞ 0.05）；術后4、12周持續下降，與術前及術后1周比較差異有統計學意義（P＜ 0.05）；術后12周與4周比較差異亦有統計學意義（P＜ 0.05）。而實驗組T2 map弛豫時間值在術后1、4周與術前比較差異無統計學意義（P＞ 0.05）；但術后12周明顯下降，與其余時間點比較差異均有統計學意義（P＜ 0.05）。對照組與實驗組間除術后4、12周T1ρ弛豫時間值及術后12周T2 map弛豫時間值比較差異有統計學意義（P＜ 0.05）外，其余時間點兩組間比較差異均無統計學意義（P＞ 0.05）。見表 1、2。
表1
兩組手術前后各時間點腰椎間盤髓核T1ρ弛豫時間值變化（
表2
兩組手術前后各時間點腰椎間盤髓核T2 map弛豫時間值變化（對照組及實驗組手術前后各時間點間椎間盤T2WI 軸位髓核高信號區域面積占整個椎間盤面積的 百分比比較，差異均無統計學意義（P＞ 0.05）；各時間點兩組間比較差異亦無統計學意義（P＞ 0.05）。見表 3。
表3
兩組手術前后各時間點椎間盤T2WI 軸位髓核高信號區面積占整個椎間盤面積百分比（%，2.2 大體觀察及組織學觀察
兩組手術過程順利，術后實驗動物均存活，無截癱及感染等并發癥發生。椎間盤標本均順利取出，顏色正常，椎前軟組織少量肉芽形成，未見明顯水腫及炎性改變。
HE染色示，對照組各時間點椎間盤髓核及纖維環結構均未見明顯紊亂，未見裂隙及塌陷等結構異常。實驗組術后4周纖維環排列尚規則，髓核排列稍紊亂，髓核功能性細胞數目減少；12周內層纖維環出現裂隙，髓核中心功能性細胞數目進行性減少，部分髓核被混亂的纖維組織所代替。見圖 2。
圖2
術后各時間點兩組HE染色觀察 ? 實驗組4周（× 40） 箭頭示髓核細胞排列紊亂 ? 實驗組4周（×100） 箭頭示髓核中心功能性細胞數目減少 ? 實驗組12周（× 40） 箭頭示髓核中心功能性細胞數目進行性減少，部分髓核被混亂的纖維組織所代替 ? 實驗組12周（×100） 箭頭示內層纖維環出現裂隙 ? 對照組4周（× 40） ? 對照組4周（×100） ? 對照組12周（× 40） ? 對照組12周（×100）
Figure2.
HE staining observation of 2 groups at different time points ? Experimental group at 4 weeks (× 40) Arrow indicated arrangement disorder of nucleus pulposus cells ? Experimental group at 4 weeks (×100) Arrow indicated reduced number of functional cells in the nucleus center ? Experimental group at 12 weeks (× 40) Arrow indicated the progressively reduced number of functional cells in the nucleus center,part of the nucleus was replaced by disordered fibrous tissue ? Experimental group at 12 weeks (×100) Arrow indicated the annulus inner fissures ? Control group at 4 weeks (× 40) ? Control group at 4 weeks (×100) ? Control group at 12 weeks (× 40) ? Control group at 12 weeks (×100)
3 討論
椎間盤退變性疾病是臨床常見病和多發病，也是下腰痛的主要原因，但目前其病因和病理生理機制尚未明確。建立一種可靠的椎間盤退變動物模型不僅能夠為研究其退變發病機制提供有利條件，更可為修復治療退變椎間盤的各種研究提供良好的實驗載體[5]。自Lob于1933年首次成功制備椎間盤退變動物模型后，不同方法和不同物種的動物模型相繼建立，所選擇物種和方法的可靠性與可重復性亦存在較大差異。方法學上主要包括自然退變和誘發退變。自然退變動物病變特點相對接近人類椎間盤自然退變，但動物物種數量有限且實驗周期長等因素限制了其應用；誘發退變包括應力、脊柱失穩、手術直接損傷、化學損傷等[3-8]，這些模型均存在不同程度缺點，比如創傷較大、退變進展過快、實驗條件要求較高、可重復性差等，降低了其應用價值。
目前眾多研究表明，椎間盤的退變與軟骨終板損傷、終板下微循環障礙密切相關。研究顯示椎間盤的營養主要來自于椎體終板下毛細血管[13-15]，營養成分通過終板彌散進入椎間盤。椎體終板的彌散功能對這些細胞和基質的生理活動和功能有重要意義[15]。因此，有學者提出通過經皮穿刺兔椎體終板下骨注射平陽霉素影響軟骨終板的血運，建立腰椎間盤缺血性退變模型[9]。平陽霉素血管損傷機制主要是干擾血管內皮細胞的生長代謝，抑制細胞內的DNA合成、造成內皮細胞變性和增生，最終血栓形成，從而引起血管供血部位的缺血。研究報道[9]于兔椎間盤注射平陽霉素后第5 周，病理顯示成功制備椎間盤退變模型。該方法操作簡便、成功率高，具有良好的重復性、可靠性。
力學因素及炎癥因素在人類腰椎間盤退變發展過程起著重要作用，而兔的腰椎生理解剖和生物力學特性與人類存在區別，兔腰椎間盤退變模型與人類椎間盤退變存在差距，仍不能較好滿足臨床前試驗的需求。因此本研究采用腰椎生理解剖和生物力學特點與人類接近的靈長類動物恒河猴制備模型，結果顯示，實驗組術后1周椎間盤MRI T1ρ、T2 map弛豫時間值即開始下降，提示椎間盤開始出現退變；4周椎間盤 T1ρ弛豫時間值即明顯下降，髓核出現紊亂，髓核功能性細胞數減少。本研究顯示其退變速率較兔腰椎間盤退變模型快，分析原因為直立爬行的靈長類動物腰椎間盤負荷較兔大，結合平陽霉素對軟骨終板血運的影響，促使椎間盤出現退變。術后12周顯示纖維出現裂隙，髓核中心功能性細胞數進行性減少，部分髓核被混亂的纖維組織所代替。研究結果提示采用椎體終板下骨注射平陽霉素方法同樣可誘導恒河猴腰椎間盤缺血性退變，其椎間盤退變過程更接近人類椎間盤退變生理，且造模周期較短，模型具有良好的重復性、可靠性。
椎間盤是一種免疫豁免器官，一旦暴露在免疫環境中將迅速退變，不能如其他組織一樣可通過穿刺獲得準確的組織病理學檢測。因此，如何無創監測動物模型椎間盤退變的發展過程、評價其退變程度是我們需解決的一個科學問題。既往多根據MRI掃描T1、T2信號的變化進行評估，存在準確度低、人為誤差較大等缺點。MRI T1ρ自旋鎖定成像和T2-mapping技術分別能探測組織器官中蛋白聚糖和膠原蛋白，并可量化分析其含量[16-19]，而蛋白聚糖和Ⅱ型膠原的變化是腰椎間盤退變的分子標記。提示T1ρ自旋鎖定成像和T2-mapping技術可無創監測腰椎間盤退變的發展過程、評價其退變程度。本研究采用T1ρ自旋鎖定成像和T2-mapping技術測量椎間盤的T1ρ、T2 map弛豫時間值，與既往通過觀察椎間盤T2WI 軸位髓核高信號區面積變化評估方法比較，前者陽性結果出現較早，提示與傳統的T1WI和T2WI信號相比，T1ρ自旋鎖定成像和T2-mapping技術是一種更為可靠、敏感、量化評價椎間盤退變的方法。但既往研究顯示，髓核內膠原纖維含量變化對T2 map馳豫時間值的影響遠遠超過蛋白聚糖的影響[20]。因此，T2 mapping技術多用于膠原纖維的研究。本研究結果顯示實驗組術后4周T1ρ弛豫時間值即較術前明顯下降，但是T2 map弛豫時間值直至術后12周才出現顯著性下降，這也驗證了T1ρ自旋鎖定成像在評價髓核蛋白聚糖變化方面要優于T2-mapping技術。
然而，本研究系實驗模型構建的短期效果報道，缺乏長期的隨訪觀察以及其與人類椎間盤退變的病理學比較，因此，研究結果尚需遠期隨訪觀察進一步證實，并探討其導致椎間盤退變的確切機制。
目前研究認為，椎間盤軟骨終板下骨的微循環障礙是導致椎間盤退變的重要原因之一[1]。因此建立一種可靠的椎體終板下骨缺血性腰椎間盤退變模型，可為研究椎間盤退變病因和治療提供理想研究平臺[2]。既往椎間盤退變動物模型主要是通過破壞椎間盤自身結構/生物力學環境或基因敲除技術獲得[3-8]，與人類椎間盤退變過程存在較大差異。鑒于椎間盤的營養主要來自于椎體終板下毛細血管，有學者提出采用穿刺兔腰椎椎體終板下骨注射去血管化藥物平陽霉素破壞微循環，進而破壞椎體血供誘發椎間盤退變，形成兔椎體終板下缺血模型[9]。然而，兔腰椎間盤退變模型不具有人類腰椎間盤退變特有的力學環境，與人類退變椎間盤生理仍存在差距。靈長類動物椎間盤結構與人類相似，為此本研究擬通過靈長類動物恒河猴椎體終板下骨注射平陽霉素誘導缺血性腰椎間盤退變，并以T1ρ-MRI自旋鎖定成像和T2-mapping技術[10-11]定量檢測動物模型椎間盤細胞外基質變化，結合病理學觀察評價其退變過程，為椎間盤退變相關研究以及臨床前試驗提供更為可靠的動物實驗模型。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要材料
正常清潔級雌性恒河猴12只，年齡4～6歲，平均5.1歲；體重4.4～6.1 kg，平均5.6 kg；由廣東藍島動物實驗中心提供。術前行X線片檢查排除脊柱畸形等異常。動物單籠飼養，室溫控制在25℃左右。平陽霉素粉針（8 mg/支；天津太河制藥有限公司）。17 G × 10 cm骨穿刺針（Angiomed 公司，德國）。
1.2 實驗動物處理
取12只實驗動物，以地西泮（2.5 mg/kg）和氯胺酮（10 mg/kg）肌肉注射麻醉，取仰臥位，行下腹部前外側斜切口腹膜外入路。沿腹外斜肌肌纖維方向分開，并依次按同一方向切斷和分離深層的腹內斜肌和腹橫肌，進入腹膜后隙，充分暴露腰椎椎體及椎間盤。于椎體側方中點并終板下0.5 cm處，平行于椎體終板及椎體冠狀面進針，用直徑1.5 mm的鉆頭鉆孔，深度達椎體橫徑的2/3（根據術前X線片測量）。鉆孔后，用針頭尾端黏有骨蠟的注射器進行注射，實驗組于L5、6椎間盤相鄰的上、下終板各緩慢注射平陽霉素（2 mg/mL）1 mL，對照組于同只動物L4、5椎間盤相鄰的上、下終板各緩慢注射生理鹽水1 mL；注射持續5 min，退出針頭骨蠟封閉鉆孔處。術前及手術結束時分別靜脈滴注頭孢曲松鈉（80 mg/kg），術后單籠自由喂養，通風，接受自然光。
1.3 觀測指標
1.3.1 MRI
檢查及圖像數據處理 術前及術后1、4、12周行MRI檢查，使用Philips 1.5 Tesla MRI儀（Philips公司，荷蘭）掃描，采用8通道腰椎線圈。T1WI和T2WI采用快速自旋回波脈沖序列，T2-mapping技術處理前的T2WI圖像采集采用多回波SE序列，T1ρ-mapping采用快速自旋鎖定脈沖序列，動態增強MRI采用矢狀位T1-脂肪抑制快速自旋回波序列。掃描參數：T1WI：回波時間12 ms，脈沖重復時間540 ms，視野（field of view，FOV）200 mm，層厚2～3 mm；T2WI：回波時間100 ms，脈沖重復時間1 900 ms；T1ρ-MRI掃描采用矢狀位，FOV 28 cm × 28 cm，層厚 3 cm，層間距0.3 cm，自旋鎖定時間設為15、30、45、 60 ms，獲取4組T1ρ-MRI圖像。并根據椎間盤退變Pfirrmann分級標準[12]，對恒河猴L4、5及L5、6椎間盤進行分 級。
將4組TSL不同的T1ρ-MRI圖像輸入T1ρ圖像處理程序（通過國際合作已由丹麥奧胡斯大學協助在本院安裝、測試與使用）自動處理，經T1ρ-mapping產生T1ρ圖，選定感興趣區域（range of interest，ROI），ROI為直徑5 mm圓圈，定位于髓核中央（圖 1），測量并記錄T1ρ弛豫時間值，T1ρ與TSL之間滿足指數方程關系S（TSL）= S0e-TSL/T1ρ[10]（S為自旋量子數、S0是未擴散加權的梯度脈沖的開始信號強度）。利用T2-mapping序列所得的圖像計算T2 map弛豫時間值，比較術前及術后椎間盤T1ρ和T2 map弛豫時間值。
圖1
恒河猴腰椎間盤T1ρ圖像以及髓核ROI選擇
Figure1.
T1ρ maps and the range of interest of the nucleus pulposus of rhesus macaques lumbar intervertebral disk
將術前和術后各時間點經椎間盤中份的T2WI 軸位像輸入骨科計算機影像分析系統（Philips公司，荷蘭），測量整個椎間盤和其內呈高信號區域的面積（顯示器亮度、對比度、色度、清晰度恒定，測量者與本實驗無關），每幅圖像重復測量3 次，取均值，計算椎間盤內高信號區域面積占整個椎間盤面積的百分比。
1.3.2 大體觀察及組織學觀察
術后4、12周完成 MRI檢查后，采用隨機數字法各取6只恒河猴，用相同手術方式取出實驗組和對照組椎間盤及其上、下軟骨終板，大體觀察標本顏色、周圍軟組織反應情況等。標本取與椎體矢狀面呈30°的剖面，40 g/L多聚甲醛固定1周后，Plank-Rycholo液脫鈣5～7 d，石蠟包埋、切片及再固定，系列乙醇脫水，石蠟包埋，5 μm厚組織切片，行HE染色觀察。
1.4 統計學方法
采用SPSS16.0統計軟件進行分析。數據以均數 ± 標準差表示，組內各時間點間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗；兩組間比較采用配對t檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 MRI 檢查及圖像數據處理
根據Pfirrmann 分級標準，實驗組術前及對照組各時間點椎間盤分級均為Ⅰ級；實驗組術后4周Ⅰ級8 例、Ⅱ級4例，術后12周Ⅱ級7例、Ⅲ級5例。對照組手術前后各時間點間椎間盤T1ρ、T2 map弛豫時間值與術前比較差異均無統計學意義（P＞ 0.05）。術后1 周，實驗組T1ρ弛豫時間值即開始下降，但與術前比較差異無統計學意義（P＞ 0.05）；術后4、12周持續下降，與術前及術后1周比較差異有統計學意義（P＜ 0.05）；術后12周與4周比較差異亦有統計學意義（P＜ 0.05）。而實驗組T2 map弛豫時間值在術后1、4周與術前比較差異無統計學意義（P＞ 0.05）；但術后12周明顯下降，與其余時間點比較差異均有統計學意義（P＜ 0.05）。對照組與實驗組間除術后4、12周T1ρ弛豫時間值及術后12周T2 map弛豫時間值比較差異有統計學意義（P＜ 0.05）外，其余時間點兩組間比較差異均無統計學意義（P＞ 0.05）。見表 1、2。
表1
兩組手術前后各時間點腰椎間盤髓核T1ρ弛豫時間值變化（
表2
兩組手術前后各時間點腰椎間盤髓核T2 map弛豫時間值變化（對照組及實驗組手術前后各時間點間椎間盤T2WI 軸位髓核高信號區域面積占整個椎間盤面積的 百分比比較，差異均無統計學意義（P＞ 0.05）；各時間點兩組間比較差異亦無統計學意義（P＞ 0.05）。見表 3。
表3
兩組手術前后各時間點椎間盤T2WI 軸位髓核高信號區面積占整個椎間盤面積百分比（%，2.2 大體觀察及組織學觀察
兩組手術過程順利，術后實驗動物均存活，無截癱及感染等并發癥發生。椎間盤標本均順利取出，顏色正常，椎前軟組織少量肉芽形成，未見明顯水腫及炎性改變。
HE染色示，對照組各時間點椎間盤髓核及纖維環結構均未見明顯紊亂，未見裂隙及塌陷等結構異常。實驗組術后4周纖維環排列尚規則，髓核排列稍紊亂，髓核功能性細胞數目減少；12周內層纖維環出現裂隙，髓核中心功能性細胞數目進行性減少，部分髓核被混亂的纖維組織所代替。見圖 2。
圖2
術后各時間點兩組HE染色觀察 ? 實驗組4周（× 40） 箭頭示髓核細胞排列紊亂 ? 實驗組4周（×100） 箭頭示髓核中心功能性細胞數目減少 ? 實驗組12周（× 40） 箭頭示髓核中心功能性細胞數目進行性減少，部分髓核被混亂的纖維組織所代替 ? 實驗組12周（×100） 箭頭示內層纖維環出現裂隙 ? 對照組4周（× 40） ? 對照組4周（×100） ? 對照組12周（× 40） ? 對照組12周（×100）
Figure2.
HE staining observation of 2 groups at different time points ? Experimental group at 4 weeks (× 40) Arrow indicated arrangement disorder of nucleus pulposus cells ? Experimental group at 4 weeks (×100) Arrow indicated reduced number of functional cells in the nucleus center ? Experimental group at 12 weeks (× 40) Arrow indicated the progressively reduced number of functional cells in the nucleus center,part of the nucleus was replaced by disordered fibrous tissue ? Experimental group at 12 weeks (×100) Arrow indicated the annulus inner fissures ? Control group at 4 weeks (× 40) ? Control group at 4 weeks (×100) ? Control group at 12 weeks (× 40) ? Control group at 12 weeks (×100)
3 討論
椎間盤退變性疾病是臨床常見病和多發病，也是下腰痛的主要原因，但目前其病因和病理生理機制尚未明確。建立一種可靠的椎間盤退變動物模型不僅能夠為研究其退變發病機制提供有利條件，更可為修復治療退變椎間盤的各種研究提供良好的實驗載體[5]。自Lob于1933年首次成功制備椎間盤退變動物模型后，不同方法和不同物種的動物模型相繼建立，所選擇物種和方法的可靠性與可重復性亦存在較大差異。方法學上主要包括自然退變和誘發退變。自然退變動物病變特點相對接近人類椎間盤自然退變，但動物物種數量有限且實驗周期長等因素限制了其應用；誘發退變包括應力、脊柱失穩、手術直接損傷、化學損傷等[3-8]，這些模型均存在不同程度缺點，比如創傷較大、退變進展過快、實驗條件要求較高、可重復性差等，降低了其應用價值。
目前眾多研究表明，椎間盤的退變與軟骨終板損傷、終板下微循環障礙密切相關。研究顯示椎間盤的營養主要來自于椎體終板下毛細血管[13-15]，營養成分通過終板彌散進入椎間盤。椎體終板的彌散功能對這些細胞和基質的生理活動和功能有重要意義[15]。因此，有學者提出通過經皮穿刺兔椎體終板下骨注射平陽霉素影響軟骨終板的血運，建立腰椎間盤缺血性退變模型[9]。平陽霉素血管損傷機制主要是干擾血管內皮細胞的生長代謝，抑制細胞內的DNA合成、造成內皮細胞變性和增生，最終血栓形成，從而引起血管供血部位的缺血。研究報道[9]于兔椎間盤注射平陽霉素后第5 周，病理顯示成功制備椎間盤退變模型。該方法操作簡便、成功率高，具有良好的重復性、可靠性。
力學因素及炎癥因素在人類腰椎間盤退變發展過程起著重要作用，而兔的腰椎生理解剖和生物力學特性與人類存在區別，兔腰椎間盤退變模型與人類椎間盤退變存在差距，仍不能較好滿足臨床前試驗的需求。因此本研究采用腰椎生理解剖和生物力學特點與人類接近的靈長類動物恒河猴制備模型，結果顯示，實驗組術后1周椎間盤MRI T1ρ、T2 map弛豫時間值即開始下降，提示椎間盤開始出現退變；4周椎間盤 T1ρ弛豫時間值即明顯下降，髓核出現紊亂，髓核功能性細胞數減少。本研究顯示其退變速率較兔腰椎間盤退變模型快，分析原因為直立爬行的靈長類動物腰椎間盤負荷較兔大，結合平陽霉素對軟骨終板血運的影響，促使椎間盤出現退變。術后12周顯示纖維出現裂隙，髓核中心功能性細胞數進行性減少，部分髓核被混亂的纖維組織所代替。研究結果提示采用椎體終板下骨注射平陽霉素方法同樣可誘導恒河猴腰椎間盤缺血性退變，其椎間盤退變過程更接近人類椎間盤退變生理，且造模周期較短，模型具有良好的重復性、可靠性。
椎間盤是一種免疫豁免器官，一旦暴露在免疫環境中將迅速退變，不能如其他組織一樣可通過穿刺獲得準確的組織病理學檢測。因此，如何無創監測動物模型椎間盤退變的發展過程、評價其退變程度是我們需解決的一個科學問題。既往多根據MRI掃描T1、T2信號的變化進行評估，存在準確度低、人為誤差較大等缺點。MRI T1ρ自旋鎖定成像和T2-mapping技術分別能探測組織器官中蛋白聚糖和膠原蛋白，并可量化分析其含量[16-19]，而蛋白聚糖和Ⅱ型膠原的變化是腰椎間盤退變的分子標記。提示T1ρ自旋鎖定成像和T2-mapping技術可無創監測腰椎間盤退變的發展過程、評價其退變程度。本研究采用T1ρ自旋鎖定成像和T2-mapping技術測量椎間盤的T1ρ、T2 map弛豫時間值，與既往通過觀察椎間盤T2WI 軸位髓核高信號區面積變化評估方法比較，前者陽性結果出現較早，提示與傳統的T1WI和T2WI信號相比，T1ρ自旋鎖定成像和T2-mapping技術是一種更為可靠、敏感、量化評價椎間盤退變的方法。但既往研究顯示，髓核內膠原纖維含量變化對T2 map馳豫時間值的影響遠遠超過蛋白聚糖的影響[20]。因此，T2 mapping技術多用于膠原纖維的研究。本研究結果顯示實驗組術后4周T1ρ弛豫時間值即較術前明顯下降，但是T2 map弛豫時間值直至術后12周才出現顯著性下降，這也驗證了T1ρ自旋鎖定成像在評價髓核蛋白聚糖變化方面要優于T2-mapping技術。
然而，本研究系實驗模型構建的短期效果報道，缺乏長期的隨訪觀察以及其與人類椎間盤退變的病理學比較，因此，研究結果尚需遠期隨訪觀察進一步證實，并探討其導致椎間盤退變的確切機制。
