引用本文： 吳江, 肖海軍, 薛鋒, 石偉哲, 趙航. 選擇性與非選擇性環氧化酶2抑制劑預防大鼠跟腱異位骨化的實驗研究. 中國修復重建外科雜志, 2014, 28(3): 371-376. doi: 10.7507/1002-1892.20140083 復制
異位骨化是軟組織內異常的成熟板層骨形成，可導致受累關節功能喪失。根據成因分為遺傳相關性及獲得性異位骨化，后者臨床最常見。研究表明，非甾體類藥物可通過抑制環氧化酶（cyclooxygenase，COX），阻止前列腺素（prostaglandin，PG）的合成，抑制MSCs向成骨細胞分化，達到預防異位骨化的目的，并已廣泛應用于臨床[1-2]。但如何選擇非甾體類藥物，以達到更好的防治效果，是目前需解決的難題。臨床上常用于預防異位骨化的非甾體類藥物有兩類：非選擇性COX2抑制劑（吲哚美辛）和選擇性COX2抑制劑（塞來昔布）。哪種藥物預防異位骨化效果更佳，以及不同劑量效果是否存在差異，目前相關研究較少。為此，本實驗通過切斷大鼠跟腱誘導局部異位骨化，采用不同劑量的兩種COX2抑制劑進行干預，比較其預防效果的差異，為臨床選擇預防異位骨化藥物提供參考。報告如下。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
6～8周齡雄性SD大鼠50只，體重（190.0 ± 8.5） g，由西普爾-必凱實驗動物有限公司提供；SPF級環境飼養（華東師范大學生命醫學研究所實驗動物中心）。
塞來昔布（輝瑞公司，美國）；吲哚美辛（山西太原藥業有限公司）；兔抗大鼠多克隆COX2及BMP-2抗體（Abcam公司，英國）。X線機（Kodak公司，美國）；光鏡（Olympus公司，日本）。
1.2 實驗方法及分組
50只大鼠適應性飼養1周后，經腹腔注射10%水合氯醛（0.2～0.3 mL/100 g）麻醉。無菌條件下，于右后肢后外側入路暴露跟腱，采用血管鉗于跟腱中點處鉗夾1次，中點上、下部位各鉗夾2次，造成一定程度創傷。然后在中點處將跟腱完全切斷，不作縫合，關閉切口。
大鼠跟腱斷裂模型制備后，根據干預方法不同隨機分為A、B、C、D、E組，每組10只。術后第1天開始，A、B組每天分別給予塞來昔布2、10 mg/（kg·d），C、D組分別給予吲哚美辛2、10 mg/（kg·d），E組給予2 mL生理鹽水，共10周。給藥方式：A、B、C、D組將塞來昔布或吲哚美辛膠囊粉末分別溶于生理鹽水，配置為2 mL溶液，強制灌胃。
1.3 觀測指標
1.3.1 一般情況
術后觀察大鼠成活情況，以及切口愈合、后肢活動情況。
1.3.2 X線片觀察
術后5、10周取各組大鼠，攝右后肢側位X線片，觀察跟腱部位有無新骨形成。
1.3.3 大體觀察
術后10周攝X線片后，采用斷頸法處死各組大鼠。以原切口入路，切取右側術區跟腱組織，大體觀察跟腱形態。
1.3.4 組織學觀察
術后10周，將各組跟腱組織置于10%中性甲醛固定24 h，15%EDTA脫鈣1周，乙醇梯度脫水，透明石蠟包埋，制成5 μm厚切片。取部分切片常規行HE、Masson染色，光鏡觀察。結合X線片和組織學觀察結果，判定各組異位骨化發生率。如X線片示跟腱部位有新骨形成，組織學觀察示骨組織存在，確定為發生異位骨化[3-5]。
1.3.5 免疫組織化學染色觀察
取部分切片脫蠟至水，抗原修復，PBS洗滌；置于3%H2O2 37℃孵育30 min，PBS洗滌；10%山羊血清室溫孵育1 h；滴加一抗兔抗大鼠多克隆COX2或BMP-2抗體（1∶300）150 μL，用PBS代替一抗作為陰性對照，4℃孵育過夜，PBS洗滌；滴加二抗山羊抗兔抗體（1∶200）150 μL，室溫孵育1 h，PBS洗滌；DAB顯色5～10 min，PBS洗滌；蘇木精復染1 min，自來水沖洗15 min；脫水、封片、光鏡下觀察，細胞質呈淡黃色至棕褐色者為陽性細胞。
每張切片隨機選取5個高倍視野（× 400），以染色強度結合陽性細胞百分比綜合評分[6-7]。染色強度評分：無著色0分，淡黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分；陽性細胞百分比評分：0～5% 0分，6%～25% 1分，26%～50% 2分，51%～75% 3分，＞ 75% 4分。兩項評分的乘積表示COX2或BMP-2表達量。
1.4 統計學方法
采用SPSS13.0統計軟件進行分析。計量資料以均數±標準差表示，組間比較采用方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗；計數資料組間比較采用χ2檢驗及確切概率法；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 一般情況
實驗期間共5只大鼠死亡，其中B組2只、C組1 只、D組2只，死亡原因考慮為麻醉并發癥和非甾體類藥物不良反應，未作補充。其余大鼠均存活至實驗完成，切口愈合良好；術后大鼠右后肢活動減少，2周后均恢復正常。
2.2 X線片觀察
術后5周，各組均有大鼠出現骨化影，提示新骨形成，其中A組8只、B組2只、C組8只、D組4例、E組8只（圖 1 a）；10周時，A組7只、B組2只、C組8 只、D組4例、E組9只出現骨化影，骨化均較5周時成熟（圖 1 b）。5、10周時，E組骨化區域均最大，亮度最高；B組骨化區域最小，亮度顯著低于其他各組；A、C、D組骨化區域及亮度相似，均介于B、E組間。
圖1
術后5、10周各組X線片觀察（從左至右依次為A、B、C、D、E組） ? 術后5周 ? 術后10周
Figure1.
X-ray films of each group at 5 and 10 weeks after operation (the order from left to right was groups A,B,C,D,and E) ? At 5 weeks after operation ? At 10 weeks after operation
2.3 大體觀察
術后10周，E組跟腱組織體積最大，質地較其他各組硬，可見軟骨樣組織；B組跟腱組織體積顯著小于其他各組，質地軟，未見軟骨樣組織；A、C、D組情況類似，跟腱組織體積及質地均介于B、E組間，部分組織中可見軟骨樣組織形成。見圖 2。
圖2
術后10周各組跟腱組織大體觀察 ? A組 ? B組 ? C組 ? D組 ? E組 ? ?2.4 組織學觀察
X線片檢查見軟骨樣形成的跟腱組織中，HE染色可見軟骨細胞，Masson染色可見軟骨細胞周圍Ⅰ型膠原增生；X線片檢查未發現軟骨樣形成的跟腱組織中，除A、E組各1只HE染色可見軟骨細胞外，余均僅表現為肉芽組織增生；Masson染色見Ⅰ型膠原較少。見 圖 3、4。
結合X線片及組織學觀察結果，術后10周A組異位骨化發生率為80.0%（8/10），B組為25.0%（2/8），C組為88.9%（8/9），D組為50.0%（4/8），E組為100%（10/10）。B、D組與E組比較（P=0.002，P=0.023）、B組與C組比較（P=0.015），差異均有統計學意義；其余各組間比較，差異均無統計學意義（P＞ 0.05）。
2.5 免疫組織化學染色觀察
COX2表達：A組2只染色呈陰性，其余跟腱組織染色呈淡黃色或棕黃色，陽性細胞數較少；B組2只染色呈陰性，其余跟腱組織染色呈淡黃色，陽性細胞數最少；C組跟腱組織染色均呈淡黃色或棕黃色，陽性細胞數較少；D組2只染色呈陰性，其余跟腱組織染色呈淡黃色或棕黃色，陽性細胞數較少； E組跟腱組織染色呈棕黃色或棕褐色，陽性細胞數最多。見? ?
圖5
術后10周各組跟腱組織COX2免疫組織化學染色觀察（× 400） 箭頭示陽性細胞 ? A組 ? B組 ? C組 ? D組 ? E組 ? ?BMP-2表達：A組跟腱組織染色均呈淡黃色，陽性細胞數較少；B組5只染色呈陰性，其余跟腱組織染色呈淡黃色，陽性細胞數最少； C組跟腱組織染色均呈淡黃色或棕黃色，陽性細胞數較少；D組2只染色呈陰性，其余跟腱組織染色呈淡黃色，陽性細胞數較少； E組跟腱組織染色均呈棕黃色，陽性細胞數最多。見圖 6。
A、B、C、D、E組COX2表達量分別為2.70 ± 1.95、0.86 ± 0.99、2.67 ± 1.50、1.88 ± 1.73、4.40 ± 1.17；組間比較差異有統計學意義（F=6.564，P=0.000）。其中B、D組與E組比較，差異有統計學意義（P＜ 0.05），其余各組間比較差異均無統計學意義（P＞ 0.05）。A、B、C、D、E組BMP-2表達量分別為2.20 ± 1.03、0.63 ± 0.92、2.33 ± 1.12、1.38 ± 1.06、2.90 ± 1.10；組間比較差異有統計學意義（F=6.251，P=0.001）。其中B組與A、C、E組比較，差異有統計學意義（P＜ 0.05），其余各組間比較差異均無統計學意義（P＞ 0.05）。
3 討論
3.1 大鼠跟腱異位骨化模型
文獻報道[3-4, 8]采用大鼠跟腱切斷法，能在相對較短時間內成功誘導異位成骨，在形態和影像學上與臨床創傷、手術導致的異位骨化病理狀態相似，重復性好。其可能的成骨機制為：切斷大鼠跟腱后，組織修復過程中巨噬細胞聚集，釋放炎性介質，刺激MSCs向軟骨細胞或成骨細胞分化。這種異位骨化首先是軟骨細胞增殖和肥大，然后出現基質鈣化、血管長入，同時破骨細胞和成骨細胞改建，最后通過軟骨化骨的方式形成[4]。該方法誘導異位骨形成需5～10周。Lin等[8]建立大鼠跟腱切斷異位骨化模型，術后3、5、10周行X線片評估，發現3周時無異位骨形成，5周時60%大鼠出現了異位骨，10周時所有大鼠均發生異位骨化。Xu等[5]采用相同造模方法也得出相似結果。本實驗參照以上研究，采用大鼠跟腱切斷法誘導跟腱局部異位骨化，選擇5、10周兩個時間點評估異位骨形成情況。
3.2 非甾體類藥物作用機制
研究表明，COX1主要參與生理情況下的PG調節，維持內環境穩定及胃腸黏膜完整、保持腎臟功能、調節血小板活化及促進巨噬細胞分化等。COX2主要參與病理情況下的PG調節，具有可持續轉錄和穩定表達的特征，在外界刺激下COX2表達上調可促進PG合成[9-10]。非甾體類藥物可通過抑制COX2，阻止PG合成，抑制MSCs的游走與分化、增殖，阻斷其向成骨細胞分化，從而達到預防異位骨化發生的作用[11]。非選擇性COX2抑制劑（吲哚美辛）同時抑制COX1和COX2，選擇性COX2抑制劑（塞來昔布）只抑制COX2。毛玉江等[12]采用家兔動物實驗和Zhang等[5]采用大鼠動物實驗，分別發現吲哚美辛和塞來昔布在10 mg/ （kg·d）的劑量時對異位骨化能產生抑制作用；而Murat等[13]發現吲哚美辛2 mg/（kg·d）劑量組對大鼠異位骨化預防效果不佳；Rapuano等[14]設計了塞來昔布1 mg/ （kg·d）和10 mg/（kg·d）兩個劑量組預防大鼠異位骨化，發現兩個劑量組均能一定程度上減輕異位骨化的發生。本實驗參考以上實驗劑量，對吲哚美辛和塞來昔布各設置2 mg/（kg·d）和10 mg/（kg·d）兩種不同劑量進行比較研究。
COX2的表達水平以及其引起的PG分泌，會影響軟骨細胞形成和軟骨內化骨，從而促進成骨細胞的活性和骨形成[15]。BMP-2則是一種成骨調節因子，具有促進成骨細胞分化的功能，參與異位骨化的發生，其表達水平與骨形成活躍程度相關[16]。為進一步研究兩種非甾體類藥物對成骨因子COX2和BMP-2表達的影響，本研究術后10周取跟腱組織行免疫組織化學染色觀察，評價COX2和BMP-2表達量。結果發現兩種成骨因子的染色強度B組最低，陽性細胞數最少；而未進行干預治療的E組染色強度最高，陽性細胞數也最多；其他3組則介于B、E組之間。進一步量化評分發現B組COX2和BMP-2表達量最低，僅為0.86 ± 0.99和0.63 ± 0.92，且與E組比較差異有統計學意義。說明B組方法對成骨因子的抑制作用最強，對異位骨化的預防效果最好；A、C、D組僅對成骨活動有一定減輕作用，對異位骨化的預防效果欠佳。
3.3 非選擇性與選擇性COX2抑制劑的治療比較
目前，臨床上多采用吲哚美辛預防異位骨化，大量研究提示其能有效預防人工全髖關節置換術后異位骨化 [1-2, 17]。但Günal等[18]的臨床研究結果與之相反。Knelles等[19]經文獻回顧分析后也發現，人工全髖關節置換術后應用吲哚美辛，仍有2/3患者發生異位骨化。本實驗結果提示，吲哚美辛干預后，雖然D組異位骨化發生率較E組顯著降低，起到了一定抑制作用，但C、D組異位骨化發生率仍較高。免疫組織化學染色結果示，D組COX2表達量顯著低于E組，而C、D組BMP-2表達量均未見顯著降低。提示當吲哚美辛劑量提高至10 mg/（kg·d）時能顯著抑制COX2在大鼠跟腱局部異位骨組織的表達，卻不能抑制BMP-2表達，成骨活動仍繼續發展，最終導致異位骨化形成。
近年來隨著選擇性COX2抑制劑的廣泛應用，塞來昔布開始用于預防異位骨化，動物實驗和臨床研究均報道其能有效預防異位骨化的發生[5, 20]。本實驗結果顯示，塞來昔布10 mg/（kg·d）干預后大鼠異位骨化顯著受抑制，術后10周發生率僅為25.0%。免疫組織化學染色結果示，與E組比較，B組COX2及BMP-2表達量均顯著降低，此外B組BMP-2表達量也顯著低于A、C組。提示塞來昔布10 mg/（kg·d）對于COX2表達具有抑制作用，同時能顯著降低大鼠跟腱局部BMP-2表達量，阻止成骨活動的進一步發展，對于異位骨化的抑制作用更佳。此外，塞來昔布對機體正常生理影響小，胃腸道副作用小，可能更適用于臨床預防異位骨化，但確切療效尚需進一步研究明確。
異位骨化是軟組織內異常的成熟板層骨形成，可導致受累關節功能喪失。根據成因分為遺傳相關性及獲得性異位骨化，后者臨床最常見。研究表明，非甾體類藥物可通過抑制環氧化酶（cyclooxygenase，COX），阻止前列腺素（prostaglandin，PG）的合成，抑制MSCs向成骨細胞分化，達到預防異位骨化的目的，并已廣泛應用于臨床[1-2]。但如何選擇非甾體類藥物，以達到更好的防治效果，是目前需解決的難題。臨床上常用于預防異位骨化的非甾體類藥物有兩類：非選擇性COX2抑制劑（吲哚美辛）和選擇性COX2抑制劑（塞來昔布）。哪種藥物預防異位骨化效果更佳，以及不同劑量效果是否存在差異，目前相關研究較少。為此，本實驗通過切斷大鼠跟腱誘導局部異位骨化，采用不同劑量的兩種COX2抑制劑進行干預，比較其預防效果的差異，為臨床選擇預防異位骨化藥物提供參考。報告如下。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
6～8周齡雄性SD大鼠50只，體重（190.0 ± 8.5） g，由西普爾-必凱實驗動物有限公司提供；SPF級環境飼養（華東師范大學生命醫學研究所實驗動物中心）。
塞來昔布（輝瑞公司，美國）；吲哚美辛（山西太原藥業有限公司）；兔抗大鼠多克隆COX2及BMP-2抗體（Abcam公司，英國）。X線機（Kodak公司，美國）；光鏡（Olympus公司，日本）。
1.2 實驗方法及分組
50只大鼠適應性飼養1周后，經腹腔注射10%水合氯醛（0.2～0.3 mL/100 g）麻醉。無菌條件下，于右后肢后外側入路暴露跟腱，采用血管鉗于跟腱中點處鉗夾1次，中點上、下部位各鉗夾2次，造成一定程度創傷。然后在中點處將跟腱完全切斷，不作縫合，關閉切口。
大鼠跟腱斷裂模型制備后，根據干預方法不同隨機分為A、B、C、D、E組，每組10只。術后第1天開始，A、B組每天分別給予塞來昔布2、10 mg/（kg·d），C、D組分別給予吲哚美辛2、10 mg/（kg·d），E組給予2 mL生理鹽水，共10周。給藥方式：A、B、C、D組將塞來昔布或吲哚美辛膠囊粉末分別溶于生理鹽水，配置為2 mL溶液，強制灌胃。
1.3 觀測指標
1.3.1 一般情況
術后觀察大鼠成活情況，以及切口愈合、后肢活動情況。
1.3.2 X線片觀察
術后5、10周取各組大鼠，攝右后肢側位X線片，觀察跟腱部位有無新骨形成。
1.3.3 大體觀察
術后10周攝X線片后，采用斷頸法處死各組大鼠。以原切口入路，切取右側術區跟腱組織，大體觀察跟腱形態。
1.3.4 組織學觀察
術后10周，將各組跟腱組織置于10%中性甲醛固定24 h，15%EDTA脫鈣1周，乙醇梯度脫水，透明石蠟包埋，制成5 μm厚切片。取部分切片常規行HE、Masson染色，光鏡觀察。結合X線片和組織學觀察結果，判定各組異位骨化發生率。如X線片示跟腱部位有新骨形成，組織學觀察示骨組織存在，確定為發生異位骨化[3-5]。
1.3.5 免疫組織化學染色觀察
取部分切片脫蠟至水，抗原修復，PBS洗滌；置于3%H2O2 37℃孵育30 min，PBS洗滌；10%山羊血清室溫孵育1 h；滴加一抗兔抗大鼠多克隆COX2或BMP-2抗體（1∶300）150 μL，用PBS代替一抗作為陰性對照，4℃孵育過夜，PBS洗滌；滴加二抗山羊抗兔抗體（1∶200）150 μL，室溫孵育1 h，PBS洗滌；DAB顯色5～10 min，PBS洗滌；蘇木精復染1 min，自來水沖洗15 min；脫水、封片、光鏡下觀察，細胞質呈淡黃色至棕褐色者為陽性細胞。
每張切片隨機選取5個高倍視野（× 400），以染色強度結合陽性細胞百分比綜合評分[6-7]。染色強度評分：無著色0分，淡黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分；陽性細胞百分比評分：0～5% 0分，6%～25% 1分，26%～50% 2分，51%～75% 3分，＞ 75% 4分。兩項評分的乘積表示COX2或BMP-2表達量。
1.4 統計學方法
采用SPSS13.0統計軟件進行分析。計量資料以均數±標準差表示，組間比較采用方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗；計數資料組間比較采用χ2檢驗及確切概率法；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 一般情況
實驗期間共5只大鼠死亡，其中B組2只、C組1 只、D組2只，死亡原因考慮為麻醉并發癥和非甾體類藥物不良反應，未作補充。其余大鼠均存活至實驗完成，切口愈合良好；術后大鼠右后肢活動減少，2周后均恢復正常。
2.2 X線片觀察
術后5周，各組均有大鼠出現骨化影，提示新骨形成，其中A組8只、B組2只、C組8只、D組4例、E組8只（圖 1 a）；10周時，A組7只、B組2只、C組8 只、D組4例、E組9只出現骨化影，骨化均較5周時成熟（圖 1 b）。5、10周時，E組骨化區域均最大，亮度最高；B組骨化區域最小，亮度顯著低于其他各組；A、C、D組骨化區域及亮度相似，均介于B、E組間。
圖1
術后5、10周各組X線片觀察（從左至右依次為A、B、C、D、E組） ? 術后5周 ? 術后10周
Figure1.
X-ray films of each group at 5 and 10 weeks after operation (the order from left to right was groups A,B,C,D,and E) ? At 5 weeks after operation ? At 10 weeks after operation
2.3 大體觀察
術后10周，E組跟腱組織體積最大，質地較其他各組硬，可見軟骨樣組織；B組跟腱組織體積顯著小于其他各組，質地軟，未見軟骨樣組織；A、C、D組情況類似，跟腱組織體積及質地均介于B、E組間，部分組織中可見軟骨樣組織形成。見圖 2。
圖2
術后10周各組跟腱組織大體觀察 ? A組 ? B組 ? C組 ? D組 ? E組 ? ?2.4 組織學觀察
X線片檢查見軟骨樣形成的跟腱組織中，HE染色可見軟骨細胞，Masson染色可見軟骨細胞周圍Ⅰ型膠原增生；X線片檢查未發現軟骨樣形成的跟腱組織中，除A、E組各1只HE染色可見軟骨細胞外，余均僅表現為肉芽組織增生；Masson染色見Ⅰ型膠原較少。見 圖 3、4。
結合X線片及組織學觀察結果，術后10周A組異位骨化發生率為80.0%（8/10），B組為25.0%（2/8），C組為88.9%（8/9），D組為50.0%（4/8），E組為100%（10/10）。B、D組與E組比較（P=0.002，P=0.023）、B組與C組比較（P=0.015），差異均有統計學意義；其余各組間比較，差異均無統計學意義（P＞ 0.05）。
2.5 免疫組織化學染色觀察
COX2表達：A組2只染色呈陰性，其余跟腱組織染色呈淡黃色或棕黃色，陽性細胞數較少；B組2只染色呈陰性，其余跟腱組織染色呈淡黃色，陽性細胞數最少；C組跟腱組織染色均呈淡黃色或棕黃色，陽性細胞數較少；D組2只染色呈陰性，其余跟腱組織染色呈淡黃色或棕黃色，陽性細胞數較少； E組跟腱組織染色呈棕黃色或棕褐色，陽性細胞數最多。見? ?
圖5
術后10周各組跟腱組織COX2免疫組織化學染色觀察（× 400） 箭頭示陽性細胞 ? A組 ? B組 ? C組 ? D組 ? E組 ? ?BMP-2表達：A組跟腱組織染色均呈淡黃色，陽性細胞數較少；B組5只染色呈陰性，其余跟腱組織染色呈淡黃色，陽性細胞數最少； C組跟腱組織染色均呈淡黃色或棕黃色，陽性細胞數較少；D組2只染色呈陰性，其余跟腱組織染色呈淡黃色，陽性細胞數較少； E組跟腱組織染色均呈棕黃色，陽性細胞數最多。見圖 6。
A、B、C、D、E組COX2表達量分別為2.70 ± 1.95、0.86 ± 0.99、2.67 ± 1.50、1.88 ± 1.73、4.40 ± 1.17；組間比較差異有統計學意義（F=6.564，P=0.000）。其中B、D組與E組比較，差異有統計學意義（P＜ 0.05），其余各組間比較差異均無統計學意義（P＞ 0.05）。A、B、C、D、E組BMP-2表達量分別為2.20 ± 1.03、0.63 ± 0.92、2.33 ± 1.12、1.38 ± 1.06、2.90 ± 1.10；組間比較差異有統計學意義（F=6.251，P=0.001）。其中B組與A、C、E組比較，差異有統計學意義（P＜ 0.05），其余各組間比較差異均無統計學意義（P＞ 0.05）。
3 討論
3.1 大鼠跟腱異位骨化模型
文獻報道[3-4, 8]采用大鼠跟腱切斷法，能在相對較短時間內成功誘導異位成骨，在形態和影像學上與臨床創傷、手術導致的異位骨化病理狀態相似，重復性好。其可能的成骨機制為：切斷大鼠跟腱后，組織修復過程中巨噬細胞聚集，釋放炎性介質，刺激MSCs向軟骨細胞或成骨細胞分化。這種異位骨化首先是軟骨細胞增殖和肥大，然后出現基質鈣化、血管長入，同時破骨細胞和成骨細胞改建，最后通過軟骨化骨的方式形成[4]。該方法誘導異位骨形成需5～10周。Lin等[8]建立大鼠跟腱切斷異位骨化模型，術后3、5、10周行X線片評估，發現3周時無異位骨形成，5周時60%大鼠出現了異位骨，10周時所有大鼠均發生異位骨化。Xu等[5]采用相同造模方法也得出相似結果。本實驗參照以上研究，采用大鼠跟腱切斷法誘導跟腱局部異位骨化，選擇5、10周兩個時間點評估異位骨形成情況。
3.2 非甾體類藥物作用機制
研究表明，COX1主要參與生理情況下的PG調節，維持內環境穩定及胃腸黏膜完整、保持腎臟功能、調節血小板活化及促進巨噬細胞分化等。COX2主要參與病理情況下的PG調節，具有可持續轉錄和穩定表達的特征，在外界刺激下COX2表達上調可促進PG合成[9-10]。非甾體類藥物可通過抑制COX2，阻止PG合成，抑制MSCs的游走與分化、增殖，阻斷其向成骨細胞分化，從而達到預防異位骨化發生的作用[11]。非選擇性COX2抑制劑（吲哚美辛）同時抑制COX1和COX2，選擇性COX2抑制劑（塞來昔布）只抑制COX2。毛玉江等[12]采用家兔動物實驗和Zhang等[5]采用大鼠動物實驗，分別發現吲哚美辛和塞來昔布在10 mg/ （kg·d）的劑量時對異位骨化能產生抑制作用；而Murat等[13]發現吲哚美辛2 mg/（kg·d）劑量組對大鼠異位骨化預防效果不佳；Rapuano等[14]設計了塞來昔布1 mg/ （kg·d）和10 mg/（kg·d）兩個劑量組預防大鼠異位骨化，發現兩個劑量組均能一定程度上減輕異位骨化的發生。本實驗參考以上實驗劑量，對吲哚美辛和塞來昔布各設置2 mg/（kg·d）和10 mg/（kg·d）兩種不同劑量進行比較研究。
COX2的表達水平以及其引起的PG分泌，會影響軟骨細胞形成和軟骨內化骨，從而促進成骨細胞的活性和骨形成[15]。BMP-2則是一種成骨調節因子，具有促進成骨細胞分化的功能，參與異位骨化的發生，其表達水平與骨形成活躍程度相關[16]。為進一步研究兩種非甾體類藥物對成骨因子COX2和BMP-2表達的影響，本研究術后10周取跟腱組織行免疫組織化學染色觀察，評價COX2和BMP-2表達量。結果發現兩種成骨因子的染色強度B組最低，陽性細胞數最少；而未進行干預治療的E組染色強度最高，陽性細胞數也最多；其他3組則介于B、E組之間。進一步量化評分發現B組COX2和BMP-2表達量最低，僅為0.86 ± 0.99和0.63 ± 0.92，且與E組比較差異有統計學意義。說明B組方法對成骨因子的抑制作用最強，對異位骨化的預防效果最好；A、C、D組僅對成骨活動有一定減輕作用，對異位骨化的預防效果欠佳。
3.3 非選擇性與選擇性COX2抑制劑的治療比較
目前，臨床上多采用吲哚美辛預防異位骨化，大量研究提示其能有效預防人工全髖關節置換術后異位骨化 [1-2, 17]。但Günal等[18]的臨床研究結果與之相反。Knelles等[19]經文獻回顧分析后也發現，人工全髖關節置換術后應用吲哚美辛，仍有2/3患者發生異位骨化。本實驗結果提示，吲哚美辛干預后，雖然D組異位骨化發生率較E組顯著降低，起到了一定抑制作用，但C、D組異位骨化發生率仍較高。免疫組織化學染色結果示，D組COX2表達量顯著低于E組，而C、D組BMP-2表達量均未見顯著降低。提示當吲哚美辛劑量提高至10 mg/（kg·d）時能顯著抑制COX2在大鼠跟腱局部異位骨組織的表達，卻不能抑制BMP-2表達，成骨活動仍繼續發展，最終導致異位骨化形成。
近年來隨著選擇性COX2抑制劑的廣泛應用，塞來昔布開始用于預防異位骨化，動物實驗和臨床研究均報道其能有效預防異位骨化的發生[5, 20]。本實驗結果顯示，塞來昔布10 mg/（kg·d）干預后大鼠異位骨化顯著受抑制，術后10周發生率僅為25.0%。免疫組織化學染色結果示，與E組比較，B組COX2及BMP-2表達量均顯著降低，此外B組BMP-2表達量也顯著低于A、C組。提示塞來昔布10 mg/（kg·d）對于COX2表達具有抑制作用，同時能顯著降低大鼠跟腱局部BMP-2表達量，阻止成骨活動的進一步發展，對于異位骨化的抑制作用更佳。此外，塞來昔布對機體正常生理影響小，胃腸道副作用小，可能更適用于臨床預防異位骨化，但確切療效尚需進一步研究明確。
