引用本文： 范雪嬌, 田春祥, 傅月荷, 李秀群, 鄧力, 呂青. 脂肪脫細胞基質的制備和初步評價. 中國修復重建外科雜志, 2014, 28(3): 377-383. doi: 10.7507/1002-1892.20140084 復制
目前，臨床常用的脂肪組織缺損修復方法包括自體或同種異體移植物填充，存在來源有限和免疫排斥反應等缺點。組織工程方法為脂肪組織缺損修復重建提供了新思路。目前，以脂肪組織為載體的組織工程研究主要集中在種子細胞篩選、支架材料制備、生物活性因子誘導刺激、組織工程化脂肪構建及體內移植等方面。自2001年Zuk等從脂肪組織中成功分離獲得脂肪干細胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）以來，經過不斷的探索，ADSCs已基本確定為具有多向分化潛能的MSCs，是包括脂肪組織工程在內的多種組織再生的重要細胞來源[1-5]。
目前，制約脂肪組織工程發展的關鍵問題之一在于選取理想的生物支架材料。其中，低免疫原性的脫細胞生物材料因具有天然特定的三維結構、富含相關活性因子等特性而備受關注。研究表明，經不同脫細胞方法獲得的脂肪脫細胞基質均能基本保持組織特異性，具有誘導ADSCs成脂分化的作用[6-10]。為進一步探索更高效的人脂肪脫細胞基質制備方法，并了解其結構和功能，本實驗聯合反復凍融、有機溶劑抽提和酶消化法制備脂肪脫細胞基質，初步觀察其組成成分和細胞相容性，為脂肪組織工程尋找合適的支架材料奠定基礎。
1 材料與方法
1.1 實驗材料
腹壁皮下脂肪組織由四川大學華西醫院接受乳腺癌根治術或乳腺癌改良根治術患者自愿捐贈。切取后將一部分置于含20 mg/mL牛血清白蛋白的無鈣、鎂PBS緩沖液中，冰浴2 h內進行人ADSCs（human ADSCs，hADSCs）分離培養；另一部分置于4℃PBS緩沖液中保存，用于制備脂肪脫細胞基質。
1.2 主要試劑與儀器
胰蛋白酶、異丙醇（成都科龍化工公司）；三羥甲基氨基甲烷、苯甲基磺酰氟、EDTA、Ⅰ型脫氧核糖核酸酶（deoxyribonucleaseⅠ，DNase-Ⅰ）、核糖核酸酶A（ribonuclease A，RNase A）（Sigma 公司，美國）；DMEM/F12培養基、FBS（HyClone公司，美國）；牛血清白蛋白（Roche 公司，瑞士）；鈣黃綠素及碘化丙啶熒光染料、DAPI熒光染料、兔抗大鼠Ⅳ型膠原、層粘連蛋白及纖連蛋白多克隆抗體、生物素標記的山羊抗兔IgG（北京中杉金橋生物技術有限公司）。
倒置相差熒光顯微鏡（Leica公司，德國）；細胞培養孵箱、-40℃冰箱（SANYO公司，日本）；DW3 真空凍干機（Heto公司，德國）；掃描電鏡、偏振光顯微鏡（Olympus公司，日本）；激光共聚焦顯微鏡（Nikon公司，日本）。
1.3 脂肪脫細胞基質制備及相關檢測
取脂肪組織切成0.3～0.5 cm厚組織塊，無菌PBS緩沖液充分沖洗去除血液雜質，置于低滲三羥甲基氨基甲烷緩沖液（含10 mmol/L三羥甲基氨基甲烷、5 mmol/L EDTA）中，-80℃冷凍、37℃水浴復溫，反復凍融5次； 0.25%胰蛋白酶-0.1%EDTA 處理6 h，無菌PBS緩沖液沖洗30 min × 3次；異丙醇處理36 h，無菌PBS緩沖液沖洗30 min × 3次；0.25%胰蛋白酶-0.1%EDTA處理6 h，無菌PBS緩沖液沖洗30 min × 3次；5 ×107 U/ L DNase-Ⅰ及1 ×106 U/L RNase A處理16 h，無菌PBS緩沖液沖洗30 min × 3次；異丙醇處理8 h，無菌PBS緩沖液沖洗30 min × 3次。所有溶液均添加雙抗（100 U/mL青霉素、0.1 mg/ mL鏈霉素），處理過程均在持續均勻攪拌下進行，-40℃過夜后置于真空凍干機24 h凍干，環氧乙烷低溫消毒后密封備用。
1.3.1 大體觀察
大體觀察脂肪脫細胞基質形狀、顏色及凍干后性狀，直尺測量其厚度。
1.3.2 組織學觀察
取脫細胞處理前后脂肪組織，一部分經4%多聚甲醛固定24 h，梯度乙醇脫水，石蠟包埋，5 μm厚連續切片，行HE 染色及Masson染色，光鏡觀察細胞結構；行天狼猩紅染色，偏振光顯微鏡觀察膠原蛋白結構。另一部分行冰凍切片后油紅O染色，光鏡觀察脂滴形成。
1.3.3 免疫組織化學染色觀察
取1.3.2制備的石蠟切片行免疫組織化學染色，一抗為兔抗大鼠Ⅳ型膠原、纖連蛋白及層粘連蛋白多克隆抗體（工作濃度1 ∶ 200），二抗為生物素標記的山羊抗兔IgG，DAB顯色，光鏡下觀察，以棕黃色染色為陽性表達。
1.3.4 DNA殘留觀察
取1.3.2制備的石蠟切片行DAPI熒光染色，倒置相差熒光顯微鏡觀察細胞核殘留情況。
1.3.5 掃描電鏡觀察
取脂肪脫細胞基質，以2.5%戊二醛固定、乙醇梯度脫水、乙酸異戊酯浸泡后，掃描電鏡觀察微結構。
1.4 hADSCs分離培養
采用酶消化法[5]分離培養hADSCs。取脂肪組織去除結締組織和血管后，剪成約1 mm × 1 mm × 1 mm 小塊。置于含1 mg/mLⅠ型膠原酶和20 mg/mL 牛血清白蛋白的克氏-林格緩沖液（pH7.4）中，37℃震蕩消化30 min，添加等體積DMEM/F12培養基終止消化。靜置5 min，吸棄上層成熟脂肪細胞，以離心半徑13 cm、1 200 r/min離心5 min，棄含大量脂滴的上層及中間培養基層，將下層片狀沉淀在DMEM/F12培養基中重懸，100目濾網過濾。以3 ×104個/cm2細胞密度接種至培養瓶中，置于37℃、5%CO2孵箱培養，24 h后PBS緩沖液沖洗，除去未貼壁的細胞和細胞碎片。2～3 d更換1次完全培養基。待細胞生長至80%融合時，0.25%胰蛋白酶-0.1% EDTA消化、計數，以3 ×104 個 / cm2接種至新培養瓶，進行傳代培養。
1.5 脂肪脫細胞基質的細胞相容性評價
1.5.1 細胞毒性測定
將脂肪脫細胞基質置于無血清培養基，于37℃、5%CO2孵箱中浸泡24 h 制備浸提液，調整浸提液濃度為100%、75%、50%及25%。取第3 代hADSCs按1 ×104個/孔細胞密度接種于96孔板中，完全培養基培養24 h細胞貼壁后，吸棄完全培養基，分別加入200 μL 濃度為100%、75%、50%、25%的浸提液（100%、75%、50%、25%組）作為實驗組；以完全培養基培養作為陰性對照組。培養1、3、5 d，每組各取5孔，每孔加入20 μL濃度為5 g/L 的MTT，孵育4 h后加入150 μL DMSO，震蕩10 min，于490 nm波長處測定吸光度（A）值。計算細胞相對增殖率（relative growth rate，RGR），RGR= 實驗組A 值/ 陰性對照組A 值×100%，并對材料毒性進行分級[11]：0 級，RGR≥100%；1 級，80%≤RGR ＜ 100%；2 級，50%≤RGR ＜ 80%；3 級，30%≤RGR ＜ 50%；4 級，RGR ＜ 30%。
1.5.2 細胞黏附觀察
將脂肪脫細胞基質置于含完全培養基的6孔板中，37℃、5%CO2孵箱過夜。棄完全培養基后，取200 μL第3代hADSCs以1 ×106 個 / mL 均勻接種至脂肪脫細胞基質中，繼續于孵箱中培養；分別于15、30 min及1、2 h后取出，無菌PBS緩沖液終止培養。以2.5% 戊二醛固定、乙醇梯度脫水、乙酸異戊酯浸泡后，掃描電鏡觀察細胞在脂肪脫細胞基質上黏附情況。
1.5.3 細胞增殖觀察
取1.5.2中復合培養2 h的細胞-脂肪脫細胞基質復合物，加入2 mL完全培養基，置于37 ℃、5% CO2 孵箱培養，2～3 d 換液1 次。于培養3、7、14 d，每孔加250 μL鈣黃綠素（終濃度為2 μmol/ L） 和碘化丙啶（終濃度為4 μmol/ L），37℃避光孵育30 min。激光共聚焦顯微鏡觀察，活細胞呈綠色熒光，死細胞呈紅色熒光。
1.6 統計學方法
采用Microsoft Excel 2010版數據分析包進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 脂肪脫細胞基質相關檢測
2.1.1 大體觀察
脂肪組織脫細胞處理后基本保持原組織外形，呈乳白色，厚0.1～0.2 cm，有一定延展性（圖 1 a），凍干后呈多孔泡沫狀（圖 1 b）。
圖1
脂肪脫細胞基質大體觀察 ? 凍干處理前 ? 凍干處理后 ? ?2.1.2 組織學觀察
脫細胞處理前，HE染色示脂肪細胞膜結構完整、排列整齊，藍染細胞核靠近細胞膜且清晰可見（圖 2 a）；Masson染色示緊密排列的藍染細胞膜及細胞外的膠原纖維結構（圖 2 b）；天狼猩紅染色示致密粗大的紅色Ⅰ型膠原纖維，呈強折光性，纖細的綠色Ⅲ型膠原纖維與Ⅰ型膠原纖維垂直排列，呈弱折光性（圖 2 c）；油紅O染色示細胞內結構完整的紅色脂滴和藍染細胞核（圖 2 d）。
脫細胞處理后，HE染色示脫細胞效果良好，只見紅染的細胞外基質（圖 3 a）；Masson染色示藍染的細胞外膠質纖維結構（圖 3 b）；天狼猩紅染色示紅色Ⅰ型膠原纖維及綠色Ⅲ型膠原纖維較正常組織更致密，但仍呈連續、整齊、有序排列（圖 3 c）；油紅O染色未見明顯紅染的脂質成分和藍染細胞核（圖 3 d）。
2.1.3 免疫組織化學染色觀察
脫細胞處理前后脂肪組織均含層粘連蛋白、纖連蛋白及Ⅳ型膠原。見圖 4、5。
2.1.4 DNA殘留觀察
DAPI熒光染色示，脫細胞處理前可見明顯的藍色熒光細胞核（圖 6 a），脫細胞處理后未見明顯陽性細胞核（圖 6 b）。
圖6
脫細胞處理前后脂肪組織DAPI熒光染色觀察（倒置相差熒光顯微鏡×100） ? 正常脂肪組織 ? 脂肪脫細胞基質 ? ?2.1.5 掃描電鏡觀察
脂肪脫細胞基質中細胞徹底去除，呈現大小不一致的多孔隙結構和整齊有序而膠原纖維束交錯的細胞外基質微結構。見圖 7。
2.2 脂肪脫細胞基質的細胞相容性評價
2.2.1 細胞毒性測定
培養各時間點，不同濃度材料浸提液作用于細胞后RGR比較差異均無統計學意義（P＞ 0.05），毒性分級為0～1級。見表 1。
表1
不同濃度材料浸提液與細胞培養后各時間點RGR比較（n=5，%，2.2.2 細胞黏附觀察
掃描電鏡觀察示，接種15 min后hADSCs附于脂肪脫細胞基質表面，細胞呈球形，與材料接觸不緊密（圖 8 a）；30 min時細胞伸出偽足，可立體貼附于材料中，細胞間通過纖維絲樣突起相互連接（圖 8 b）；1 h時細胞之間接觸增多，接觸面增大，細胞黏附材料作用增強（圖 8 c）；2 h時細胞幾乎緊密黏附于材料上（圖 8 d）。
2.2.3 細胞增殖觀察
激光共聚焦顯微鏡觀察示，復合培養3 d可見較多活細胞，無明顯死細胞（圖 9 a）；7 d時細胞增殖明顯，呈密集排列（圖 9 b）；14 d時細胞排列較7 d時密集，出現少量死細胞（圖 9 c），并均勻分散地進入脂肪脫細胞基質內部。
3 討論
經脫細胞處理的天然細胞外基質結構材料，因保留了原組織特定的功能結構特點而成為組織工程研究的理想支架材料。目前廣泛研究的脫細胞材料有小腸黏膜、膀胱、血管、心臟瓣膜、脂肪組織等細胞外基質，如何快速、有效地去除細胞內成分，并完整保留天然細胞外基質結構，是組織工程支架材料研究的關鍵。
3.1 脂肪脫細胞方法的選擇及改進
目前，組織工程研究中常用的脫細胞處理方法包括物理機械法、化學試劑法或生物酶作用，旨在去除細胞內高抗原性的蛋白、脂質和核酸等細胞成分，避免材料引起的免疫反應和炎性反應。脫細胞處理同時需要最大限度保存細胞外基質成分，從而保持材料特定的生物學結構和功能，以利種子細胞生長，并最終形成新的生物替代組織或器官。脂肪組織中脂肪細胞超過其體積的90%[12]，細胞內脂肪酸豐富，細胞破裂后溢出的脂肪酸會嚴重影響脫細胞溶劑的滲透，所以對脂肪組織采用單一脫細胞方法很難快速、有效地去除細胞成分。目前脂肪組織脫細胞方法主要有反復高速離心、生物酶制劑消化、有機溶劑溶解提取細胞、陰離子表面活性劑SDS等化學試劑破壞細胞膜等，不同方法脫脂程度不一，聯合多種方式已成為發展趨勢[7-8, 10, 13-18]。
文獻報道異丙醇脫脂效果好，但它會與膠原蛋白和黏多糖發生交聯反應，改變材料表面特性[19-20]；胰蛋白酶能有效脫細胞，但也會破壞細胞外基質中的膠原蛋白和彈力蛋白，影響材料黏彈性[20-22]。材料微結構改變會影響種子細胞的黏附、增殖等細胞相容性，并且此副反應與處理時間成正相關[20, 23]。2010年Flynn[7]通過聯合物理方式、化學試劑和生物酶制劑脫細胞處理得到的脂肪脫細胞基質，基本保留了細胞外基質結構及有關生物活性物質，如層粘連蛋白和Ⅳ型膠原，且能誘導ADSCs成脂分化。該方法較簡便，可重復性較好，但化學試劑及生物酶處理時間較長，可能影響材料的生物相容性。研究表明，在軟骨、筋膜、骨等組織工程中采用凍融技術可有效脫細胞，整個過程對細胞外基質的結構和性能無顯著影響，且與凍融循環次數無明顯相關性[24-27]。因此，我們在進行脂肪組織脫細胞時，提出在Flynn法3次凍融基礎上增加2次凍融過程，同時將對生物相容性有影響的胰蛋白酶處理時間22 h和異丙醇處理時間56 h，分別縮短到12 h和44 h，使人脂肪組織脫細胞處理的總時間從Flynn法的5 d縮短至4 d；并且除凍融以外的所有脫細胞過程均采用低速震蕩，以加速脫細胞液均勻進入組織內部。經檢測脂肪脫細胞基質的組織成分和細胞相容性，提示本研究改進的脫細胞方式可行。
3.2 脫細胞效果分析
目前對脫細胞材料的檢測尚無明確統一標準，我們選擇對制備的脂肪脫細胞基質進行組織學和生物相容性檢測，分析脫細胞效果。正常脂肪組織主要由密集的脂肪細胞和少量細胞間質構成，脂肪細胞的細胞質大部分為脂滴，油紅O染色顯示成片的脂肪細胞呈紅色，明顯較間質細胞大，藍色細胞核擠在細胞邊緣。經脫細胞前后HE染色和DAPI染色比較，表明脫細胞處理后的細胞外基質未見明顯細胞核，油紅O染色示去脂完全，提示脫細胞方法有效。
目前對脫脂完全與否對支架材料的影響報道不一。Brown等[6]認為即使脫脂不完全，對材料誘導成脂分化作用亦無顯著影響；但Young等[16]研究證實完全脫脂有利于后續去除細胞成分。本研究結果提示完全脫脂有利于后續脫細胞試劑的滲透和 hADSCs黏附，因此我們認為在脫細胞基質制備過程中完全脫脂是重要環節。研究表明，有利于細胞黏附和定植的生物活性蛋白有層粘連蛋白、纖連蛋白等[28-30]，免疫組織化學染色觀察示，本研究制備的脂肪脫細胞基質不僅富含層粘連蛋白，還保留了豐富的纖連蛋白。
主要存在于細胞基膜和血管部位的Ⅳ型膠原蛋白，可能為下一步組織工程脂肪的血管再生提供有利條件[6]。Yu等[10]采用對膠原蛋白破壞較小的淀粉酶制備脂肪脫細胞基質，該基質泡沫在大鼠體內表現出明顯促血管生成作用。本研究免疫組織化學染色示，脫細胞處理后的脂肪組織仍保留了大部分Ⅳ型膠原蛋白，提示制備的材料在促進血管生成上可能具有優越性，但有待進一步研究明確。種子細胞在支架材料中的黏附、增殖等與材料孔徑相關[31-32]，Masson染色和天狼猩紅染色示，脂肪脫細胞基質較完整地保留了Ⅰ 型膠原和與之垂直排列的Ⅲ型膠原，并維持了脂肪組織中由密集脂肪細胞間隙內少量膠原纖維和細胞間質中稠密膠原纖維組成的微結構，有利于復合hADSCs后較均勻地進入整個材料中特定位置。掃描電鏡觀察示，種子細胞通過與細的膠原纖維接觸而黏附于材料表面，進一步與較粗大的膠原纖維接觸而更好地融入材料內部。
脂肪脫細胞基質的制備方法決定了其保留細胞外基質天然功能結構的程度，在有效脫細胞前提下，盡量減少對細胞外基質生理結構和生物活性的影響，是制備脫細胞生物材料的不斷追求。本研究制備的脂肪脫細胞基質生理結構保留良好，且富含有利于細胞黏附生長的活性蛋白，細胞相容性好，有望成為脂肪組織工程支架材料。
目前，臨床常用的脂肪組織缺損修復方法包括自體或同種異體移植物填充，存在來源有限和免疫排斥反應等缺點。組織工程方法為脂肪組織缺損修復重建提供了新思路。目前，以脂肪組織為載體的組織工程研究主要集中在種子細胞篩選、支架材料制備、生物活性因子誘導刺激、組織工程化脂肪構建及體內移植等方面。自2001年Zuk等從脂肪組織中成功分離獲得脂肪干細胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）以來，經過不斷的探索，ADSCs已基本確定為具有多向分化潛能的MSCs，是包括脂肪組織工程在內的多種組織再生的重要細胞來源[1-5]。
目前，制約脂肪組織工程發展的關鍵問題之一在于選取理想的生物支架材料。其中，低免疫原性的脫細胞生物材料因具有天然特定的三維結構、富含相關活性因子等特性而備受關注。研究表明，經不同脫細胞方法獲得的脂肪脫細胞基質均能基本保持組織特異性，具有誘導ADSCs成脂分化的作用[6-10]。為進一步探索更高效的人脂肪脫細胞基質制備方法，并了解其結構和功能，本實驗聯合反復凍融、有機溶劑抽提和酶消化法制備脂肪脫細胞基質，初步觀察其組成成分和細胞相容性，為脂肪組織工程尋找合適的支架材料奠定基礎。
1 材料與方法
1.1 實驗材料
腹壁皮下脂肪組織由四川大學華西醫院接受乳腺癌根治術或乳腺癌改良根治術患者自愿捐贈。切取后將一部分置于含20 mg/mL牛血清白蛋白的無鈣、鎂PBS緩沖液中，冰浴2 h內進行人ADSCs（human ADSCs，hADSCs）分離培養；另一部分置于4℃PBS緩沖液中保存，用于制備脂肪脫細胞基質。
1.2 主要試劑與儀器
胰蛋白酶、異丙醇（成都科龍化工公司）；三羥甲基氨基甲烷、苯甲基磺酰氟、EDTA、Ⅰ型脫氧核糖核酸酶（deoxyribonucleaseⅠ，DNase-Ⅰ）、核糖核酸酶A（ribonuclease A，RNase A）（Sigma 公司，美國）；DMEM/F12培養基、FBS（HyClone公司，美國）；牛血清白蛋白（Roche 公司，瑞士）；鈣黃綠素及碘化丙啶熒光染料、DAPI熒光染料、兔抗大鼠Ⅳ型膠原、層粘連蛋白及纖連蛋白多克隆抗體、生物素標記的山羊抗兔IgG（北京中杉金橋生物技術有限公司）。
倒置相差熒光顯微鏡（Leica公司，德國）；細胞培養孵箱、-40℃冰箱（SANYO公司，日本）；DW3 真空凍干機（Heto公司，德國）；掃描電鏡、偏振光顯微鏡（Olympus公司，日本）；激光共聚焦顯微鏡（Nikon公司，日本）。
1.3 脂肪脫細胞基質制備及相關檢測
取脂肪組織切成0.3～0.5 cm厚組織塊，無菌PBS緩沖液充分沖洗去除血液雜質，置于低滲三羥甲基氨基甲烷緩沖液（含10 mmol/L三羥甲基氨基甲烷、5 mmol/L EDTA）中，-80℃冷凍、37℃水浴復溫，反復凍融5次； 0.25%胰蛋白酶-0.1%EDTA 處理6 h，無菌PBS緩沖液沖洗30 min × 3次；異丙醇處理36 h，無菌PBS緩沖液沖洗30 min × 3次；0.25%胰蛋白酶-0.1%EDTA處理6 h，無菌PBS緩沖液沖洗30 min × 3次；5 ×107 U/ L DNase-Ⅰ及1 ×106 U/L RNase A處理16 h，無菌PBS緩沖液沖洗30 min × 3次；異丙醇處理8 h，無菌PBS緩沖液沖洗30 min × 3次。所有溶液均添加雙抗（100 U/mL青霉素、0.1 mg/ mL鏈霉素），處理過程均在持續均勻攪拌下進行，-40℃過夜后置于真空凍干機24 h凍干，環氧乙烷低溫消毒后密封備用。
1.3.1 大體觀察
大體觀察脂肪脫細胞基質形狀、顏色及凍干后性狀，直尺測量其厚度。
1.3.2 組織學觀察
取脫細胞處理前后脂肪組織，一部分經4%多聚甲醛固定24 h，梯度乙醇脫水，石蠟包埋，5 μm厚連續切片，行HE 染色及Masson染色，光鏡觀察細胞結構；行天狼猩紅染色，偏振光顯微鏡觀察膠原蛋白結構。另一部分行冰凍切片后油紅O染色，光鏡觀察脂滴形成。
1.3.3 免疫組織化學染色觀察
取1.3.2制備的石蠟切片行免疫組織化學染色，一抗為兔抗大鼠Ⅳ型膠原、纖連蛋白及層粘連蛋白多克隆抗體（工作濃度1 ∶ 200），二抗為生物素標記的山羊抗兔IgG，DAB顯色，光鏡下觀察，以棕黃色染色為陽性表達。
1.3.4 DNA殘留觀察
取1.3.2制備的石蠟切片行DAPI熒光染色，倒置相差熒光顯微鏡觀察細胞核殘留情況。
1.3.5 掃描電鏡觀察
取脂肪脫細胞基質，以2.5%戊二醛固定、乙醇梯度脫水、乙酸異戊酯浸泡后，掃描電鏡觀察微結構。
1.4 hADSCs分離培養
采用酶消化法[5]分離培養hADSCs。取脂肪組織去除結締組織和血管后，剪成約1 mm × 1 mm × 1 mm 小塊。置于含1 mg/mLⅠ型膠原酶和20 mg/mL 牛血清白蛋白的克氏-林格緩沖液（pH7.4）中，37℃震蕩消化30 min，添加等體積DMEM/F12培養基終止消化。靜置5 min，吸棄上層成熟脂肪細胞，以離心半徑13 cm、1 200 r/min離心5 min，棄含大量脂滴的上層及中間培養基層，將下層片狀沉淀在DMEM/F12培養基中重懸，100目濾網過濾。以3 ×104個/cm2細胞密度接種至培養瓶中，置于37℃、5%CO2孵箱培養，24 h后PBS緩沖液沖洗，除去未貼壁的細胞和細胞碎片。2～3 d更換1次完全培養基。待細胞生長至80%融合時，0.25%胰蛋白酶-0.1% EDTA消化、計數，以3 ×104 個 / cm2接種至新培養瓶，進行傳代培養。
1.5 脂肪脫細胞基質的細胞相容性評價
1.5.1 細胞毒性測定
將脂肪脫細胞基質置于無血清培養基，于37℃、5%CO2孵箱中浸泡24 h 制備浸提液，調整浸提液濃度為100%、75%、50%及25%。取第3 代hADSCs按1 ×104個/孔細胞密度接種于96孔板中，完全培養基培養24 h細胞貼壁后，吸棄完全培養基，分別加入200 μL 濃度為100%、75%、50%、25%的浸提液（100%、75%、50%、25%組）作為實驗組；以完全培養基培養作為陰性對照組。培養1、3、5 d，每組各取5孔，每孔加入20 μL濃度為5 g/L 的MTT，孵育4 h后加入150 μL DMSO，震蕩10 min，于490 nm波長處測定吸光度（A）值。計算細胞相對增殖率（relative growth rate，RGR），RGR= 實驗組A 值/ 陰性對照組A 值×100%，并對材料毒性進行分級[11]：0 級，RGR≥100%；1 級，80%≤RGR ＜ 100%；2 級，50%≤RGR ＜ 80%；3 級，30%≤RGR ＜ 50%；4 級，RGR ＜ 30%。
1.5.2 細胞黏附觀察
將脂肪脫細胞基質置于含完全培養基的6孔板中，37℃、5%CO2孵箱過夜。棄完全培養基后，取200 μL第3代hADSCs以1 ×106 個 / mL 均勻接種至脂肪脫細胞基質中，繼續于孵箱中培養；分別于15、30 min及1、2 h后取出，無菌PBS緩沖液終止培養。以2.5% 戊二醛固定、乙醇梯度脫水、乙酸異戊酯浸泡后，掃描電鏡觀察細胞在脂肪脫細胞基質上黏附情況。
1.5.3 細胞增殖觀察
取1.5.2中復合培養2 h的細胞-脂肪脫細胞基質復合物，加入2 mL完全培養基，置于37 ℃、5% CO2 孵箱培養，2～3 d 換液1 次。于培養3、7、14 d，每孔加250 μL鈣黃綠素（終濃度為2 μmol/ L） 和碘化丙啶（終濃度為4 μmol/ L），37℃避光孵育30 min。激光共聚焦顯微鏡觀察，活細胞呈綠色熒光，死細胞呈紅色熒光。
1.6 統計學方法
采用Microsoft Excel 2010版數據分析包進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 脂肪脫細胞基質相關檢測
2.1.1 大體觀察
脂肪組織脫細胞處理后基本保持原組織外形，呈乳白色，厚0.1～0.2 cm，有一定延展性（圖 1 a），凍干后呈多孔泡沫狀（圖 1 b）。
圖1
脂肪脫細胞基質大體觀察 ? 凍干處理前 ? 凍干處理后 ? ?2.1.2 組織學觀察
脫細胞處理前，HE染色示脂肪細胞膜結構完整、排列整齊，藍染細胞核靠近細胞膜且清晰可見（圖 2 a）；Masson染色示緊密排列的藍染細胞膜及細胞外的膠原纖維結構（圖 2 b）；天狼猩紅染色示致密粗大的紅色Ⅰ型膠原纖維，呈強折光性，纖細的綠色Ⅲ型膠原纖維與Ⅰ型膠原纖維垂直排列，呈弱折光性（圖 2 c）；油紅O染色示細胞內結構完整的紅色脂滴和藍染細胞核（圖 2 d）。
脫細胞處理后，HE染色示脫細胞效果良好，只見紅染的細胞外基質（圖 3 a）；Masson染色示藍染的細胞外膠質纖維結構（圖 3 b）；天狼猩紅染色示紅色Ⅰ型膠原纖維及綠色Ⅲ型膠原纖維較正常組織更致密，但仍呈連續、整齊、有序排列（圖 3 c）；油紅O染色未見明顯紅染的脂質成分和藍染細胞核（圖 3 d）。
2.1.3 免疫組織化學染色觀察
脫細胞處理前后脂肪組織均含層粘連蛋白、纖連蛋白及Ⅳ型膠原。見圖 4、5。
2.1.4 DNA殘留觀察
DAPI熒光染色示，脫細胞處理前可見明顯的藍色熒光細胞核（圖 6 a），脫細胞處理后未見明顯陽性細胞核（圖 6 b）。
圖6
脫細胞處理前后脂肪組織DAPI熒光染色觀察（倒置相差熒光顯微鏡×100） ? 正常脂肪組織 ? 脂肪脫細胞基質 ? ?2.1.5 掃描電鏡觀察
脂肪脫細胞基質中細胞徹底去除，呈現大小不一致的多孔隙結構和整齊有序而膠原纖維束交錯的細胞外基質微結構。見圖 7。
2.2 脂肪脫細胞基質的細胞相容性評價
2.2.1 細胞毒性測定
培養各時間點，不同濃度材料浸提液作用于細胞后RGR比較差異均無統計學意義（P＞ 0.05），毒性分級為0～1級。見表 1。
表1
不同濃度材料浸提液與細胞培養后各時間點RGR比較（n=5，%，2.2.2 細胞黏附觀察
掃描電鏡觀察示，接種15 min后hADSCs附于脂肪脫細胞基質表面，細胞呈球形，與材料接觸不緊密（圖 8 a）；30 min時細胞伸出偽足，可立體貼附于材料中，細胞間通過纖維絲樣突起相互連接（圖 8 b）；1 h時細胞之間接觸增多，接觸面增大，細胞黏附材料作用增強（圖 8 c）；2 h時細胞幾乎緊密黏附于材料上（圖 8 d）。
2.2.3 細胞增殖觀察
激光共聚焦顯微鏡觀察示，復合培養3 d可見較多活細胞，無明顯死細胞（圖 9 a）；7 d時細胞增殖明顯，呈密集排列（圖 9 b）；14 d時細胞排列較7 d時密集，出現少量死細胞（圖 9 c），并均勻分散地進入脂肪脫細胞基質內部。
3 討論
經脫細胞處理的天然細胞外基質結構材料，因保留了原組織特定的功能結構特點而成為組織工程研究的理想支架材料。目前廣泛研究的脫細胞材料有小腸黏膜、膀胱、血管、心臟瓣膜、脂肪組織等細胞外基質，如何快速、有效地去除細胞內成分，并完整保留天然細胞外基質結構，是組織工程支架材料研究的關鍵。
3.1 脂肪脫細胞方法的選擇及改進
目前，組織工程研究中常用的脫細胞處理方法包括物理機械法、化學試劑法或生物酶作用，旨在去除細胞內高抗原性的蛋白、脂質和核酸等細胞成分，避免材料引起的免疫反應和炎性反應。脫細胞處理同時需要最大限度保存細胞外基質成分，從而保持材料特定的生物學結構和功能，以利種子細胞生長，并最終形成新的生物替代組織或器官。脂肪組織中脂肪細胞超過其體積的90%[12]，細胞內脂肪酸豐富，細胞破裂后溢出的脂肪酸會嚴重影響脫細胞溶劑的滲透，所以對脂肪組織采用單一脫細胞方法很難快速、有效地去除細胞成分。目前脂肪組織脫細胞方法主要有反復高速離心、生物酶制劑消化、有機溶劑溶解提取細胞、陰離子表面活性劑SDS等化學試劑破壞細胞膜等，不同方法脫脂程度不一，聯合多種方式已成為發展趨勢[7-8, 10, 13-18]。
文獻報道異丙醇脫脂效果好，但它會與膠原蛋白和黏多糖發生交聯反應，改變材料表面特性[19-20]；胰蛋白酶能有效脫細胞，但也會破壞細胞外基質中的膠原蛋白和彈力蛋白，影響材料黏彈性[20-22]。材料微結構改變會影響種子細胞的黏附、增殖等細胞相容性，并且此副反應與處理時間成正相關[20, 23]。2010年Flynn[7]通過聯合物理方式、化學試劑和生物酶制劑脫細胞處理得到的脂肪脫細胞基質，基本保留了細胞外基質結構及有關生物活性物質，如層粘連蛋白和Ⅳ型膠原，且能誘導ADSCs成脂分化。該方法較簡便，可重復性較好，但化學試劑及生物酶處理時間較長，可能影響材料的生物相容性。研究表明，在軟骨、筋膜、骨等組織工程中采用凍融技術可有效脫細胞，整個過程對細胞外基質的結構和性能無顯著影響，且與凍融循環次數無明顯相關性[24-27]。因此，我們在進行脂肪組織脫細胞時，提出在Flynn法3次凍融基礎上增加2次凍融過程，同時將對生物相容性有影響的胰蛋白酶處理時間22 h和異丙醇處理時間56 h，分別縮短到12 h和44 h，使人脂肪組織脫細胞處理的總時間從Flynn法的5 d縮短至4 d；并且除凍融以外的所有脫細胞過程均采用低速震蕩，以加速脫細胞液均勻進入組織內部。經檢測脂肪脫細胞基質的組織成分和細胞相容性，提示本研究改進的脫細胞方式可行。
3.2 脫細胞效果分析
目前對脫細胞材料的檢測尚無明確統一標準，我們選擇對制備的脂肪脫細胞基質進行組織學和生物相容性檢測，分析脫細胞效果。正常脂肪組織主要由密集的脂肪細胞和少量細胞間質構成，脂肪細胞的細胞質大部分為脂滴，油紅O染色顯示成片的脂肪細胞呈紅色，明顯較間質細胞大，藍色細胞核擠在細胞邊緣。經脫細胞前后HE染色和DAPI染色比較，表明脫細胞處理后的細胞外基質未見明顯細胞核，油紅O染色示去脂完全，提示脫細胞方法有效。
目前對脫脂完全與否對支架材料的影響報道不一。Brown等[6]認為即使脫脂不完全，對材料誘導成脂分化作用亦無顯著影響；但Young等[16]研究證實完全脫脂有利于后續去除細胞成分。本研究結果提示完全脫脂有利于后續脫細胞試劑的滲透和 hADSCs黏附，因此我們認為在脫細胞基質制備過程中完全脫脂是重要環節。研究表明，有利于細胞黏附和定植的生物活性蛋白有層粘連蛋白、纖連蛋白等[28-30]，免疫組織化學染色觀察示，本研究制備的脂肪脫細胞基質不僅富含層粘連蛋白，還保留了豐富的纖連蛋白。
主要存在于細胞基膜和血管部位的Ⅳ型膠原蛋白，可能為下一步組織工程脂肪的血管再生提供有利條件[6]。Yu等[10]采用對膠原蛋白破壞較小的淀粉酶制備脂肪脫細胞基質，該基質泡沫在大鼠體內表現出明顯促血管生成作用。本研究免疫組織化學染色示，脫細胞處理后的脂肪組織仍保留了大部分Ⅳ型膠原蛋白，提示制備的材料在促進血管生成上可能具有優越性，但有待進一步研究明確。種子細胞在支架材料中的黏附、增殖等與材料孔徑相關[31-32]，Masson染色和天狼猩紅染色示，脂肪脫細胞基質較完整地保留了Ⅰ 型膠原和與之垂直排列的Ⅲ型膠原，并維持了脂肪組織中由密集脂肪細胞間隙內少量膠原纖維和細胞間質中稠密膠原纖維組成的微結構，有利于復合hADSCs后較均勻地進入整個材料中特定位置。掃描電鏡觀察示，種子細胞通過與細的膠原纖維接觸而黏附于材料表面，進一步與較粗大的膠原纖維接觸而更好地融入材料內部。
脂肪脫細胞基質的制備方法決定了其保留細胞外基質天然功能結構的程度，在有效脫細胞前提下，盡量減少對細胞外基質生理結構和生物活性的影響，是制備脫細胞生物材料的不斷追求。本研究制備的脂肪脫細胞基質生理結構保留良好，且富含有利于細胞黏附生長的活性蛋白，細胞相容性好，有望成為脂肪組織工程支架材料。
