引用本文： 李晉輝, 陳大鵬, 唐軍, 伍金林, 屈藝, 母得志. 整合素β8在共培養系統中對缺氧缺血后神經元凋亡的影響. 中國修復重建外科雜志, 2014, 28(3): 366-370. doi: 10.7507/1002-1892.20140082 復制
星形膠質細胞是中樞神經系統中數量最多的神經細胞之一，它在腦缺氧缺血后異常活躍，可分泌生長因子、細胞因子等修復損傷神經元，促進軸突再生及誘導神經元遷移，起到恢復神經系統正常功能的作用[1-3]。星形膠質細胞是一種附著生長細胞，需要與周圍基質及細胞相互粘著才能存活和生長，必須在整合素介導下才能發揮作用[4-5]。整合素β8是成熟星形膠質細胞表達的主要整合素，因此可能對細胞功能起著重要的調控作用。關于星形膠質細胞是否參與損傷后神經元凋亡的調控，整合素β8在這一過程中發揮何種作用，目前罕見相關報道。為此，本研究通過建立體外星形膠質細胞與神經元共培養系統，模擬體內細胞間相互作用，觀測缺氧缺血后星形膠質細胞整合素β8表達變化及對神經元凋亡的影響，以闡明發育期大鼠缺氧缺血性腦損傷后，整合素β8對神經元是否具有保護作用。報告如下。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
清潔級孕16 d SD大鼠脫臼處死后取胎鼠60只，體重6～9 g，平均7 g；新生1～3 d SD大鼠60只，雌雄不限，體重10～14 g，平均12 g；均由四川大學華西醫學中心實驗動物中心提供。
原代細胞培養液、Nurobasal培養基、B27（GIBCO公司，美國）；兔抗大鼠膠質纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）抗體、兔抗大鼠神經核（neuronal nuclei，NeuN）抗體、山羊抗兔IgG抗體、TRITC標記的山羊抗兔IgG（Santa Cruz公司，美國）；RT-PCR試劑盒（Fermentas公司，加拿大）；TUNEL原位細胞凋亡檢測試劑盒（Roche公司，美國）。整合素β8及β-actin引物、TaqMan探針由上海生工生物工程有限公司合成；整合素β8小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）及對照siRNA由既往實驗獲得[6]；pSicoR載體由美國Jacks Lab惠贈；T293細胞（美國標準生物品收藏中心）。插入式細胞培養器（Millipore公司，美國）。光鏡、熒光顯微鏡（Leica公司，德國）；Gel-pro凝膠成像分析軟件（Carestream公司，加拿大）。
1.2 星形膠質細胞及神經元的分離、培養與鑒定
1.2.1 分離培養
參照文獻[7-8]方法分離培養星形膠質細胞及神經元。取60只新生SD大鼠，乙醚麻醉斷頭處死后，分離腦膜及血管組織。取腦皮質并剪碎，加入含0.25%胰蛋白酶的PBS液，37℃消化5～10 min，加入10%FBS終止消化。75 μm不銹鋼篩網過濾，收集細胞懸液，以離心半徑15 cm，1 200 r/min 離心5 min條件離心2次。加入培養液（含10%FBS的H-DMEM培養基），置于37℃、5%CO2及飽和濕度培養箱中培養。接種3 d后更換培養液，以后每2天半量換液1次。培養15 d獲得成熟星形膠質細胞。
取胎鼠腦皮質，同上法收集細胞懸液、離心后，加入含2%B27的Nurobasal培養基，置于37℃、5%CO2及飽和濕度培養箱中。接種1 d后，于培養基中加入5 μmol/L阿糖胞苷抑制膠質細胞生長。24 h后全量換液，以后每2 天半量換液1次。培養7 d獲得成熟神經元。
1.2.2 細胞純度鑒定
取星形膠質細胞及神經元行細胞爬片，0.01 mol/L PBS液清洗后，4%多聚甲醛固定。3%H2O2封閉內源性過氧化物酶，10%山羊血清37℃孵育20 min，分別滴加一抗兔抗大鼠GFAP抗體（1∶1 000）和兔抗大鼠NeuN抗體（1∶800），4℃孵育過夜。滴加二抗TRITC標記的山羊抗兔IgG，37℃孵育30 min，以DAPI對細胞核進行染色，熒光顯微鏡下觀察。星形膠質細胞GFAP染色呈紅色；神經元NeuN染色呈紅色，細胞核呈藍色。
1.3 體外模擬缺氧缺血方法
參照文獻[9]方法，以氧葡萄糖剝奪體外模擬缺氧缺血。將細胞培養基更換為無糖DMEM培養基，細胞置入通混合氣（5%CO2、95%N2）的缺氧裝置中。6 h后更換為原培養液，并以正常條件繼續培養，模擬復氧。
1.4 星形膠質細胞與神經元共培養方法
取神經元（下層細胞）以細胞密度1 ×106個/mL接種于6孔板，加入含2%B27的Nurobasal培養基培養。5 d后在6孔板中置入插入式細胞培養器，以細胞密度1 ×106 個 /mL在培養皿上接種星形膠質細胞（上層細胞）。上、下層細胞共用培養液（含20%FBS、10%馬血清的H-DMEM培養基），下層細胞培養液達4 mL以上，上層細胞達2 mL以上，置于37℃、5%CO2及飽和濕度培養箱中繼續培養。
1.5 觀測指標
1.5.1 缺氧缺血對星形膠質細胞中整合素β8
mRNA表達的影響根據大鼠整合素β8基因序列合成引物：上游引物，5'-CTGGGTATTTTCACTTGTTCT-3'；下游引物，5'-CAGTATCACAACGTTCACTT-3'。取體外模擬缺氧缺血培養復氧后12 h、1 d、2 d星形膠質細胞（實驗組）以及正常星形膠質細胞（對照組），提取細胞總RNA，合成cDNA。參照RT-PCR試劑盒說明擴增目的基因cDNA片段。反應條件：94℃預變性4 min，94℃變性45 s，55℃復性45 s，72℃延伸45 s，38個循環。2%瓊脂糖凝膠電泳，Gel-pro凝膠成像分析軟件測定條帶積分吸光度（IA）值，以β-actin為內參。實驗重復5次，取均值。
1.5.2 感染整合素β8
siRNA對星形膠質細胞中整合素β8 mRNA表達的影響根據整合素β8基因序列設計19個核苷酸的siRNA靶序列GCATCAATGCA-CAATAATA，同時設計對照序列。采用pSicoR載體構建慢病毒載體，轉染T293細胞獲得病毒上清。取正常星形膠質細胞接種于6孔板，待細胞約80%融合后，加入病毒上清（感染復數=10）。收集感染后1、2、3 d的細胞（實驗組），檢測整合素β8 mRNA表達。以正常星形膠質細胞作為正常對照組，對照siRNA感染的星形膠質細胞作為對照組。檢測結果以與正常對照組比較的百分比表示。設計整合素β8 TaqMan探針為：5'-FAM-CCTCTTGAACACACCATCCAC-TAMRA-3'，實驗方法及條件同1.5.1。
1.5.3 TUNEL染色法檢測神經元凋亡
于6孔板中置入細胞培養爬片并接種神經元，根據處理方式不同分為4組。對照組：正常神經元；單純缺氧缺血組：取正常神經元行體外模擬缺氧缺血處理，復氧后1 d收集細胞；共培養缺氧缺血組：取正常神經元及星形膠質細胞共培養，同時行缺氧缺血處理，復氧后1 d收集細胞；β8 RNA干擾組：取1.5.2中經整合素β8 siRNA感染后2 d的星形膠質細胞，與正常神經元共培養，同時行缺氧缺血處理，復氧后1 d收集細胞。按TUNEL原位細胞凋亡檢測試劑盒說明進行操作。取各組神經元細胞爬片，PBS液清洗，4%冰凍甲醛固定30 min，滴加TUNEL反應液37℃孵育1 h，PBS清洗，滴加辣根過氧化物酶標記液，DAB顯色試劑盒顯色，蘇木素復染，透明，封片。光鏡下觀察細胞核呈棕黃色染色為凋亡細胞，每組取6張切片，每張切片取5個以上高倍視野（× 400），計算凋亡指數（apoptotic index，AI）。AI=凋亡細胞數/細胞總數 ×100%，取均值。
1.6 統計學方法
采用SPSS10.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 細胞形態觀察及純度鑒定
星形膠質細胞培養15 d后，光鏡下可見細胞具有大量圍繞胞體的足突，呈星狀分布。神經元培養7 d后，呈圓形、橢圓形或錐形，表面光滑，折光性強，突起相連呈網絡樣生長。見圖 1。
圖1
細胞形態觀察 ? 星形膠質細胞培養15 d（× 400） ? 神經元培養7 d（× 400） ? ?熒光顯微鏡下觀察示，星形膠質細胞GFAP染色呈陽性，著色定位于細胞質；神經元NeuN染色呈陽性，主要分布于細胞核及核周，細胞質亦有顆粒狀陽性表達；陽性率均達90%以上。見圖 2。
2.2 缺氧缺血對星形膠質細胞中整合素β8 mRNA表達的影響
與對照組（11.29 ± 0.75）比較，實驗組復氧后12 h整合素β8 mRNA表達為（18.92 ± 0.55），顯著增加，復氧后1 d達峰值（30.26 ± 0.52），之后緩慢下降，復氧后2 d仍維持較高水平（24.67 ± 0.41）；各時間點實驗組與對照組間比較及實驗組復氧后各時間點間比較，差異均有統計學意義（P＜ 0.05）。見圖 3。
2.3 感染整合素β8 siRNA對星形膠質細胞中整合素β8 mRNA表達的影響
與正常對照組相比，實驗組星形膠質細胞感染整合素β8 siRNA后1 d，其整合素β8 mRNA表達水平顯著下降，2 d時降至最低值，3 d時仍較低，差異均有統計學意義（P＜ 0.05）。對照組與正常對照組比較，差異無統計學意義（P＞ 0.05）；且顯著高于實驗組各時間點，比較差異均有統計學意義（P＜ 0.05）。見圖 4。
2.4 TUNEL染色法檢測神經元凋亡
對照組偶見神經元發生凋亡，AI為2% ± 0%。單純缺氧缺血組、共培養缺氧缺血組及β8 RNA干擾組凋亡神經元明顯增多；AI分別為60% ± 10%、40% ± 5%及50% ± 3%，與對照組比較差異均有統計學意義（P＜ 0.05）。共培養缺氧缺血組及β8 RNA干擾組AI明顯低于單純缺氧缺血組，共培養缺氧缺血組低于β8 RNA干擾組，差異均有統計學意義（P＜ 0.05）。見圖 5。
3 討論
整合素是位于細胞表面的一類糖蛋白，由α和β兩種亞基通過非共價鍵組成，是細胞表面重要的兼具黏附和信號傳導功能的受體[10-12]。整合素β8亞基是星形膠質細胞表達的主要整合素之一，在中樞神經系統中僅能與αv亞基專一配對形成異二聚體[13]。目前對整合素β8的研究主要針對其在胚胎期對血管發育的作用，提示其與中樞神經系統血管發育密切相關[14-16]。中樞神經系統缺氧缺血性損傷后，整合素β8的表達變化及是否參與損傷后修復研究甚少。本研究結果顯示，缺氧缺血后星形膠質細胞中整合素β8 mRNA表達明顯增高，復氧后1 d達高峰，復氧后2 d仍維持較高水平，提示整合素β8 可能參與了缺氧缺血后一系列級聯反應。此外，我們既往已成功利用慢病毒載體建立了RNA干擾系統特異性阻斷整合素β8表達[6]。本次研究以整合素β8 siRNA感染星形膠質細胞，2 d后細胞整合素β8 mRNA表達僅達正常對照組的22%左右，成功建立了整合素β8基因沉默的星形膠質細胞模型。
傳統混合共培養模式是將兩種細胞先后接種于同一生長平面上，保證細胞大量接觸。本研究則利用插入式細胞培養器，建立了體外星形膠質細胞與神經元共培養體系。該共培養體系中，允許生物大分子及培養基在膜兩邊自由流動但隔離細胞，由于星形膠質細胞和神經元并不能直接接觸，故該培養體系不能完全模擬體內環境，是體外研究受限之處。但我們認為與傳統混合共同培養模式相比，該共培養體系具有以下優點：① 其為三維細胞培養體系，上、下層細胞可在相對獨立環境中生長，可以分別收集細胞進行研究，避免了在分析檢測過程中其他因素的影響；② 上、下層細胞共用培養基，便于研究可溶性物質通過旁分泌途徑對細胞生物學特性的影響；③ 模擬了“內環境”，更符合體內條件下各細胞間的交通。本研究旨在探討星形膠質細胞在缺氧缺血下分泌的細胞因子對神經元的調控作用，因此該共培養體系雖不可完全模擬體內環境，尚能滿足本實驗要求。
TUNEL染色是一種經典而特異的檢測細胞凋亡方法，本研究檢測發現，正常神經元極少發生凋亡，缺氧缺血并復氧1 d后，單純缺氧缺血組AI明顯增高，共培養缺氧缺血組顯著低于單純缺氧缺血組；β8 RNA干擾組AI較未阻斷時增高，但仍低于單純缺氧缺血組。提示缺氧缺血后，星形膠質細胞高表達的整合素β8可在一定程度上減輕神經元凋亡的發生，其機制可能與整合素β8依賴的TGF-β1活化相關。我們既往及其他相關研究結果均提示，星形膠質細胞表達的整合素β8是中樞神經系統中TGF-β1活化的關鍵調控因素[6, 17]。TGF-β1是一種在中樞神經系統中廣泛分布的細胞因子，對中樞神經系統正常功能的維持、神經細胞的分化凋亡及損傷后修復等方面具有重要作用[18-20]。在缺氧、興奮性毒性及代謝性損傷模型中，TGF-β1已被證實對體外培養的神經元具有保護作用[21-22]。而TGF-β1介導的神經元保護作用與其上調抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xL有關，研究發現活化的TGF-β1可激活NF-κB，激活下游ALK1/Smad1/5信號通路，從而上調抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xL表達，降低神經元凋亡水平[23]。
綜上述，本研究表明在缺氧缺血時，星形膠質細胞整合素β8表達增高，神經元凋亡率下降，對受損神經元具有明顯保護作用。而整合素β8/TGF-β1信號通路在神經元存活中可能起重要作用，有望成為缺氧缺血性腦損傷干預治療的一個新靶點。
星形膠質細胞是中樞神經系統中數量最多的神經細胞之一，它在腦缺氧缺血后異常活躍，可分泌生長因子、細胞因子等修復損傷神經元，促進軸突再生及誘導神經元遷移，起到恢復神經系統正常功能的作用[1-3]。星形膠質細胞是一種附著生長細胞，需要與周圍基質及細胞相互粘著才能存活和生長，必須在整合素介導下才能發揮作用[4-5]。整合素β8是成熟星形膠質細胞表達的主要整合素，因此可能對細胞功能起著重要的調控作用。關于星形膠質細胞是否參與損傷后神經元凋亡的調控，整合素β8在這一過程中發揮何種作用，目前罕見相關報道。為此，本研究通過建立體外星形膠質細胞與神經元共培養系統，模擬體內細胞間相互作用，觀測缺氧缺血后星形膠質細胞整合素β8表達變化及對神經元凋亡的影響，以闡明發育期大鼠缺氧缺血性腦損傷后，整合素β8對神經元是否具有保護作用。報告如下。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
清潔級孕16 d SD大鼠脫臼處死后取胎鼠60只，體重6～9 g，平均7 g；新生1～3 d SD大鼠60只，雌雄不限，體重10～14 g，平均12 g；均由四川大學華西醫學中心實驗動物中心提供。
原代細胞培養液、Nurobasal培養基、B27（GIBCO公司，美國）；兔抗大鼠膠質纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）抗體、兔抗大鼠神經核（neuronal nuclei，NeuN）抗體、山羊抗兔IgG抗體、TRITC標記的山羊抗兔IgG（Santa Cruz公司，美國）；RT-PCR試劑盒（Fermentas公司，加拿大）；TUNEL原位細胞凋亡檢測試劑盒（Roche公司，美國）。整合素β8及β-actin引物、TaqMan探針由上海生工生物工程有限公司合成；整合素β8小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）及對照siRNA由既往實驗獲得[6]；pSicoR載體由美國Jacks Lab惠贈；T293細胞（美國標準生物品收藏中心）。插入式細胞培養器（Millipore公司，美國）。光鏡、熒光顯微鏡（Leica公司，德國）；Gel-pro凝膠成像分析軟件（Carestream公司，加拿大）。
1.2 星形膠質細胞及神經元的分離、培養與鑒定
1.2.1 分離培養
參照文獻[7-8]方法分離培養星形膠質細胞及神經元。取60只新生SD大鼠，乙醚麻醉斷頭處死后，分離腦膜及血管組織。取腦皮質并剪碎，加入含0.25%胰蛋白酶的PBS液，37℃消化5～10 min，加入10%FBS終止消化。75 μm不銹鋼篩網過濾，收集細胞懸液，以離心半徑15 cm，1 200 r/min 離心5 min條件離心2次。加入培養液（含10%FBS的H-DMEM培養基），置于37℃、5%CO2及飽和濕度培養箱中培養。接種3 d后更換培養液，以后每2天半量換液1次。培養15 d獲得成熟星形膠質細胞。
取胎鼠腦皮質，同上法收集細胞懸液、離心后，加入含2%B27的Nurobasal培養基，置于37℃、5%CO2及飽和濕度培養箱中。接種1 d后，于培養基中加入5 μmol/L阿糖胞苷抑制膠質細胞生長。24 h后全量換液，以后每2 天半量換液1次。培養7 d獲得成熟神經元。
1.2.2 細胞純度鑒定
取星形膠質細胞及神經元行細胞爬片，0.01 mol/L PBS液清洗后，4%多聚甲醛固定。3%H2O2封閉內源性過氧化物酶，10%山羊血清37℃孵育20 min，分別滴加一抗兔抗大鼠GFAP抗體（1∶1 000）和兔抗大鼠NeuN抗體（1∶800），4℃孵育過夜。滴加二抗TRITC標記的山羊抗兔IgG，37℃孵育30 min，以DAPI對細胞核進行染色，熒光顯微鏡下觀察。星形膠質細胞GFAP染色呈紅色；神經元NeuN染色呈紅色，細胞核呈藍色。
1.3 體外模擬缺氧缺血方法
參照文獻[9]方法，以氧葡萄糖剝奪體外模擬缺氧缺血。將細胞培養基更換為無糖DMEM培養基，細胞置入通混合氣（5%CO2、95%N2）的缺氧裝置中。6 h后更換為原培養液，并以正常條件繼續培養，模擬復氧。
1.4 星形膠質細胞與神經元共培養方法
取神經元（下層細胞）以細胞密度1 ×106個/mL接種于6孔板，加入含2%B27的Nurobasal培養基培養。5 d后在6孔板中置入插入式細胞培養器，以細胞密度1 ×106 個 /mL在培養皿上接種星形膠質細胞（上層細胞）。上、下層細胞共用培養液（含20%FBS、10%馬血清的H-DMEM培養基），下層細胞培養液達4 mL以上，上層細胞達2 mL以上，置于37℃、5%CO2及飽和濕度培養箱中繼續培養。
1.5 觀測指標
1.5.1 缺氧缺血對星形膠質細胞中整合素β8
mRNA表達的影響根據大鼠整合素β8基因序列合成引物：上游引物，5'-CTGGGTATTTTCACTTGTTCT-3'；下游引物，5'-CAGTATCACAACGTTCACTT-3'。取體外模擬缺氧缺血培養復氧后12 h、1 d、2 d星形膠質細胞（實驗組）以及正常星形膠質細胞（對照組），提取細胞總RNA，合成cDNA。參照RT-PCR試劑盒說明擴增目的基因cDNA片段。反應條件：94℃預變性4 min，94℃變性45 s，55℃復性45 s，72℃延伸45 s，38個循環。2%瓊脂糖凝膠電泳，Gel-pro凝膠成像分析軟件測定條帶積分吸光度（IA）值，以β-actin為內參。實驗重復5次，取均值。
1.5.2 感染整合素β8
siRNA對星形膠質細胞中整合素β8 mRNA表達的影響根據整合素β8基因序列設計19個核苷酸的siRNA靶序列GCATCAATGCA-CAATAATA，同時設計對照序列。采用pSicoR載體構建慢病毒載體，轉染T293細胞獲得病毒上清。取正常星形膠質細胞接種于6孔板，待細胞約80%融合后，加入病毒上清（感染復數=10）。收集感染后1、2、3 d的細胞（實驗組），檢測整合素β8 mRNA表達。以正常星形膠質細胞作為正常對照組，對照siRNA感染的星形膠質細胞作為對照組。檢測結果以與正常對照組比較的百分比表示。設計整合素β8 TaqMan探針為：5'-FAM-CCTCTTGAACACACCATCCAC-TAMRA-3'，實驗方法及條件同1.5.1。
1.5.3 TUNEL染色法檢測神經元凋亡
于6孔板中置入細胞培養爬片并接種神經元，根據處理方式不同分為4組。對照組：正常神經元；單純缺氧缺血組：取正常神經元行體外模擬缺氧缺血處理，復氧后1 d收集細胞；共培養缺氧缺血組：取正常神經元及星形膠質細胞共培養，同時行缺氧缺血處理，復氧后1 d收集細胞；β8 RNA干擾組：取1.5.2中經整合素β8 siRNA感染后2 d的星形膠質細胞，與正常神經元共培養，同時行缺氧缺血處理，復氧后1 d收集細胞。按TUNEL原位細胞凋亡檢測試劑盒說明進行操作。取各組神經元細胞爬片，PBS液清洗，4%冰凍甲醛固定30 min，滴加TUNEL反應液37℃孵育1 h，PBS清洗，滴加辣根過氧化物酶標記液，DAB顯色試劑盒顯色，蘇木素復染，透明，封片。光鏡下觀察細胞核呈棕黃色染色為凋亡細胞，每組取6張切片，每張切片取5個以上高倍視野（× 400），計算凋亡指數（apoptotic index，AI）。AI=凋亡細胞數/細胞總數 ×100%，取均值。
1.6 統計學方法
采用SPSS10.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 細胞形態觀察及純度鑒定
星形膠質細胞培養15 d后，光鏡下可見細胞具有大量圍繞胞體的足突，呈星狀分布。神經元培養7 d后，呈圓形、橢圓形或錐形，表面光滑，折光性強，突起相連呈網絡樣生長。見圖 1。
圖1
細胞形態觀察 ? 星形膠質細胞培養15 d（× 400） ? 神經元培養7 d（× 400） ? ?熒光顯微鏡下觀察示，星形膠質細胞GFAP染色呈陽性，著色定位于細胞質；神經元NeuN染色呈陽性，主要分布于細胞核及核周，細胞質亦有顆粒狀陽性表達；陽性率均達90%以上。見圖 2。
2.2 缺氧缺血對星形膠質細胞中整合素β8 mRNA表達的影響
與對照組（11.29 ± 0.75）比較，實驗組復氧后12 h整合素β8 mRNA表達為（18.92 ± 0.55），顯著增加，復氧后1 d達峰值（30.26 ± 0.52），之后緩慢下降，復氧后2 d仍維持較高水平（24.67 ± 0.41）；各時間點實驗組與對照組間比較及實驗組復氧后各時間點間比較，差異均有統計學意義（P＜ 0.05）。見圖 3。
2.3 感染整合素β8 siRNA對星形膠質細胞中整合素β8 mRNA表達的影響
與正常對照組相比，實驗組星形膠質細胞感染整合素β8 siRNA后1 d，其整合素β8 mRNA表達水平顯著下降，2 d時降至最低值，3 d時仍較低，差異均有統計學意義（P＜ 0.05）。對照組與正常對照組比較，差異無統計學意義（P＞ 0.05）；且顯著高于實驗組各時間點，比較差異均有統計學意義（P＜ 0.05）。見圖 4。
2.4 TUNEL染色法檢測神經元凋亡
對照組偶見神經元發生凋亡，AI為2% ± 0%。單純缺氧缺血組、共培養缺氧缺血組及β8 RNA干擾組凋亡神經元明顯增多；AI分別為60% ± 10%、40% ± 5%及50% ± 3%，與對照組比較差異均有統計學意義（P＜ 0.05）。共培養缺氧缺血組及β8 RNA干擾組AI明顯低于單純缺氧缺血組，共培養缺氧缺血組低于β8 RNA干擾組，差異均有統計學意義（P＜ 0.05）。見圖 5。
3 討論
整合素是位于細胞表面的一類糖蛋白，由α和β兩種亞基通過非共價鍵組成，是細胞表面重要的兼具黏附和信號傳導功能的受體[10-12]。整合素β8亞基是星形膠質細胞表達的主要整合素之一，在中樞神經系統中僅能與αv亞基專一配對形成異二聚體[13]。目前對整合素β8的研究主要針對其在胚胎期對血管發育的作用，提示其與中樞神經系統血管發育密切相關[14-16]。中樞神經系統缺氧缺血性損傷后，整合素β8的表達變化及是否參與損傷后修復研究甚少。本研究結果顯示，缺氧缺血后星形膠質細胞中整合素β8 mRNA表達明顯增高，復氧后1 d達高峰，復氧后2 d仍維持較高水平，提示整合素β8 可能參與了缺氧缺血后一系列級聯反應。此外，我們既往已成功利用慢病毒載體建立了RNA干擾系統特異性阻斷整合素β8表達[6]。本次研究以整合素β8 siRNA感染星形膠質細胞，2 d后細胞整合素β8 mRNA表達僅達正常對照組的22%左右，成功建立了整合素β8基因沉默的星形膠質細胞模型。
傳統混合共培養模式是將兩種細胞先后接種于同一生長平面上，保證細胞大量接觸。本研究則利用插入式細胞培養器，建立了體外星形膠質細胞與神經元共培養體系。該共培養體系中，允許生物大分子及培養基在膜兩邊自由流動但隔離細胞，由于星形膠質細胞和神經元并不能直接接觸，故該培養體系不能完全模擬體內環境，是體外研究受限之處。但我們認為與傳統混合共同培養模式相比，該共培養體系具有以下優點：① 其為三維細胞培養體系，上、下層細胞可在相對獨立環境中生長，可以分別收集細胞進行研究，避免了在分析檢測過程中其他因素的影響；② 上、下層細胞共用培養基，便于研究可溶性物質通過旁分泌途徑對細胞生物學特性的影響；③ 模擬了“內環境”，更符合體內條件下各細胞間的交通。本研究旨在探討星形膠質細胞在缺氧缺血下分泌的細胞因子對神經元的調控作用，因此該共培養體系雖不可完全模擬體內環境，尚能滿足本實驗要求。
TUNEL染色是一種經典而特異的檢測細胞凋亡方法，本研究檢測發現，正常神經元極少發生凋亡，缺氧缺血并復氧1 d后，單純缺氧缺血組AI明顯增高，共培養缺氧缺血組顯著低于單純缺氧缺血組；β8 RNA干擾組AI較未阻斷時增高，但仍低于單純缺氧缺血組。提示缺氧缺血后，星形膠質細胞高表達的整合素β8可在一定程度上減輕神經元凋亡的發生，其機制可能與整合素β8依賴的TGF-β1活化相關。我們既往及其他相關研究結果均提示，星形膠質細胞表達的整合素β8是中樞神經系統中TGF-β1活化的關鍵調控因素[6, 17]。TGF-β1是一種在中樞神經系統中廣泛分布的細胞因子，對中樞神經系統正常功能的維持、神經細胞的分化凋亡及損傷后修復等方面具有重要作用[18-20]。在缺氧、興奮性毒性及代謝性損傷模型中，TGF-β1已被證實對體外培養的神經元具有保護作用[21-22]。而TGF-β1介導的神經元保護作用與其上調抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xL有關，研究發現活化的TGF-β1可激活NF-κB，激活下游ALK1/Smad1/5信號通路，從而上調抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xL表達，降低神經元凋亡水平[23]。
綜上述，本研究表明在缺氧缺血時，星形膠質細胞整合素β8表達增高，神經元凋亡率下降，對受損神經元具有明顯保護作用。而整合素β8/TGF-β1信號通路在神經元存活中可能起重要作用，有望成為缺氧缺血性腦損傷干預治療的一個新靶點。
