引用本文： 曹飛, 康小紅, 王立芳. 華蟾酥毒基對人骨肉瘤細胞U-2OS凋亡的影響及作用機制研究. 中國修復重建外科雜志, 2014, 28(3): 349-353. doi: 10.7507/1002-1892.20140078 復制
骨肉瘤是臨床最常見的原發性惡性骨腫瘤，好發于兒童和青少年 [1]，具有惡性程度高、轉移早、預后差等特點。因骨肉瘤對放療不敏感，故以手術和化療為主要治療手段。隨著新輔助化療的發展，局部骨肉瘤患者總生存率由10%提高至70%[2-3]，但化療藥物的毒副作用以及腫瘤細胞的耐藥性嚴重影響了治療效果[4-5]。因此尋求低毒高效的新型抗腫瘤藥物對骨肉瘤的治療具有重要意義。
華蟾酥毒基是中藥蟾皮和蟾酥的主要活性成分之一，具有較強的抗腫瘤活性。研究發現，華蟾酥毒基可誘導多種腫瘤細胞凋亡[6-8]，但其對骨肉瘤細胞的作用研究較少。為此，本研究通過觀察華蟾酥毒基對人骨肉瘤細胞U-2OS凋亡的影響，探討其誘導骨肉瘤細胞凋亡的可能性及作用機制。
1 材料與方法
1.1 主要試劑及儀器
人骨肉瘤細胞株U-2OS購于美國物種保存中心。華蟾酥毒基、DMSO、MTT（Sigma公司，美國）；DMEM、FBS（GIBCO公司，美國）；Annexin V-FITC/ PI凋亡檢測試劑盒（BD公司，美國）；泛半胱氨酸蛋白酶（Caspase）抑制劑Z-VAD-FMK（EnZo公司，美國）；Caspase-3活性檢測試劑盒、BCA分析試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；Western blot檢測用抗體cleaved Caspase-3、cleaved Caspase-9、Bcl-2、Bax（CST公司，美國）。華蟾酥毒基用無水乙醇配成濃度為1 × 10-2 mol/L的儲備液，-20℃保存；使用前采用細胞培養液（含10%FBS及100 U/mL青、鏈霉素的DMEM）配置成濃度為10、20、50、100、200、400 nmol/L的溶液。
培養箱（SANYO公司，日本）；酶聯免疫檢測儀（MD公司，美國）；cell quest軟件、流式細胞儀（BD公司，美國）；凝膠圖像分析軟件（Bio-Rad公司，美國）。
1.2 實驗方法
1.2.1 細胞培養
取人骨肉瘤細胞株U-2OS，置于含10%FBS及100 U/mL青、鏈霉素的DMEM培養基，于37℃、5%CO2及飽和濕度培養箱中培養。
1.2.2 MTT法檢測細胞增殖
取對數生長期U-2OS細胞，以離心半徑13.5 cm、1 000 r/min離心5 min，棄上清；取細胞培養液制成的細胞懸液，調整細胞濃度為2 ×104個/mL，接種于96孔板，每孔100 μL。置于37℃、5%CO2及飽和濕度培養箱培養24 h后，加入終濃度為10、20、50、100、200、400 nmol/L的華蟾酥毒基（分別為10、20、50、100、200、400 nmol/L組），以單純U-2OS細胞作為對照組；每組設5個復孔。培養24、48、72 h后，每孔加入20 μL MTT（5 mg/mL），培養箱中繼續培養4 h后棄上清，每孔加入150 μL DMSO，振蕩后酶聯免疫檢測儀于490 nm波長處測定吸光度（A）值，按照以下公式計算細胞存活率：細胞存活率＝[濃度組A值－調零孔A值] /（對照組A值－調零孔A值） ×100%。實驗重復3次，取均值。
1.2.3 流式細胞儀檢測細胞凋亡
取對數生長期U-2OS細胞，以5 ×104個/mL細胞濃度接種于6孔板，每孔2 mL。置于37℃、5%CO2及飽和濕度培養箱培養24 h后，分別用100 nmol/L華蟾酥毒基（實驗組）及100 nmol/L華蟾酥毒基聯合50 μmol/L Z-VAD-FMK（對照組）處理48 h，以單純U-2OS細胞作為空白對照組，每組設3個復孔。棄培養液，用0.25%胰蛋白酶消化，以離心半徑13.5 cm、800 r/min離心5 min，PBS洗滌2次。按照Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒說明書操作，采用流式細胞儀觀察細胞凋亡情況，應用cell quest軟件自動計算細胞凋亡率。實驗重復3次，取均 值。
1.2.4 比色法檢測細胞內Caspase-3活性
取對數生長期U-2OS細胞，以2 ×104個/mL細胞濃度接種于96孔板，每孔100 μL。置于37℃、5%CO2及飽和濕度培養箱培養24 h后，分別加入終濃度為20、50、100 nmol/L的華蟾酥毒基（分別為20、50、100 nmol/ L組），以單純U-2OS細胞作為對照組；每組設3個復孔。繼續培養48 h后棄上清，每孔加入預冷的裂解液100 μL，冰上裂解15 min后，以離心半徑13.5 cm、11 000 r/min離心10 min，收集上清。按照Caspase-3活性檢測試劑盒說明書操作，檢測細胞內Caspase-3蛋白活性，采用酶聯免疫檢測儀測定波長為405 nm處的A值，并按照以下公式計算Caspase-3活性：Caspase-3活性=濃度組A值/對照組A值。實驗重復3次，取均值。設對照組Caspase-3活性為1。
1.2.5 Western
blot檢測凋亡通路相關蛋白表達 取對數生長期U-2OS細胞，以5 ×104個/mL細胞濃度接種于6孔板中，每孔2 mL。置于37℃、5%CO2及飽和濕度培養箱培養24 h后，加入終濃度為20、50、100 nmol/L的華蟾酥毒基（分別為20、50、100 nmol/ L組），以單純U-2OS細胞作為對照組。培養48 h后棄上清，用預冷的PBS沖洗3次，加入蛋白裂解液，冰上裂解1 h；于4℃，以離心半徑13.5 cm、12 000 r/min離心15 min，取上清，用BCA分析試劑盒測定蛋白濃度；取50 μg蛋白質行SDS-PAGE電泳分離，半干法轉移至聚偏氟乙烯膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入一抗（cleaved Caspase-3、cleaved Caspase-9、Bcl-2、Bax）4℃過夜；TBST洗膜3次，加入二抗室溫孵育2 h；TBST洗膜3次，加入ECL發光液暗室中X線片顯影，圖像掃描，以β-actin為內參照，應用凝膠圖像分析軟件分析各目標條帶灰度值，并計算Bax/Bcl-2比值。實驗重復3次，取均值。
1.3 統計學方法
采用SPSS18.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 華蟾酥毒基對U-2OS細胞增殖的影響
MTT法檢測示，同一時間點不同濃度華蟾酥毒基作用于U-2OS細胞后，細胞存活率隨濃度增加而顯著減少，組間比較差異均有統計學意義（P＜ 0.05）；同一濃度組中，細胞存活率隨時間延長亦顯著下降，比較差異均有統計學意義（P＜ 0.05）。見圖 1。
圖1
各時間點各組細胞存活率
Figure1.
The growth rate of U-2OS cells in different groups at each time point
2.2 華蟾酥毒基對U-2OS細胞凋亡的影響
實驗組細胞凋亡率為46.87% ± 11.23%，顯著高于對照組的2.34% ± 0.98%及空白對照組的1.04% ± 0.25%，比較差異均有統計學意義（P＜ 0.05）；對照組與空白對照組比較，差異無統計學意義（P＞ 0.05）。見圖 2。
圖2
流式細胞儀檢測各組細胞凋亡情況 ? 空白對照組 ? 實驗組 ? 對照組 ? ?2.3 華蟾酥毒基對U-2OS細胞Caspase-3活性的影響
20、50、100 nmol/L組Caspase-3活性分別為1.14 ± 0.32、1.31 ± 0.41、1.92 ± 0.54，與對照組比較，差異均有統計學意義（P＜ 0.05）；100 nmol/L組與20、50 nmol/L組比較，差異有統計學意義（P＜ 0.05）；20 nmol/L組與50 nmol/L組間差異無統計學意義（P＞ 0.05）。
2.4 華蟾酥毒基對U-2OS細胞凋亡通路相關蛋白表達的影響
與對照組相比，各濃度組促凋亡蛋白cleaved Caspase-3、cleaved Caspase-9、Bax均顯著上調，抗凋亡蛋白Bcl-2下調，Bax/Bcl-2提高，差異均有統計學意義（P＜ 0.05）。各濃度組間比較，隨著濃度增加也呈相同變化趨勢，組間比較差異均有統計學意義（P＜ 0.05）。見圖 3、表 1。
表1
各組U-2OS細胞凋亡通路相關蛋白表達比較（n=3，3 討論
華蟾酥毒基是從中藥蟾皮、蟾酥中提取的蟾毒內酯類物質，具有顯著的抗腫瘤活性。但有關華蟾酥毒基對骨肉瘤細胞作用的研究較少。本研究中MTT法檢測示，華蟾酥毒基作用于U-2OS細胞后，細胞存活率隨濃度增加而顯著降低，同一濃度中細胞存活率隨時間延長亦顯著下降，差異均有統計學意義，提示華蟾酥毒基以時間、濃度依賴方式抑制U-2OS細胞增殖。Caspase-3活性檢測示，濃度為20、50、100 nmol/ L的華蟾酥毒基均能提高U-2OS細胞內Caspase-3活性，且隨濃度增加Caspase-3活性呈增高趨勢。流式細胞儀檢測顯示，華蟾酥毒基能促進U-2OS細胞凋亡，而泛Caspase抑制劑Z-VAD-FMK能抑制華蟾酥毒基對U-2OS細胞的促凋亡作用，提示華蟾酥毒基誘導U-2OS細胞凋亡具有Caspase依賴性。
細胞凋亡是機體為了維持內環境穩定，更好地適應生存環境而發生的細胞主動性死亡模式，是調節生物體正常生長發育不可缺少的自穩機制[9-10]。由于腫瘤的發生、發展與細胞凋亡功能失調密切相關[11]，因此基于細胞凋亡機制的抗腫瘤藥物研發是近年來新型抗腫瘤藥物開發的主要研究方向[12]。經典的細胞凋亡過程包括死亡受體途徑和線粒體途徑，二者均依賴Caspase級聯反應來誘導細胞凋亡[13]。在死亡受體途徑中，Fas配體FasL/TNF/TRAIL與其受體結合，FADD（胞漿死亡信號銜接蛋白）使Caspase-8自身催化裂解，直接或間接激活Caspase-3引起細胞凋亡[14]。在線粒體途徑中，線粒體釋放的細胞色素C能與Apaf-1及Caspase-9形成復合體，在三磷酸脫氧腺苷、三磷酸腺苷存在下激活Caspase-3，啟動Caspase級聯反應，誘導細胞凋亡[15]。線粒體途徑主要由Bcl-2家族蛋白調控，Bcl-2家族中的抗凋亡蛋白（如Bcl-2、Bcl-xL、Mcl-1等）和促凋亡蛋白（Bax、Bak、Bad等）相互作用，調控線粒體結構和功能的穩定性，二者比值決定著細胞的生存或死亡[16-17]。Bcl-2、Bax是Caspase-3上游信號分子，其比值決定細胞是否進入凋亡的執行階段[18]。
既往研究發現，華蟾酥毒基誘導肝癌、前列腺癌等多種腫瘤細胞凋亡的機制與線粒體介導的凋亡途徑有關[7, 19]，而華蟾酥毒基是否也通過線粒體途徑來誘導U-2OS細胞凋亡，目前報道較少。本研究應用Western blot檢測了線粒體途徑中cleaved Caspase-3、cleaved Caspase-9、Bcl-2及Bax相關蛋白表達，結果顯示，不同濃度的華蟾酥毒基均可上調促凋亡蛋白cleaved Caspase-3、cleaved Caspase-9、Bax表達，下調抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，提高Bax與Bcl-2的比值，且隨濃度增加，華蟾酥毒基對這些蛋白的調控作用不斷增強，提示線粒體途徑可能是華蟾酥毒基誘導骨肉瘤細胞凋亡的機制。
綜上述，華蟾酥毒基可抑制U-2OS細胞增殖，誘導其凋亡，機制可能與線粒體途徑有關，為華蟾酥毒基治療骨肉瘤的臨床應用提供了初步的實驗依據。而死亡受體途徑也依賴于Caspase級聯反應，華蟾酥毒基是否也通過死亡受體途徑誘導骨肉瘤細胞凋亡，還有待于進一步研究。
骨肉瘤是臨床最常見的原發性惡性骨腫瘤，好發于兒童和青少年 [1]，具有惡性程度高、轉移早、預后差等特點。因骨肉瘤對放療不敏感，故以手術和化療為主要治療手段。隨著新輔助化療的發展，局部骨肉瘤患者總生存率由10%提高至70%[2-3]，但化療藥物的毒副作用以及腫瘤細胞的耐藥性嚴重影響了治療效果[4-5]。因此尋求低毒高效的新型抗腫瘤藥物對骨肉瘤的治療具有重要意義。
華蟾酥毒基是中藥蟾皮和蟾酥的主要活性成分之一，具有較強的抗腫瘤活性。研究發現，華蟾酥毒基可誘導多種腫瘤細胞凋亡[6-8]，但其對骨肉瘤細胞的作用研究較少。為此，本研究通過觀察華蟾酥毒基對人骨肉瘤細胞U-2OS凋亡的影響，探討其誘導骨肉瘤細胞凋亡的可能性及作用機制。
1 材料與方法
1.1 主要試劑及儀器
人骨肉瘤細胞株U-2OS購于美國物種保存中心。華蟾酥毒基、DMSO、MTT（Sigma公司，美國）；DMEM、FBS（GIBCO公司，美國）；Annexin V-FITC/ PI凋亡檢測試劑盒（BD公司，美國）；泛半胱氨酸蛋白酶（Caspase）抑制劑Z-VAD-FMK（EnZo公司，美國）；Caspase-3活性檢測試劑盒、BCA分析試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；Western blot檢測用抗體cleaved Caspase-3、cleaved Caspase-9、Bcl-2、Bax（CST公司，美國）。華蟾酥毒基用無水乙醇配成濃度為1 × 10-2 mol/L的儲備液，-20℃保存；使用前采用細胞培養液（含10%FBS及100 U/mL青、鏈霉素的DMEM）配置成濃度為10、20、50、100、200、400 nmol/L的溶液。
培養箱（SANYO公司，日本）；酶聯免疫檢測儀（MD公司，美國）；cell quest軟件、流式細胞儀（BD公司，美國）；凝膠圖像分析軟件（Bio-Rad公司，美國）。
1.2 實驗方法
1.2.1 細胞培養
取人骨肉瘤細胞株U-2OS，置于含10%FBS及100 U/mL青、鏈霉素的DMEM培養基，于37℃、5%CO2及飽和濕度培養箱中培養。
1.2.2 MTT法檢測細胞增殖
取對數生長期U-2OS細胞，以離心半徑13.5 cm、1 000 r/min離心5 min，棄上清；取細胞培養液制成的細胞懸液，調整細胞濃度為2 ×104個/mL，接種于96孔板，每孔100 μL。置于37℃、5%CO2及飽和濕度培養箱培養24 h后，加入終濃度為10、20、50、100、200、400 nmol/L的華蟾酥毒基（分別為10、20、50、100、200、400 nmol/L組），以單純U-2OS細胞作為對照組；每組設5個復孔。培養24、48、72 h后，每孔加入20 μL MTT（5 mg/mL），培養箱中繼續培養4 h后棄上清，每孔加入150 μL DMSO，振蕩后酶聯免疫檢測儀于490 nm波長處測定吸光度（A）值，按照以下公式計算細胞存活率：細胞存活率＝[濃度組A值－調零孔A值] /（對照組A值－調零孔A值） ×100%。實驗重復3次，取均值。
1.2.3 流式細胞儀檢測細胞凋亡
取對數生長期U-2OS細胞，以5 ×104個/mL細胞濃度接種于6孔板，每孔2 mL。置于37℃、5%CO2及飽和濕度培養箱培養24 h后，分別用100 nmol/L華蟾酥毒基（實驗組）及100 nmol/L華蟾酥毒基聯合50 μmol/L Z-VAD-FMK（對照組）處理48 h，以單純U-2OS細胞作為空白對照組，每組設3個復孔。棄培養液，用0.25%胰蛋白酶消化，以離心半徑13.5 cm、800 r/min離心5 min，PBS洗滌2次。按照Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒說明書操作，采用流式細胞儀觀察細胞凋亡情況，應用cell quest軟件自動計算細胞凋亡率。實驗重復3次，取均 值。
1.2.4 比色法檢測細胞內Caspase-3活性
取對數生長期U-2OS細胞，以2 ×104個/mL細胞濃度接種于96孔板，每孔100 μL。置于37℃、5%CO2及飽和濕度培養箱培養24 h后，分別加入終濃度為20、50、100 nmol/L的華蟾酥毒基（分別為20、50、100 nmol/ L組），以單純U-2OS細胞作為對照組；每組設3個復孔。繼續培養48 h后棄上清，每孔加入預冷的裂解液100 μL，冰上裂解15 min后，以離心半徑13.5 cm、11 000 r/min離心10 min，收集上清。按照Caspase-3活性檢測試劑盒說明書操作，檢測細胞內Caspase-3蛋白活性，采用酶聯免疫檢測儀測定波長為405 nm處的A值，并按照以下公式計算Caspase-3活性：Caspase-3活性=濃度組A值/對照組A值。實驗重復3次，取均值。設對照組Caspase-3活性為1。
1.2.5 Western
blot檢測凋亡通路相關蛋白表達 取對數生長期U-2OS細胞，以5 ×104個/mL細胞濃度接種于6孔板中，每孔2 mL。置于37℃、5%CO2及飽和濕度培養箱培養24 h后，加入終濃度為20、50、100 nmol/L的華蟾酥毒基（分別為20、50、100 nmol/ L組），以單純U-2OS細胞作為對照組。培養48 h后棄上清，用預冷的PBS沖洗3次，加入蛋白裂解液，冰上裂解1 h；于4℃，以離心半徑13.5 cm、12 000 r/min離心15 min，取上清，用BCA分析試劑盒測定蛋白濃度；取50 μg蛋白質行SDS-PAGE電泳分離，半干法轉移至聚偏氟乙烯膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入一抗（cleaved Caspase-3、cleaved Caspase-9、Bcl-2、Bax）4℃過夜；TBST洗膜3次，加入二抗室溫孵育2 h；TBST洗膜3次，加入ECL發光液暗室中X線片顯影，圖像掃描，以β-actin為內參照，應用凝膠圖像分析軟件分析各目標條帶灰度值，并計算Bax/Bcl-2比值。實驗重復3次，取均值。
1.3 統計學方法
采用SPSS18.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 華蟾酥毒基對U-2OS細胞增殖的影響
MTT法檢測示，同一時間點不同濃度華蟾酥毒基作用于U-2OS細胞后，細胞存活率隨濃度增加而顯著減少，組間比較差異均有統計學意義（P＜ 0.05）；同一濃度組中，細胞存活率隨時間延長亦顯著下降，比較差異均有統計學意義（P＜ 0.05）。見圖 1。
圖1
各時間點各組細胞存活率
Figure1.
The growth rate of U-2OS cells in different groups at each time point
2.2 華蟾酥毒基對U-2OS細胞凋亡的影響
實驗組細胞凋亡率為46.87% ± 11.23%，顯著高于對照組的2.34% ± 0.98%及空白對照組的1.04% ± 0.25%，比較差異均有統計學意義（P＜ 0.05）；對照組與空白對照組比較，差異無統計學意義（P＞ 0.05）。見圖 2。
圖2
流式細胞儀檢測各組細胞凋亡情況 ? 空白對照組 ? 實驗組 ? 對照組 ? ?2.3 華蟾酥毒基對U-2OS細胞Caspase-3活性的影響
20、50、100 nmol/L組Caspase-3活性分別為1.14 ± 0.32、1.31 ± 0.41、1.92 ± 0.54，與對照組比較，差異均有統計學意義（P＜ 0.05）；100 nmol/L組與20、50 nmol/L組比較，差異有統計學意義（P＜ 0.05）；20 nmol/L組與50 nmol/L組間差異無統計學意義（P＞ 0.05）。
2.4 華蟾酥毒基對U-2OS細胞凋亡通路相關蛋白表達的影響
與對照組相比，各濃度組促凋亡蛋白cleaved Caspase-3、cleaved Caspase-9、Bax均顯著上調，抗凋亡蛋白Bcl-2下調，Bax/Bcl-2提高，差異均有統計學意義（P＜ 0.05）。各濃度組間比較，隨著濃度增加也呈相同變化趨勢，組間比較差異均有統計學意義（P＜ 0.05）。見圖 3、表 1。
表1
各組U-2OS細胞凋亡通路相關蛋白表達比較（n=3，3 討論
華蟾酥毒基是從中藥蟾皮、蟾酥中提取的蟾毒內酯類物質，具有顯著的抗腫瘤活性。但有關華蟾酥毒基對骨肉瘤細胞作用的研究較少。本研究中MTT法檢測示，華蟾酥毒基作用于U-2OS細胞后，細胞存活率隨濃度增加而顯著降低，同一濃度中細胞存活率隨時間延長亦顯著下降，差異均有統計學意義，提示華蟾酥毒基以時間、濃度依賴方式抑制U-2OS細胞增殖。Caspase-3活性檢測示，濃度為20、50、100 nmol/ L的華蟾酥毒基均能提高U-2OS細胞內Caspase-3活性，且隨濃度增加Caspase-3活性呈增高趨勢。流式細胞儀檢測顯示，華蟾酥毒基能促進U-2OS細胞凋亡，而泛Caspase抑制劑Z-VAD-FMK能抑制華蟾酥毒基對U-2OS細胞的促凋亡作用，提示華蟾酥毒基誘導U-2OS細胞凋亡具有Caspase依賴性。
細胞凋亡是機體為了維持內環境穩定，更好地適應生存環境而發生的細胞主動性死亡模式，是調節生物體正常生長發育不可缺少的自穩機制[9-10]。由于腫瘤的發生、發展與細胞凋亡功能失調密切相關[11]，因此基于細胞凋亡機制的抗腫瘤藥物研發是近年來新型抗腫瘤藥物開發的主要研究方向[12]。經典的細胞凋亡過程包括死亡受體途徑和線粒體途徑，二者均依賴Caspase級聯反應來誘導細胞凋亡[13]。在死亡受體途徑中，Fas配體FasL/TNF/TRAIL與其受體結合，FADD（胞漿死亡信號銜接蛋白）使Caspase-8自身催化裂解，直接或間接激活Caspase-3引起細胞凋亡[14]。在線粒體途徑中，線粒體釋放的細胞色素C能與Apaf-1及Caspase-9形成復合體，在三磷酸脫氧腺苷、三磷酸腺苷存在下激活Caspase-3，啟動Caspase級聯反應，誘導細胞凋亡[15]。線粒體途徑主要由Bcl-2家族蛋白調控，Bcl-2家族中的抗凋亡蛋白（如Bcl-2、Bcl-xL、Mcl-1等）和促凋亡蛋白（Bax、Bak、Bad等）相互作用，調控線粒體結構和功能的穩定性，二者比值決定著細胞的生存或死亡[16-17]。Bcl-2、Bax是Caspase-3上游信號分子，其比值決定細胞是否進入凋亡的執行階段[18]。
既往研究發現，華蟾酥毒基誘導肝癌、前列腺癌等多種腫瘤細胞凋亡的機制與線粒體介導的凋亡途徑有關[7, 19]，而華蟾酥毒基是否也通過線粒體途徑來誘導U-2OS細胞凋亡，目前報道較少。本研究應用Western blot檢測了線粒體途徑中cleaved Caspase-3、cleaved Caspase-9、Bcl-2及Bax相關蛋白表達，結果顯示，不同濃度的華蟾酥毒基均可上調促凋亡蛋白cleaved Caspase-3、cleaved Caspase-9、Bax表達，下調抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，提高Bax與Bcl-2的比值，且隨濃度增加，華蟾酥毒基對這些蛋白的調控作用不斷增強，提示線粒體途徑可能是華蟾酥毒基誘導骨肉瘤細胞凋亡的機制。
綜上述，華蟾酥毒基可抑制U-2OS細胞增殖，誘導其凋亡，機制可能與線粒體途徑有關，為華蟾酥毒基治療骨肉瘤的臨床應用提供了初步的實驗依據。而死亡受體途徑也依賴于Caspase級聯反應，華蟾酥毒基是否也通過死亡受體途徑誘導骨肉瘤細胞凋亡，還有待于進一步研究。
