引用本文： 湯琦, 袁兵, 黃云超, 郭鳳麗, 雷玉潔. 乳腺外科表皮葡萄球菌icaA、icaD及聚集相關蛋白基因對細菌生物膜形成的影響. 中國修復重建外科雜志, 2014, 28(2): 244-249. doi: 10.7507/1002-1892.20140053 復制
目前，臨床對于因乳腺癌等行乳房切除術后遺留的缺損，常采用硅膠假體重建乳房。感染是假體植入術后主要并發癥，也是導致假體包膜攣縮的重要原因之一[1]。包膜攣縮后需要二次手術切開或切除假體周圍包囊、擴大假體腔隙，甚至去除假體[2]，嚴重影響患者生活質量。表皮葡萄球菌是寄居于皮膚、乳頭、乳腺導管及腺體的條件致病菌[3]，隨著生物材料的廣泛應用，已成為醫院感染的主要致病菌[4]。材料表面細菌生物膜的形成是假體植入后發生感染的關鍵環節[5]，細菌生物膜能保護其內細菌有效抵制機體的防御能力及抗生素的治療[6]。ica操縱子對于表皮葡萄球菌生物膜的形成起到重要作用[7-9]，icaA、B、C、D 4個基因構成1個操縱子，編碼N-乙酰葡糖胺轉移酶，共同完成細菌生物膜形成聚集階段所必需的物質--多糖胞間黏附素（polysac charide interer cellular adhesion，PIA）的合成[10]。其中，icaA和icaD基因聯合表達，可大大提高N-乙酰葡糖胺轉移酶活性，促進PIA的合成[8]。聚集相關蛋白（accumulation-associated protein，aap）作為聚集階段的另一因子，對細菌生物膜形成也發揮關鍵作用。
因此，本實驗通過建立乳腺外科表皮葡萄球菌臨床分離株，檢測表皮葡萄球菌生物膜形成的相關基因icaA、icaD、aap；通過結晶紫染色法半定量黏附實驗檢測硅膠材料表面表皮葡萄球菌黏附量的變化情況；利用激光共聚焦顯微鏡及掃描電鏡觀察細菌生物膜的厚度及超微結構，了解硅膠表面表皮葡萄球菌生物膜的形成能力，為乳腺外科生物材料感染及相關并發癥的防治研究提供參考。
1 材料與方法
1.1 實驗菌株
于2011年12月－2013年1月昆明醫科大學第三附屬醫院乳腺外科收治的無感染癥狀女性患者臨床標本中分離獲得44株表皮葡萄球菌。其中26株來自乳腺導管沖洗液細菌培養，11株來自假體及擴張器包膜細菌培養，7株來自乳腺癌術后胸壁引流管細菌培養。所有菌株均經種屬鑒定為表皮葡萄球菌。
1.2 主要試劑與儀器
擴張器硅膠囊（廣州市萬和整形材料有限公司），制備為0.7 cm × 0.7 cm大小硅膠片，環氧乙烷熏蒸滅菌備用。LB瓊脂平板培養基（鄭州安圖生物工程股份有限公司）；LB液體培養基（北京索萊寶科技有限公司）；細菌基因組DNA提取試劑盒（OMEGA公司，美國）；活/死細菌熒光染色劑（Molecular Probes公司，美國）；結晶紫染液（Sigma公司，美國）；戊二醛（汕頭市達濠區精工化工廠）。紫外分光光度儀（Bio-Rad公司，美國）；激光共聚焦顯微鏡（Olympus公司，日本）；G01-280 全自動高壓消毒鍋（Hiragama公司，日本）；RIDMODEI-3550酶標板自動讀數儀（Biotcck 公司，美 國）。
1.3 實驗分組
1.3.1 PCR檢測icaA、icaD、aap基因表達
取44株表皮葡萄球菌，按照細菌基因組DNA提取試劑盒說明提取表皮葡萄球菌基因組DNA，擴增icaA、icaD、aap基因，以16srRNA基因為內參。各目的基因引物序列、產物長度及退火溫度見表 1。所有引物由上海生工生物工程有限公司設計并合成。PCR循環條件： 95℃、3 min，95℃、30 s，58℃、30 s，72℃、30 s，35個循環；72℃、5 min。擴增后取2 μL反應產物經2%瓊脂糖凝膠電泳檢測目的基因表達。
表1
各目的基因引物序列、產物長度及退火溫度
Table1.
The primer sequences length of product,and annealing temperature of target genes
1.3.2 分組方法
根據icaA、icaD、aap基因表達結果，將44株表皮葡萄球菌分為icaA+icaD+/aap+組（A組）、icaA+icaD+/aap-組（B組）、icaA-icaD-/aap+組（C組）及icaA-icaD-/aap-組（D組）。
1.4 硅膠材料表面細菌生物膜體外模型制備
將4組表皮葡萄球菌分別接種于LB瓊脂平板培養基，37℃培養24 h，獲得單個菌落。取單個菌落接種于LB液體培養基中，37℃震蕩培養16 h，獲得純種菌液。紫外分光光度儀檢測并調整細菌濃度為1 ×107 CFU/mL。取無菌24孔板，每孔放入1塊硅膠材料以及400 μL細菌菌液，37℃溫箱孵育，制備硅膠材料表面細菌生物膜體外模型。
1.5 觀測指標
1.5.1 半定量法檢測細菌黏附能力
于孵育8、12、24、30、36 h取4組硅膠片，4℃無菌PBS清洗去除硅膠片上的浮游菌，結晶紫染液染色30 min，PBS漂洗后加入DMSO脫色15 min。脫色液采用紫外分光光度儀于波長490 nm處測定吸光度（A）值，A值大小反映細菌黏附能力強弱；計算與空白對照濾膜脫色液A值的差值，差值＞ 0.12的菌株為生物膜形成陽性[11]。以培養時間為x軸，A值為y軸，繪制細菌生長曲線。
1.5.2 激光共聚焦顯微鏡觀測硅膠片表面細菌生物膜
厚度 于孵育12、24 h取4組硅膠片，PBS沖洗3次，加入活/死細菌熒光染色劑，常溫下避光染色20 min，PBS沖洗。在氬激光（514 nm/488 nm）條件下，激光共聚焦顯微鏡觀察。于200倍鏡下，每個硅膠片隨機取10個視野，每個視野隨機取1個細菌生物膜測量其厚度，由內（細菌生物膜與硅膠材料相貼的一面）向外逐層掃描，均為20層，步距為1 μm；取均值。
1.5.3 掃描電鏡觀察硅膠片表面細菌生物膜超微結構
于孵育24 h取4組硅膠片，2%戊二酸固定，梯度乙醇脫水，CO2臨界干燥，離子濺射硅膠片表面成金黃色，掃描電鏡下觀察硅膠片表面細菌生物膜情況。
1.6 統計學方法
采用SPSS17.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組內比較采用t檢驗；組間比較采用方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 icaA、icaD、aap基因表達檢測
PCR檢測結果示，44株表皮葡萄球菌中，13株為icaA+icaD+/aap+（A組），12株為icaA+icaD+/aap-（B組），16株為icaA-icaD-/aap+（C組），3株為icaA-icaD-/aap-（D組）。
2.2 半定量法檢測
孵育8 h，4組細菌黏附能力比較差異無統計學意義（P＞ 0.05）。12 h開始，A、B、C組細菌黏附能力均隨時間延長逐漸上升，24 h達高峰，組內8、12、24 h間比較差異均有統計學意義（P＜ 0.05）；之后呈下降趨勢，除A組30 h及36 h間比較差異有統計學意義（P＜ 0.05）外，其余各組24 h后各時間點間比較差異均無統計學意義（P＞ 0.05）。D組組內各時間點間細菌黏附能力無顯著變化，比較差異無統計學意義（P＞ 0.05）。12～36 h時，A、B、C組細菌黏附能力均顯著高于D組，A組顯著高于B、C組，差異均有統計學意義（P＜ 0.05）；B、C組間比較，差異均無統計學意義（P＞ 0.05）。見圖 1。
圖1
各組細菌生長曲線
Figure1.
Growth curves of Staphylococcus epidermidis isolated in 4 groups
實驗期間44株表皮葡萄球菌臨床分離株中，29株（65.9%）細菌生物膜形成陽性，其中A組13株，B組7株，C組9株，D組0株。
2.3 激光共聚焦顯微鏡觀測
12、24 h時A、B、C組細菌生物膜厚度均大于D組，A組明顯大于B、C組，比較差異均有統計學意義（P＜ 0.05）；B、C組間比較差異無統計學意義（P＞ 0.05）。A、B、C組組內24 h細菌生物膜厚度均較12 h增加，比較差異有統計學意義（P＜ 0.05）；D組組內兩時間點間差異無統計學意義（t=-0.802，P=0.468）。見表 2、圖 2。
表2
各組各時間點細菌生物膜厚度比較（μm，
圖2
各時間點各組激光共聚焦顯微鏡觀察（× 600） ? A組12 h ? B組12 h ? C組12 h ? D組12 h ? A組24 h ? B組24 h ? C組24 h ? D組24 h ? ?2.4 掃描電鏡觀察
孵育24 h時A、B、C組硅膠片表面均可見高度組織化多細胞群體結構，即為成熟的細菌生物膜結構；其中A組細菌生物膜分布最廣泛、結構最致密、層次最豐富，B、C組細菌生物膜結構相似。D組僅見少量散在細菌，無明顯細菌生物膜形成。見圖 3。
3 討論
我們前期實驗結果提示ica操縱子中，icaA、icaD基因為聯合表達的關系[12]。icaA基因單獨表達時N-乙酰葡糖胺轉移酶活性低，icaA和icaD基因共表達時該酶活性大大提高，合成最大鏈長達20 個殘基的寡聚物。由于icaA及icaD基因的聯合表達是促進PIA合成最重要的環節，因此icaA、icaD基因對表皮葡萄球菌生物膜的形成起重要作用。本實驗中的44株表皮葡萄球菌臨床分離株中，25株為icaA、icaD基因聯合表達的菌株（A、B組），其中有20株在硅膠材料表面形成了細菌生物膜，提示icaA+icaD+與細菌生物膜形成密切相關。
ica編碼的PIA在表皮葡萄球菌生物膜形成中具有重要作用，但有研究表明ica基因陰性的表皮葡萄球菌可以不依賴PIA，通過細菌表面蛋白直接作用形成蛋白依賴的細菌生物膜，該表面蛋白就是由聚集相關蛋白基因編碼的aap[13]。有學者分離獲得人工全髖、膝關節置換術后人工關節感染的葡萄球菌株，發現感染中PIA和aap分別起作用，可見PIA介導和aap蛋白介導均可形成細菌生物膜[14]。本實驗中aap基因陽性株為29株（A、C組），其中細菌生物膜形成陽性22株，而D組3株icaA-icaD-/aap-菌株均不能形成細菌生物膜。結果表明，aap是聚集階段另一個對細菌生物膜形成發揮關鍵作用的基因，可作為促進細菌生物膜形成的獨立因素。
目前，關于aap基因促進細菌生物膜形成的作用機制尚未明確，綜合相關研究可能與以下方面有關。aap包含A末端結構域和B重復結構域，A末端結構域為B重復結構域的裂解，可促使細菌在細菌生物膜形成初期的相互黏附，B重復結構域可以增強其黏附功能[15]。B重復結構域中的重復序列被定為G5結構域。它是一個由5個重復的氨基乙酸殘基組成的蛋白質保守結構域，呈Zn2+依賴性[16]，可通過Zn2+依賴的D-二聚體實現細菌間直接黏附功能[17]。溶解包括G5結構域的aap片段可以阻斷表皮葡萄球菌生物膜的形成[18]。此外，G5結構域能被N-乙酰氨基葡萄糖所識別，與N-乙酰氨基葡萄糖相結合后與PIA相互作用，進一步提高PIA介導細胞間黏附的能力并促進細菌生物膜的形成[19]。
Stevens等[20]報道將分離的55株腦膜炎患者表皮葡萄球菌菌株，通過剛果紅實驗證實ica+/aap+菌株促進細菌生物膜形成能力較強。我們的實驗利用半定量法繪制生長曲線、激光共聚焦顯微鏡測量細菌生物膜厚度以及掃描電鏡觀察細菌生物膜結構，結果也發現44株表皮葡萄球菌株中，A組13株菌株均形成了細菌生物膜；從生長曲線可見，A組孵育12～24 h時A 值上升最明顯，且顯著高于B、C組。激光共聚焦顯微鏡及掃描電鏡觀察示，硅膠表面的細菌生物膜厚度增加與時間變化有關，各組24 h時細菌生物膜厚度均較12 h時增加，其中A組的細菌生物膜厚度及其結構變化均明顯大于B、C組。A組菌株在硅膠表面可見大量明顯多于其他組菌株的結構致密、高度組織化多細胞群體結構，即成熟的細菌生物膜結構。而B、C組菌株生物膜形成能力、生物膜厚度及生物膜結構均無明顯差異，提示兩組菌株細菌生物膜形成能力基本相同。D組菌株各時間點基本無變化，表明該表型的細菌黏附能力差，激光共聚焦顯微鏡及掃描電鏡也提示硅膠材料表面無明顯細菌生物膜形成。
由此可見icaA、icaD及aap基因對于表皮葡萄球菌生物膜形成均起重要作用；3種方法檢測細菌生物膜形成能力結果提示，icaA、icaD基因與aap基因對于細菌生物膜形成能力的影響無明顯差異。當細菌同時表達icaA、icaD及aap基因時，由于ica是合成PIA的基礎，aap包含的G5結構域能與N-乙酰氨基葡萄糖相結合，與PIA相互作用，故能進一步提高PIA介導細胞間黏附的能力，從而促進細菌生物膜的形成。
目前，臨床對于因乳腺癌等行乳房切除術后遺留的缺損，常采用硅膠假體重建乳房。感染是假體植入術后主要并發癥，也是導致假體包膜攣縮的重要原因之一[1]。包膜攣縮后需要二次手術切開或切除假體周圍包囊、擴大假體腔隙，甚至去除假體[2]，嚴重影響患者生活質量。表皮葡萄球菌是寄居于皮膚、乳頭、乳腺導管及腺體的條件致病菌[3]，隨著生物材料的廣泛應用，已成為醫院感染的主要致病菌[4]。材料表面細菌生物膜的形成是假體植入后發生感染的關鍵環節[5]，細菌生物膜能保護其內細菌有效抵制機體的防御能力及抗生素的治療[6]。ica操縱子對于表皮葡萄球菌生物膜的形成起到重要作用[7-9]，icaA、B、C、D 4個基因構成1個操縱子，編碼N-乙酰葡糖胺轉移酶，共同完成細菌生物膜形成聚集階段所必需的物質--多糖胞間黏附素（polysac charide interer cellular adhesion，PIA）的合成[10]。其中，icaA和icaD基因聯合表達，可大大提高N-乙酰葡糖胺轉移酶活性，促進PIA的合成[8]。聚集相關蛋白（accumulation-associated protein，aap）作為聚集階段的另一因子，對細菌生物膜形成也發揮關鍵作用。
因此，本實驗通過建立乳腺外科表皮葡萄球菌臨床分離株，檢測表皮葡萄球菌生物膜形成的相關基因icaA、icaD、aap；通過結晶紫染色法半定量黏附實驗檢測硅膠材料表面表皮葡萄球菌黏附量的變化情況；利用激光共聚焦顯微鏡及掃描電鏡觀察細菌生物膜的厚度及超微結構，了解硅膠表面表皮葡萄球菌生物膜的形成能力，為乳腺外科生物材料感染及相關并發癥的防治研究提供參考。
1 材料與方法
1.1 實驗菌株
于2011年12月－2013年1月昆明醫科大學第三附屬醫院乳腺外科收治的無感染癥狀女性患者臨床標本中分離獲得44株表皮葡萄球菌。其中26株來自乳腺導管沖洗液細菌培養，11株來自假體及擴張器包膜細菌培養，7株來自乳腺癌術后胸壁引流管細菌培養。所有菌株均經種屬鑒定為表皮葡萄球菌。
1.2 主要試劑與儀器
擴張器硅膠囊（廣州市萬和整形材料有限公司），制備為0.7 cm × 0.7 cm大小硅膠片，環氧乙烷熏蒸滅菌備用。LB瓊脂平板培養基（鄭州安圖生物工程股份有限公司）；LB液體培養基（北京索萊寶科技有限公司）；細菌基因組DNA提取試劑盒（OMEGA公司，美國）；活/死細菌熒光染色劑（Molecular Probes公司，美國）；結晶紫染液（Sigma公司，美國）；戊二醛（汕頭市達濠區精工化工廠）。紫外分光光度儀（Bio-Rad公司，美國）；激光共聚焦顯微鏡（Olympus公司，日本）；G01-280 全自動高壓消毒鍋（Hiragama公司，日本）；RIDMODEI-3550酶標板自動讀數儀（Biotcck 公司，美 國）。
1.3 實驗分組
1.3.1 PCR檢測icaA、icaD、aap基因表達
取44株表皮葡萄球菌，按照細菌基因組DNA提取試劑盒說明提取表皮葡萄球菌基因組DNA，擴增icaA、icaD、aap基因，以16srRNA基因為內參。各目的基因引物序列、產物長度及退火溫度見表 1。所有引物由上海生工生物工程有限公司設計并合成。PCR循環條件： 95℃、3 min，95℃、30 s，58℃、30 s，72℃、30 s，35個循環；72℃、5 min。擴增后取2 μL反應產物經2%瓊脂糖凝膠電泳檢測目的基因表達。
表1
各目的基因引物序列、產物長度及退火溫度
Table1.
The primer sequences length of product,and annealing temperature of target genes
1.3.2 分組方法
根據icaA、icaD、aap基因表達結果，將44株表皮葡萄球菌分為icaA+icaD+/aap+組（A組）、icaA+icaD+/aap-組（B組）、icaA-icaD-/aap+組（C組）及icaA-icaD-/aap-組（D組）。
1.4 硅膠材料表面細菌生物膜體外模型制備
將4組表皮葡萄球菌分別接種于LB瓊脂平板培養基，37℃培養24 h，獲得單個菌落。取單個菌落接種于LB液體培養基中，37℃震蕩培養16 h，獲得純種菌液。紫外分光光度儀檢測并調整細菌濃度為1 ×107 CFU/mL。取無菌24孔板，每孔放入1塊硅膠材料以及400 μL細菌菌液，37℃溫箱孵育，制備硅膠材料表面細菌生物膜體外模型。
1.5 觀測指標
1.5.1 半定量法檢測細菌黏附能力
于孵育8、12、24、30、36 h取4組硅膠片，4℃無菌PBS清洗去除硅膠片上的浮游菌，結晶紫染液染色30 min，PBS漂洗后加入DMSO脫色15 min。脫色液采用紫外分光光度儀于波長490 nm處測定吸光度（A）值，A值大小反映細菌黏附能力強弱；計算與空白對照濾膜脫色液A值的差值，差值＞ 0.12的菌株為生物膜形成陽性[11]。以培養時間為x軸，A值為y軸，繪制細菌生長曲線。
1.5.2 激光共聚焦顯微鏡觀測硅膠片表面細菌生物膜
厚度 于孵育12、24 h取4組硅膠片，PBS沖洗3次，加入活/死細菌熒光染色劑，常溫下避光染色20 min，PBS沖洗。在氬激光（514 nm/488 nm）條件下，激光共聚焦顯微鏡觀察。于200倍鏡下，每個硅膠片隨機取10個視野，每個視野隨機取1個細菌生物膜測量其厚度，由內（細菌生物膜與硅膠材料相貼的一面）向外逐層掃描，均為20層，步距為1 μm；取均值。
1.5.3 掃描電鏡觀察硅膠片表面細菌生物膜超微結構
于孵育24 h取4組硅膠片，2%戊二酸固定，梯度乙醇脫水，CO2臨界干燥，離子濺射硅膠片表面成金黃色，掃描電鏡下觀察硅膠片表面細菌生物膜情況。
1.6 統計學方法
采用SPSS17.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組內比較采用t檢驗；組間比較采用方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 icaA、icaD、aap基因表達檢測
PCR檢測結果示，44株表皮葡萄球菌中，13株為icaA+icaD+/aap+（A組），12株為icaA+icaD+/aap-（B組），16株為icaA-icaD-/aap+（C組），3株為icaA-icaD-/aap-（D組）。
2.2 半定量法檢測
孵育8 h，4組細菌黏附能力比較差異無統計學意義（P＞ 0.05）。12 h開始，A、B、C組細菌黏附能力均隨時間延長逐漸上升，24 h達高峰，組內8、12、24 h間比較差異均有統計學意義（P＜ 0.05）；之后呈下降趨勢，除A組30 h及36 h間比較差異有統計學意義（P＜ 0.05）外，其余各組24 h后各時間點間比較差異均無統計學意義（P＞ 0.05）。D組組內各時間點間細菌黏附能力無顯著變化，比較差異無統計學意義（P＞ 0.05）。12～36 h時，A、B、C組細菌黏附能力均顯著高于D組，A組顯著高于B、C組，差異均有統計學意義（P＜ 0.05）；B、C組間比較，差異均無統計學意義（P＞ 0.05）。見圖 1。
圖1
各組細菌生長曲線
Figure1.
Growth curves of Staphylococcus epidermidis isolated in 4 groups
實驗期間44株表皮葡萄球菌臨床分離株中，29株（65.9%）細菌生物膜形成陽性，其中A組13株，B組7株，C組9株，D組0株。
2.3 激光共聚焦顯微鏡觀測
12、24 h時A、B、C組細菌生物膜厚度均大于D組，A組明顯大于B、C組，比較差異均有統計學意義（P＜ 0.05）；B、C組間比較差異無統計學意義（P＞ 0.05）。A、B、C組組內24 h細菌生物膜厚度均較12 h增加，比較差異有統計學意義（P＜ 0.05）；D組組內兩時間點間差異無統計學意義（t=-0.802，P=0.468）。見表 2、圖 2。
表2
各組各時間點細菌生物膜厚度比較（μm，
圖2
各時間點各組激光共聚焦顯微鏡觀察（× 600） ? A組12 h ? B組12 h ? C組12 h ? D組12 h ? A組24 h ? B組24 h ? C組24 h ? D組24 h ? ?2.4 掃描電鏡觀察
孵育24 h時A、B、C組硅膠片表面均可見高度組織化多細胞群體結構，即為成熟的細菌生物膜結構；其中A組細菌生物膜分布最廣泛、結構最致密、層次最豐富，B、C組細菌生物膜結構相似。D組僅見少量散在細菌，無明顯細菌生物膜形成。見圖 3。
3 討論
我們前期實驗結果提示ica操縱子中，icaA、icaD基因為聯合表達的關系[12]。icaA基因單獨表達時N-乙酰葡糖胺轉移酶活性低，icaA和icaD基因共表達時該酶活性大大提高，合成最大鏈長達20 個殘基的寡聚物。由于icaA及icaD基因的聯合表達是促進PIA合成最重要的環節，因此icaA、icaD基因對表皮葡萄球菌生物膜的形成起重要作用。本實驗中的44株表皮葡萄球菌臨床分離株中，25株為icaA、icaD基因聯合表達的菌株（A、B組），其中有20株在硅膠材料表面形成了細菌生物膜，提示icaA+icaD+與細菌生物膜形成密切相關。
ica編碼的PIA在表皮葡萄球菌生物膜形成中具有重要作用，但有研究表明ica基因陰性的表皮葡萄球菌可以不依賴PIA，通過細菌表面蛋白直接作用形成蛋白依賴的細菌生物膜，該表面蛋白就是由聚集相關蛋白基因編碼的aap[13]。有學者分離獲得人工全髖、膝關節置換術后人工關節感染的葡萄球菌株，發現感染中PIA和aap分別起作用，可見PIA介導和aap蛋白介導均可形成細菌生物膜[14]。本實驗中aap基因陽性株為29株（A、C組），其中細菌生物膜形成陽性22株，而D組3株icaA-icaD-/aap-菌株均不能形成細菌生物膜。結果表明，aap是聚集階段另一個對細菌生物膜形成發揮關鍵作用的基因，可作為促進細菌生物膜形成的獨立因素。
目前，關于aap基因促進細菌生物膜形成的作用機制尚未明確，綜合相關研究可能與以下方面有關。aap包含A末端結構域和B重復結構域，A末端結構域為B重復結構域的裂解，可促使細菌在細菌生物膜形成初期的相互黏附，B重復結構域可以增強其黏附功能[15]。B重復結構域中的重復序列被定為G5結構域。它是一個由5個重復的氨基乙酸殘基組成的蛋白質保守結構域，呈Zn2+依賴性[16]，可通過Zn2+依賴的D-二聚體實現細菌間直接黏附功能[17]。溶解包括G5結構域的aap片段可以阻斷表皮葡萄球菌生物膜的形成[18]。此外，G5結構域能被N-乙酰氨基葡萄糖所識別，與N-乙酰氨基葡萄糖相結合后與PIA相互作用，進一步提高PIA介導細胞間黏附的能力并促進細菌生物膜的形成[19]。
Stevens等[20]報道將分離的55株腦膜炎患者表皮葡萄球菌菌株，通過剛果紅實驗證實ica+/aap+菌株促進細菌生物膜形成能力較強。我們的實驗利用半定量法繪制生長曲線、激光共聚焦顯微鏡測量細菌生物膜厚度以及掃描電鏡觀察細菌生物膜結構，結果也發現44株表皮葡萄球菌株中，A組13株菌株均形成了細菌生物膜；從生長曲線可見，A組孵育12～24 h時A 值上升最明顯，且顯著高于B、C組。激光共聚焦顯微鏡及掃描電鏡觀察示，硅膠表面的細菌生物膜厚度增加與時間變化有關，各組24 h時細菌生物膜厚度均較12 h時增加，其中A組的細菌生物膜厚度及其結構變化均明顯大于B、C組。A組菌株在硅膠表面可見大量明顯多于其他組菌株的結構致密、高度組織化多細胞群體結構，即成熟的細菌生物膜結構。而B、C組菌株生物膜形成能力、生物膜厚度及生物膜結構均無明顯差異，提示兩組菌株細菌生物膜形成能力基本相同。D組菌株各時間點基本無變化，表明該表型的細菌黏附能力差，激光共聚焦顯微鏡及掃描電鏡也提示硅膠材料表面無明顯細菌生物膜形成。
由此可見icaA、icaD及aap基因對于表皮葡萄球菌生物膜形成均起重要作用；3種方法檢測細菌生物膜形成能力結果提示，icaA、icaD基因與aap基因對于細菌生物膜形成能力的影響無明顯差異。當細菌同時表達icaA、icaD及aap基因時，由于ica是合成PIA的基礎，aap包含的G5結構域能與N-乙酰氨基葡萄糖相結合，與PIA相互作用，故能進一步提高PIA介導細胞間黏附的能力，從而促進細菌生物膜的形成。
