引用本文： 萬居易, 李溫斌, 周子凡, 龔達. 骨骼肌肌母細胞修復心肌的研究進展. 中國修復重建外科雜志, 2014, 28(2): 186-191. doi: 10.7507/1002-1892.20140040 復制
心肌梗死的內、外科治療已取得很大進步，但缺血性心臟疾病的死亡率已超過癌癥。藥物治療及輔助裝置的使用只能緩解心肌缺血導致的癥狀；心臟血運的重建包括冠狀動脈成形術和冠狀動脈旁路移植術，可挽救未死亡的心肌細胞，但不能解決心肌細胞功能喪失的根本問題。心臟移植是目前惟一確定的終末期心臟衰竭治療方式，但費用昂貴、供心缺乏以及免疫抑制劑的長期使用限制了其發展。因此，尋找一種全新的、有效的針對慢性缺血性心臟疾病的治療手段迫在眉睫。目前應用組織工程技術治療慢性缺血性心臟疾病的研究較多，種子細胞來源主要集中在BMSCs、胚胎干細胞、多能干細胞、脂肪干細胞、心臟祖細胞及骨骼肌肌母細胞等。骨骼肌肌母細胞因具有取材容易、在體外可大量擴增、抗缺血、腫瘤發生率低以及能向肌樣細胞分化等特點，尤其是其在體外與心肌細胞接觸時肌纖維可同步收縮[1]，因此已廣泛應用于缺血性心臟疾病的心肌修復實驗中[2-3]。本文對目前骨骼肌肌母細胞在心肌修復中的研究進行總結，以指導下一步研究。
1 骨骼肌肌母細胞的特點
骨骼肌肌母細胞來源于成熟骨骼肌，具有以下特點：① 該細胞位于基膜和肌膜之間，占成熟骨骼肌細胞的2%～5%；② 當肌肉受損或因疾病導致肌肉功能退化時，骨骼肌肌母細胞被激活；③ 取材較容易；④ 具有自我更新能力；⑤ 在適當培養條件下其體外增殖潛能高，并能維持在未分化狀態；⑥ 具有很強的耐缺血能力；⑦ 具有良好的促進肌纖維再生能力；⑧ 細胞移植后導致腫瘤形成的風險很低；⑨ 不涉及倫理爭議；⑩ 使用自體骨骼肌肌母細胞可減輕免疫抑制劑的使用[4]。
2 骨骼肌肌母細胞修復心肌的動物實驗研究
在國內外，不同研究小組已進行了廣泛和深入的動物實驗研究來評估骨骼肌肌母細胞治療缺血性和非缺血性心肌疾病的效果，包括小鼠[5]、大鼠[6]、兔[7-8]、羊[2, 9]、犬[10]和豬[11]等模型。這些研究表明，骨骼肌肌母細胞可有效防止左室重構和保存全局參數（射血分數和左室壓力）以及心肌收縮力的區域參數（梗死區域的局部活動情況、厚度和運動速度）；而且梗死心肌的順應性增加后，其舒張性能也表現出明顯改善[8, 12]。
骨骼肌肌母細胞修復心肌的動物實驗最先由Marelli等[13]完成，他利用低溫損傷犬心肌，然后在損傷區域移植骨骼肌肌母細胞，移植后的細胞存活并呈肌樣分化，其分化的肌纖維取代了損傷區域的瘢痕組織[14]。但骨骼肌肌母細胞表達心臟表型的能力仍有爭議，因為它們不能與宿主心肌細胞進行電機械偶聯[15]。Taylor等[7]將兔的自體骨骼肌肌母細胞移植至凍傷后的心肌區域，證實移植細胞在瘢痕組織周圍能夠分化成單核肌細胞，但未融入心臟組織。莊煒等[16]將兔前降支結扎2周后，在心肌梗死區域注射自體骨骼肌肌母細胞，其左室功能得到改善。移植骨骼肌肌母細胞至病變心肌區域能有效修復心肌以及限制梗死心肌的不利重塑，主要是通過支架效應以及抑制基質金屬蛋白酶活性而實現的[1, 12]。此外，骨骼肌肌母細胞在受體的心肌組織中還具有旁分泌作用[17]。該旁分泌機制可維持梗死區域以及遠處的心肌結構，增加新生血管，改善整體心臟功能，減少舒張末期容積[18]；還可能有助于調節免疫反應及動員宿主干細胞參與修復過程。
骨骼肌肌母細胞是良好的治療基因載體。因此，其可被病毒和非病毒載體轉染，從而攜帶不同細胞因子和生長因子的基因，以改善其生存、植入和分化能力[19-22]。由腺病毒載體轉染人VEGF165基因的骨骼肌肌母細胞移植至鼠心肌梗死心臟模型后2周可繼續分泌人VEGF165蛋白，未轉染的骨骼肌肌母細胞則無此功能[19]。有研究表明，在大鼠心肌梗死區域植入彈性蛋白基因修飾的骨骼肌肌母細胞，有長期加強和維持心臟功能的作用[23]，這些轉染細胞廣泛地分化成多核肌小管，在豬慢性心肌梗死模型中也得到類似結果[11]。這些研究強調了經基因修飾的骨骼肌肌母細胞移植在心肌修復中的安全性、可行性和有效性[24]。心肌營養素1有較強的增厚心肌和提高心肌細胞生存的能力。研究表明，經心肌營養素1基因修飾的骨骼肌肌母細胞移植后，可緩解左心室壁的過度代償性肥大以及充血性心臟衰竭；移植具有分泌IL-1受體拮抗劑功能的骨骼肌肌母細胞可增加骨骼肌肌母細胞的存活率，從而減少不良心室重塑[20]。在另一項研究中，Formigli等[25]通過轉染骨骼肌肌母細胞，使其過度表達松弛素，以增強其與心肌細胞的形態功能整合。然而，通過基因修飾骨骼肌肌母細胞涉及治療性基因的病毒載體轉染，未考慮其不良影響和倫理方面的問題[26]。目前使用刪除了E1和E3基因的腺病毒以及刪除所有病毒基因的腺病毒可以增加腺病毒轉染的安全性。另外，慢病毒載體的研究已取得進展，已從第1 代病毒過渡至更安全可靠的第3代失活病毒載體。最近幾項研究表明[21, 27]，利用非病毒載體也能成功進行基因修飾骨骼肌肌母細胞，雖然效率較低，但使用非病毒載體可以克服病毒載體的不利影響。如Ye等[28]利用新開發的納米粒子將人VEGF165基因導入人骨骼肌肌母細胞獲得成功，從而可以克服病毒載體的不利影響。
除了基因修飾，還可利用骨骼肌肌母細胞重組生長因子蛋白，以調節其在體外培養的特點和移植后的行為[29]。如骨骼肌肌母細胞重組IGF-1和FGF后，體外發現細胞膜上基質金屬蛋白酶表達明顯增強，纖溶系統活性增加[30]。此外，重組了IGF-1和FGF的人骨骼肌肌母細胞，在體內通過調節它們的內源性蛋白水解活性，可增加其化學激活的潛能。Kim等[31]通過缺血性預處理骨骼肌肌母細胞，可以增加其抗氧化應激作用。通過藥物（二氮嗪）預處理骨骼肌肌母細胞也可增加其抗氧化應激作用，Niagara等[32]在急性心肌梗死大鼠心臟模型實驗中，發現經二氮嗪預處理的骨骼肌肌母細胞存活率是未經預處理細胞的近2倍；同時還觀察到經二氮嗪預處理的骨骼肌肌母細胞移植后在受體動物中激活絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶信號通路，增加生長因子（包括VEGF、血管生成素1、FGF和肝細胞生長因子）的表達，從而明顯增加修復區域的血管密度。
移植骨骼肌肌母細胞修復心肌的效果與移植方法也密切相關。Ott 等[33]證實與心肌內單點大劑量注射相比，采用心肌內多點小劑量注射更安全可靠，并提高療效；McCue等[8]證實將骨骼肌肌母細胞移植至心肌梗死區域的外周比移植至中心更安全有效。
3 骨骼肌肌母細胞的臨床研究
在動物實驗證明其安全性和有效性后，骨骼肌肌母細胞開始應用于臨床治療心肌梗死。在全球第1個臨床研究中，Menasché等[34]將1例57歲男性患者的自體骨骼肌肌母細胞移植至心肌梗死心臟，移植后細胞存活并分化形成骨骼肌島嶼，超聲心動圖證實左室射血分數增加，并增加了節段性收縮。
骨骼肌肌母細胞的第一階段臨床試驗于2003年開始[35]，該研究選取了10例有嚴重缺血性心肌病的患者作為研究對象（年齡38～73歲，平均60歲），對其進行自體骨骼肌肌母細胞移植，觀察移植后2～3周生成的細胞數量是否達到預期目標以評估其可行性，用與細胞植入有關的不良事件發生率來評價其安全性。術中在整個瘢痕部位（37 ± 3）個位點注射體積為（5.7 ± 0.3）mL、數量為（871 ± 62）×106個的自體骨骼肌肌母細胞，注射后除1例患者死亡外均無急性術后并發癥，死亡患者死亡原因與細胞移植無關。術后經（10.9 ± 4.5）個月隨訪，患者臨床癥狀有所改善，紐約心臟協會分級從術前的（2.7 ± 0.2）級改善至術后的（1.6 ± 0.1）級，差異有統計學意義（P＜ 0.02）；胸部超聲心動圖顯示，63%患者心肌瘢痕區收縮期厚度增加，其左室射血分數從術前的23.8% ± 3.9%上升至術后的32.1% ± 7.5%，差異有統計學意義（P＜ 0.02）。但其中3 例因心力衰竭再次入院治療5次，由于心律失常，其中2例植入心室再同步起搏器，另1例植入具有再同步功能的自動除顫器。該項研究結論是：隨著時間推移，患者臨床癥狀和左室射血分數均有穩步改善，與心力衰竭有關的再住院率非常低，而由于移植細胞導致的心律失常可通過植入起搏器或除顫器來治療。
Pagani等[36]對5例患嚴重缺血性心臟病、并需通過植入左心室輔助裝置以等待下一次心臟移植的患者，在行左心室輔助裝置植入手術的同時行自體骨骼肌肌母細胞移植，其中4例分別于術后68、91、144和191 d取下心臟，對受體心臟行組織學分析來研究移植后的細胞生存能力。結果顯示，有3個心臟可見移植的骨骼肌肌母細胞存活并分化出成熟肌纖維。Dib等[37]對5例安裝了左心室輔助裝置的缺血性心肌病患者行自體骨骼肌肌母細胞移植，在這些患者行心臟移植時取下心臟進行組織學分析也得出了相似結果，表明自體骨骼肌肌母細胞移植后可存活，并證明了該治療方法的可行性和安全性，為終末期心力衰竭患者提供了一種潛在治療手段。
第一階段臨床試驗后，許多研究者報道了行冠狀動脈旁路移植術同時行骨骼肌肌母細胞植入來輔助治療缺血性心臟病患者[3, 37-39]。但由于許多幸存的心肌梗死患者并不選擇行冠狀動脈旁路移植術，而且通過心外膜傳輸途徑很難達到所有心肌節段，因此有研究者在大動物模型中應用導管系統作為骨骼肌肌母細胞植入手段，并對其修復心肌效果進行了評估[40]。Larose等[41]用急性心肌梗死的尤卡坦半島小型豬作為實驗動物模型，將經皮導管傳輸與經傳統外科手術傳輸骨骼肌肌母細胞的效果進行了比較。MRI結果示，細胞移植所產生的有益效果與傳輸方式無關；術后6個月，通過這兩種傳輸方法均能觀察到心室重塑的逆轉、收縮功能相對改善、局部灌注增加及瘢痕特性的變化，但在兩組動物中圍繞心肌梗死區域邊緣的心律失常也相對增加。有研究人員對缺血性心肌病患者行經皮冠狀動脈介入治療的同時通過導管植入骨骼肌肌母細胞，治療后患者的心功能有明顯改善，并部分逆轉心室重構[42-43]。
由于以上試驗都是患者行血運重建時輔助行細胞移植治療，很難排除細胞移植的有效性是否受血運重建的影響，因此將骨骼肌肌母細胞植入作為獨立治療手段進行研究非常重要。Smits等[44]通過導管移植自體骨骼肌肌母細胞治療缺血性心力衰竭，與基線相比，左室射血分數從36% ± 11%增加至術后3個月的41% ± 9%（P=0.009）和術后6個月的45% ± 8%（P=0.230）；MRI發現目標區域比其他區域的室壁明顯增厚，從（0.9 ± 2.3）mm增加至術后3個月的（1.8 ± 2.4） mm（P=0.008）。之后其他研究人員用導管移植骨骼肌肌母細胞也獲類似結果[42]。但Smits等[44]報道中有3例患者術后出現心律失常。但這些實驗中，每個研究小組使用的細胞移植方法、細胞純度和質量、評估方法均有差異，且樣本數量均較小，因此目前尚無有效的標準化治療方案。
2008年Menasché等[45]首次報道了Ⅱ期臨床試驗結果：自體骨骼肌肌母細胞移植治療缺血性心肌病的MAGIC（Myoblast Autologous Grafting in Ischemic Cardiomyopathy）試驗，這是一個多中心、隨機、安慰劑對照、三方控制、雙盲研究。該研究在法國、德國、比利時、英國和意大利的24個教學醫院中進行，患者納入標準包括左心功能不全（射血分數≤35%）、心肌梗死、有行冠狀動脈旁路移植手術的適應證；共97例患者入選，分為3組（高劑量組30例、低劑量組33例和對照組34例）。3組患者均行冠狀動脈旁路移植手術，高劑量組注射自體骨骼肌肌母細胞8 ×108個，低劑量組注射自體骨骼肌肌母細胞4 ×108個，對照組僅注射安慰劑；所有患者均植入心律轉復除顫器。隨訪6個月結果表明，節段性收縮功能得到改善的患者數量與骨骼肌肌母細胞注射劑量無相關性（對照組48%，低劑量組35%，高劑量組40%，P=0.66）；患者左室射血分數絕對變化值分別為對照組4.4%、低劑量組3.4%和高劑量組5.2%。因此與對照組患者相比，骨骼肌肌母細胞移植并未改善患者的局部或整體左室功能；但是高劑量組的左室容積有顯著下降。在該研究中，低劑量組和高劑量組患者發生心律失常的幾率較高，但在6個月內的主要心臟不良事件和室性心律失常的發生率在3 組間并無顯著差異。該研究結論是：骨骼肌肌母細胞移植結合冠狀動脈旁路移植術并未改善心臟功能，還需要對術后早期心律失常事件數量的增加以及高劑量注射后恢復左心室重構的能力進一步調查研究。
除了MAGIC試驗是采用外科手術外，通過導管植入自體骨骼肌肌母細胞治療心力衰竭的臨床研究還包括心肌細胞生成效率和再生試驗（MYOHEART），導管注射骨骼肌肌母細胞的安全性和有效性研究（SEISMIC）以及用3D引導的導管移植自體骨骼肌肌母細胞治療缺血性心肌病的研究（CAuSMIC）[4]。Povsic等[46]通過介入導管將400～800萬個骨骼肌肌母細胞注射至患者心肌梗死區域，患者的6分鐘步行試驗有改善趨勢；該試驗中短暫發生的室性心動過速可能是由骨骼肌肌母細胞注射引起，但可以治療。目前在國內尚無開展骨骼肌肌母細胞修復心肌的臨床研究。
4 骨骼肌肌母細胞移植修復心肌面臨的挑戰
首先，移植的骨骼肌肌母細胞產生的肌纖維與宿主心肌之間仍存在電機械隔離，這是骨骼肌肌母細胞移植產生心律失常的主要原因。這種電機械耦合失敗原因是由于兩者之間未能形成閏盤--一個實現相鄰肌纖維之間電活動和機械功能同步的基本單位[47]。該基本功能單位包含有細胞內黏附分子、N-鈣黏蛋白以及連接蛋白43，它能實現相鄰細胞間小代謝產物的交換，并在肌纖維之間提供低阻抗通路。將分離的骨胳肌肌母細胞與心肌細胞在體外共培養后，有少許肌管表現出與周圍心肌細胞有同步收縮活動，而且在細胞連接處有N-鈣黏蛋白及連接蛋白43的表達。但分化的骨骼肌肌母細胞會下調N-鈣黏蛋白及連接蛋白43的表達，因此導致細胞間電耦合減弱[47]。Roell等[48]通過基因修飾使骨骼肌肌母細胞高表達連接蛋白43，增加其與宿主細胞的縫隙連接傳導率，從而達到功能整合和同步收縮的目的。然而，Fernandes等[49]通過研究表明，雖然通過基因修飾使骨骼肌肌母細胞高表達連接蛋白43，提高骨骼肌肌母細胞和心肌細胞之間的電耦合，但這種電耦合仍可能不足以防止心律失常。
在其他影響骨骼肌肌母細胞修復心肌梗死效果的因素中，巨大的細胞損失率（高達90%）是一重要原因，尤其是在移植后急性期顯著影響整體效果[50]。在急性期，移植的供體細胞高流失率與多種因素有關，包括氧化應激、缺乏足夠營養支持、缺乏與宿主組織的黏附以及缺血性心肌環境中產生的豐富炎癥/免疫反應因子[50]。有研究表明對骨骼肌肌母細胞進行預處理，包括缺血預處理、生長因子預處理、藥物預處理等，可有效提高骨骼肌肌母細胞的生存率[31-32, 51-52]。
另一個顯著影響骨骼肌肌母細胞心肌修復效果的重要因素是，骨骼肌肌母細胞隨年齡增長，其分化和生長能力會降低。將年幼大鼠和年長大鼠來源的骨骼肌肌母細胞在體外培養，前者在體外增殖和肌管形成方面均顯著優于后者[53]。考慮到這些因素，人們必須權衡在臨床治療過程中使用自體骨骼肌肌母細胞的優點和缺點，尤其是對于老年患者。
5 小結與展望
盡管在心臟疾病細胞治療的動物實驗和臨床研究中，骨骼肌肌母細胞表現出了可喜成果，但必須解決其存在的問題才可能達到最佳預后。如與單劑量相比，重復移植骨骼肌肌母細胞可導致左室射血分數顯著升高[54]。與心肌間注射相比，骨骼肌肌母細胞在體外構建成膜狀的組織工程組織，然后移植至心外膜表面，可避免針頭注射、減少細胞流失、減少心肌纖維化、增加血管生成，最終改善心臟功能[55]。骨骼肌肌母細胞移植也可通過藥理學和基因改造[11, 28, 32]或與其他類型細胞同時移植[56]以改善骨骼肌肌母細胞移植和再生性能。
總之，像其他類型細胞一樣，骨骼肌肌母細胞在心肌修復中有其優缺點。希望在未來可進行更深入研究來改善其特性，增加安全性和有效性，從而應用于臨床。
心肌梗死的內、外科治療已取得很大進步，但缺血性心臟疾病的死亡率已超過癌癥。藥物治療及輔助裝置的使用只能緩解心肌缺血導致的癥狀；心臟血運的重建包括冠狀動脈成形術和冠狀動脈旁路移植術，可挽救未死亡的心肌細胞，但不能解決心肌細胞功能喪失的根本問題。心臟移植是目前惟一確定的終末期心臟衰竭治療方式，但費用昂貴、供心缺乏以及免疫抑制劑的長期使用限制了其發展。因此，尋找一種全新的、有效的針對慢性缺血性心臟疾病的治療手段迫在眉睫。目前應用組織工程技術治療慢性缺血性心臟疾病的研究較多，種子細胞來源主要集中在BMSCs、胚胎干細胞、多能干細胞、脂肪干細胞、心臟祖細胞及骨骼肌肌母細胞等。骨骼肌肌母細胞因具有取材容易、在體外可大量擴增、抗缺血、腫瘤發生率低以及能向肌樣細胞分化等特點，尤其是其在體外與心肌細胞接觸時肌纖維可同步收縮[1]，因此已廣泛應用于缺血性心臟疾病的心肌修復實驗中[2-3]。本文對目前骨骼肌肌母細胞在心肌修復中的研究進行總結，以指導下一步研究。
1 骨骼肌肌母細胞的特點
骨骼肌肌母細胞來源于成熟骨骼肌，具有以下特點：① 該細胞位于基膜和肌膜之間，占成熟骨骼肌細胞的2%～5%；② 當肌肉受損或因疾病導致肌肉功能退化時，骨骼肌肌母細胞被激活；③ 取材較容易；④ 具有自我更新能力；⑤ 在適當培養條件下其體外增殖潛能高，并能維持在未分化狀態；⑥ 具有很強的耐缺血能力；⑦ 具有良好的促進肌纖維再生能力；⑧ 細胞移植后導致腫瘤形成的風險很低；⑨ 不涉及倫理爭議；⑩ 使用自體骨骼肌肌母細胞可減輕免疫抑制劑的使用[4]。
2 骨骼肌肌母細胞修復心肌的動物實驗研究
在國內外，不同研究小組已進行了廣泛和深入的動物實驗研究來評估骨骼肌肌母細胞治療缺血性和非缺血性心肌疾病的效果，包括小鼠[5]、大鼠[6]、兔[7-8]、羊[2, 9]、犬[10]和豬[11]等模型。這些研究表明，骨骼肌肌母細胞可有效防止左室重構和保存全局參數（射血分數和左室壓力）以及心肌收縮力的區域參數（梗死區域的局部活動情況、厚度和運動速度）；而且梗死心肌的順應性增加后，其舒張性能也表現出明顯改善[8, 12]。
骨骼肌肌母細胞修復心肌的動物實驗最先由Marelli等[13]完成，他利用低溫損傷犬心肌，然后在損傷區域移植骨骼肌肌母細胞，移植后的細胞存活并呈肌樣分化，其分化的肌纖維取代了損傷區域的瘢痕組織[14]。但骨骼肌肌母細胞表達心臟表型的能力仍有爭議，因為它們不能與宿主心肌細胞進行電機械偶聯[15]。Taylor等[7]將兔的自體骨骼肌肌母細胞移植至凍傷后的心肌區域，證實移植細胞在瘢痕組織周圍能夠分化成單核肌細胞，但未融入心臟組織。莊煒等[16]將兔前降支結扎2周后，在心肌梗死區域注射自體骨骼肌肌母細胞，其左室功能得到改善。移植骨骼肌肌母細胞至病變心肌區域能有效修復心肌以及限制梗死心肌的不利重塑，主要是通過支架效應以及抑制基質金屬蛋白酶活性而實現的[1, 12]。此外，骨骼肌肌母細胞在受體的心肌組織中還具有旁分泌作用[17]。該旁分泌機制可維持梗死區域以及遠處的心肌結構，增加新生血管，改善整體心臟功能，減少舒張末期容積[18]；還可能有助于調節免疫反應及動員宿主干細胞參與修復過程。
骨骼肌肌母細胞是良好的治療基因載體。因此，其可被病毒和非病毒載體轉染，從而攜帶不同細胞因子和生長因子的基因，以改善其生存、植入和分化能力[19-22]。由腺病毒載體轉染人VEGF165基因的骨骼肌肌母細胞移植至鼠心肌梗死心臟模型后2周可繼續分泌人VEGF165蛋白，未轉染的骨骼肌肌母細胞則無此功能[19]。有研究表明，在大鼠心肌梗死區域植入彈性蛋白基因修飾的骨骼肌肌母細胞，有長期加強和維持心臟功能的作用[23]，這些轉染細胞廣泛地分化成多核肌小管，在豬慢性心肌梗死模型中也得到類似結果[11]。這些研究強調了經基因修飾的骨骼肌肌母細胞移植在心肌修復中的安全性、可行性和有效性[24]。心肌營養素1有較強的增厚心肌和提高心肌細胞生存的能力。研究表明，經心肌營養素1基因修飾的骨骼肌肌母細胞移植后，可緩解左心室壁的過度代償性肥大以及充血性心臟衰竭；移植具有分泌IL-1受體拮抗劑功能的骨骼肌肌母細胞可增加骨骼肌肌母細胞的存活率，從而減少不良心室重塑[20]。在另一項研究中，Formigli等[25]通過轉染骨骼肌肌母細胞，使其過度表達松弛素，以增強其與心肌細胞的形態功能整合。然而，通過基因修飾骨骼肌肌母細胞涉及治療性基因的病毒載體轉染，未考慮其不良影響和倫理方面的問題[26]。目前使用刪除了E1和E3基因的腺病毒以及刪除所有病毒基因的腺病毒可以增加腺病毒轉染的安全性。另外，慢病毒載體的研究已取得進展，已從第1 代病毒過渡至更安全可靠的第3代失活病毒載體。最近幾項研究表明[21, 27]，利用非病毒載體也能成功進行基因修飾骨骼肌肌母細胞，雖然效率較低，但使用非病毒載體可以克服病毒載體的不利影響。如Ye等[28]利用新開發的納米粒子將人VEGF165基因導入人骨骼肌肌母細胞獲得成功，從而可以克服病毒載體的不利影響。
除了基因修飾，還可利用骨骼肌肌母細胞重組生長因子蛋白，以調節其在體外培養的特點和移植后的行為[29]。如骨骼肌肌母細胞重組IGF-1和FGF后，體外發現細胞膜上基質金屬蛋白酶表達明顯增強，纖溶系統活性增加[30]。此外，重組了IGF-1和FGF的人骨骼肌肌母細胞，在體內通過調節它們的內源性蛋白水解活性，可增加其化學激活的潛能。Kim等[31]通過缺血性預處理骨骼肌肌母細胞，可以增加其抗氧化應激作用。通過藥物（二氮嗪）預處理骨骼肌肌母細胞也可增加其抗氧化應激作用，Niagara等[32]在急性心肌梗死大鼠心臟模型實驗中，發現經二氮嗪預處理的骨骼肌肌母細胞存活率是未經預處理細胞的近2倍；同時還觀察到經二氮嗪預處理的骨骼肌肌母細胞移植后在受體動物中激活絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶信號通路，增加生長因子（包括VEGF、血管生成素1、FGF和肝細胞生長因子）的表達，從而明顯增加修復區域的血管密度。
移植骨骼肌肌母細胞修復心肌的效果與移植方法也密切相關。Ott 等[33]證實與心肌內單點大劑量注射相比，采用心肌內多點小劑量注射更安全可靠，并提高療效；McCue等[8]證實將骨骼肌肌母細胞移植至心肌梗死區域的外周比移植至中心更安全有效。
3 骨骼肌肌母細胞的臨床研究
在動物實驗證明其安全性和有效性后，骨骼肌肌母細胞開始應用于臨床治療心肌梗死。在全球第1個臨床研究中，Menasché等[34]將1例57歲男性患者的自體骨骼肌肌母細胞移植至心肌梗死心臟，移植后細胞存活并分化形成骨骼肌島嶼，超聲心動圖證實左室射血分數增加，并增加了節段性收縮。
骨骼肌肌母細胞的第一階段臨床試驗于2003年開始[35]，該研究選取了10例有嚴重缺血性心肌病的患者作為研究對象（年齡38～73歲，平均60歲），對其進行自體骨骼肌肌母細胞移植，觀察移植后2～3周生成的細胞數量是否達到預期目標以評估其可行性，用與細胞植入有關的不良事件發生率來評價其安全性。術中在整個瘢痕部位（37 ± 3）個位點注射體積為（5.7 ± 0.3）mL、數量為（871 ± 62）×106個的自體骨骼肌肌母細胞，注射后除1例患者死亡外均無急性術后并發癥，死亡患者死亡原因與細胞移植無關。術后經（10.9 ± 4.5）個月隨訪，患者臨床癥狀有所改善，紐約心臟協會分級從術前的（2.7 ± 0.2）級改善至術后的（1.6 ± 0.1）級，差異有統計學意義（P＜ 0.02）；胸部超聲心動圖顯示，63%患者心肌瘢痕區收縮期厚度增加，其左室射血分數從術前的23.8% ± 3.9%上升至術后的32.1% ± 7.5%，差異有統計學意義（P＜ 0.02）。但其中3 例因心力衰竭再次入院治療5次，由于心律失常，其中2例植入心室再同步起搏器，另1例植入具有再同步功能的自動除顫器。該項研究結論是：隨著時間推移，患者臨床癥狀和左室射血分數均有穩步改善，與心力衰竭有關的再住院率非常低，而由于移植細胞導致的心律失常可通過植入起搏器或除顫器來治療。
Pagani等[36]對5例患嚴重缺血性心臟病、并需通過植入左心室輔助裝置以等待下一次心臟移植的患者，在行左心室輔助裝置植入手術的同時行自體骨骼肌肌母細胞移植，其中4例分別于術后68、91、144和191 d取下心臟，對受體心臟行組織學分析來研究移植后的細胞生存能力。結果顯示，有3個心臟可見移植的骨骼肌肌母細胞存活并分化出成熟肌纖維。Dib等[37]對5例安裝了左心室輔助裝置的缺血性心肌病患者行自體骨骼肌肌母細胞移植，在這些患者行心臟移植時取下心臟進行組織學分析也得出了相似結果，表明自體骨骼肌肌母細胞移植后可存活，并證明了該治療方法的可行性和安全性，為終末期心力衰竭患者提供了一種潛在治療手段。
第一階段臨床試驗后，許多研究者報道了行冠狀動脈旁路移植術同時行骨骼肌肌母細胞植入來輔助治療缺血性心臟病患者[3, 37-39]。但由于許多幸存的心肌梗死患者并不選擇行冠狀動脈旁路移植術，而且通過心外膜傳輸途徑很難達到所有心肌節段，因此有研究者在大動物模型中應用導管系統作為骨骼肌肌母細胞植入手段，并對其修復心肌效果進行了評估[40]。Larose等[41]用急性心肌梗死的尤卡坦半島小型豬作為實驗動物模型，將經皮導管傳輸與經傳統外科手術傳輸骨骼肌肌母細胞的效果進行了比較。MRI結果示，細胞移植所產生的有益效果與傳輸方式無關；術后6個月，通過這兩種傳輸方法均能觀察到心室重塑的逆轉、收縮功能相對改善、局部灌注增加及瘢痕特性的變化，但在兩組動物中圍繞心肌梗死區域邊緣的心律失常也相對增加。有研究人員對缺血性心肌病患者行經皮冠狀動脈介入治療的同時通過導管植入骨骼肌肌母細胞，治療后患者的心功能有明顯改善，并部分逆轉心室重構[42-43]。
由于以上試驗都是患者行血運重建時輔助行細胞移植治療，很難排除細胞移植的有效性是否受血運重建的影響，因此將骨骼肌肌母細胞植入作為獨立治療手段進行研究非常重要。Smits等[44]通過導管移植自體骨骼肌肌母細胞治療缺血性心力衰竭，與基線相比，左室射血分數從36% ± 11%增加至術后3個月的41% ± 9%（P=0.009）和術后6個月的45% ± 8%（P=0.230）；MRI發現目標區域比其他區域的室壁明顯增厚，從（0.9 ± 2.3）mm增加至術后3個月的（1.8 ± 2.4） mm（P=0.008）。之后其他研究人員用導管移植骨骼肌肌母細胞也獲類似結果[42]。但Smits等[44]報道中有3例患者術后出現心律失常。但這些實驗中，每個研究小組使用的細胞移植方法、細胞純度和質量、評估方法均有差異，且樣本數量均較小，因此目前尚無有效的標準化治療方案。
2008年Menasché等[45]首次報道了Ⅱ期臨床試驗結果：自體骨骼肌肌母細胞移植治療缺血性心肌病的MAGIC（Myoblast Autologous Grafting in Ischemic Cardiomyopathy）試驗，這是一個多中心、隨機、安慰劑對照、三方控制、雙盲研究。該研究在法國、德國、比利時、英國和意大利的24個教學醫院中進行，患者納入標準包括左心功能不全（射血分數≤35%）、心肌梗死、有行冠狀動脈旁路移植手術的適應證；共97例患者入選，分為3組（高劑量組30例、低劑量組33例和對照組34例）。3組患者均行冠狀動脈旁路移植手術，高劑量組注射自體骨骼肌肌母細胞8 ×108個，低劑量組注射自體骨骼肌肌母細胞4 ×108個，對照組僅注射安慰劑；所有患者均植入心律轉復除顫器。隨訪6個月結果表明，節段性收縮功能得到改善的患者數量與骨骼肌肌母細胞注射劑量無相關性（對照組48%，低劑量組35%，高劑量組40%，P=0.66）；患者左室射血分數絕對變化值分別為對照組4.4%、低劑量組3.4%和高劑量組5.2%。因此與對照組患者相比，骨骼肌肌母細胞移植并未改善患者的局部或整體左室功能；但是高劑量組的左室容積有顯著下降。在該研究中，低劑量組和高劑量組患者發生心律失常的幾率較高，但在6個月內的主要心臟不良事件和室性心律失常的發生率在3 組間并無顯著差異。該研究結論是：骨骼肌肌母細胞移植結合冠狀動脈旁路移植術并未改善心臟功能，還需要對術后早期心律失常事件數量的增加以及高劑量注射后恢復左心室重構的能力進一步調查研究。
除了MAGIC試驗是采用外科手術外，通過導管植入自體骨骼肌肌母細胞治療心力衰竭的臨床研究還包括心肌細胞生成效率和再生試驗（MYOHEART），導管注射骨骼肌肌母細胞的安全性和有效性研究（SEISMIC）以及用3D引導的導管移植自體骨骼肌肌母細胞治療缺血性心肌病的研究（CAuSMIC）[4]。Povsic等[46]通過介入導管將400～800萬個骨骼肌肌母細胞注射至患者心肌梗死區域，患者的6分鐘步行試驗有改善趨勢；該試驗中短暫發生的室性心動過速可能是由骨骼肌肌母細胞注射引起，但可以治療。目前在國內尚無開展骨骼肌肌母細胞修復心肌的臨床研究。
4 骨骼肌肌母細胞移植修復心肌面臨的挑戰
首先，移植的骨骼肌肌母細胞產生的肌纖維與宿主心肌之間仍存在電機械隔離，這是骨骼肌肌母細胞移植產生心律失常的主要原因。這種電機械耦合失敗原因是由于兩者之間未能形成閏盤--一個實現相鄰肌纖維之間電活動和機械功能同步的基本單位[47]。該基本功能單位包含有細胞內黏附分子、N-鈣黏蛋白以及連接蛋白43，它能實現相鄰細胞間小代謝產物的交換，并在肌纖維之間提供低阻抗通路。將分離的骨胳肌肌母細胞與心肌細胞在體外共培養后，有少許肌管表現出與周圍心肌細胞有同步收縮活動，而且在細胞連接處有N-鈣黏蛋白及連接蛋白43的表達。但分化的骨骼肌肌母細胞會下調N-鈣黏蛋白及連接蛋白43的表達，因此導致細胞間電耦合減弱[47]。Roell等[48]通過基因修飾使骨骼肌肌母細胞高表達連接蛋白43，增加其與宿主細胞的縫隙連接傳導率，從而達到功能整合和同步收縮的目的。然而，Fernandes等[49]通過研究表明，雖然通過基因修飾使骨骼肌肌母細胞高表達連接蛋白43，提高骨骼肌肌母細胞和心肌細胞之間的電耦合，但這種電耦合仍可能不足以防止心律失常。
在其他影響骨骼肌肌母細胞修復心肌梗死效果的因素中，巨大的細胞損失率（高達90%）是一重要原因，尤其是在移植后急性期顯著影響整體效果[50]。在急性期，移植的供體細胞高流失率與多種因素有關，包括氧化應激、缺乏足夠營養支持、缺乏與宿主組織的黏附以及缺血性心肌環境中產生的豐富炎癥/免疫反應因子[50]。有研究表明對骨骼肌肌母細胞進行預處理，包括缺血預處理、生長因子預處理、藥物預處理等，可有效提高骨骼肌肌母細胞的生存率[31-32, 51-52]。
另一個顯著影響骨骼肌肌母細胞心肌修復效果的重要因素是，骨骼肌肌母細胞隨年齡增長，其分化和生長能力會降低。將年幼大鼠和年長大鼠來源的骨骼肌肌母細胞在體外培養，前者在體外增殖和肌管形成方面均顯著優于后者[53]。考慮到這些因素，人們必須權衡在臨床治療過程中使用自體骨骼肌肌母細胞的優點和缺點，尤其是對于老年患者。
5 小結與展望
盡管在心臟疾病細胞治療的動物實驗和臨床研究中，骨骼肌肌母細胞表現出了可喜成果，但必須解決其存在的問題才可能達到最佳預后。如與單劑量相比，重復移植骨骼肌肌母細胞可導致左室射血分數顯著升高[54]。與心肌間注射相比，骨骼肌肌母細胞在體外構建成膜狀的組織工程組織，然后移植至心外膜表面，可避免針頭注射、減少細胞流失、減少心肌纖維化、增加血管生成，最終改善心臟功能[55]。骨骼肌肌母細胞移植也可通過藥理學和基因改造[11, 28, 32]或與其他類型細胞同時移植[56]以改善骨骼肌肌母細胞移植和再生性能。
總之，像其他類型細胞一樣，骨骼肌肌母細胞在心肌修復中有其優缺點。希望在未來可進行更深入研究來改善其特性，增加安全性和有效性，從而應用于臨床。