引用本文： 付維力, 項舟. 血管化組織工程骨構建中細胞共培養體系的研究進展. 中國修復重建外科雜志, 2014, 28(2): 179-185. doi: 10.7507/1002-1892.20140039 復制
盡管目前臨床常用的骨缺損和骨不愈合治療手段，如自體骨或同種異體骨移植等取得了一定效果[1]，但均存在不足，難以達到天然骨組織結構和功能的完美統一。以細胞治療和組織工程為基礎的再生醫學策略以生物學修復為目標，為臨床骨缺損或骨不愈合的治療帶來新思路[2-4]。體外設計、構建的復雜組織工程骨在體內的轉歸和存活，是其進一步臨床應用的關鍵環節。有學者報道植入至體內的種子細胞在短期內（＜ 4 d）死亡率高達99%[5]。移植至體內的種子細胞存活主要依靠周圍血供的彌散作用，其彌散距離為100～200μm[6]。傳統的骨組織工程復合物由于缺乏血供，常導致植入物存活率較低及構建的組織工程骨中心區域壞死[7]。
如何通過構建血管化組織工程骨促進植入細胞長期存活及與在體宿主骨整合并參與缺損區骨修復，是其臨床轉化的關鍵點[8-9]。目前有很多通過構建血管化組織工程骨促進骨再生的研究策略[10]：細胞共培養研究策略；促進血管生成的生物活性分子在修復區的控釋；內皮細胞自發地自組裝成管狀結構及細胞共培養體系的建立；機械力學刺激的應用；具備合適生物力學和生物學特性的促血管發生支架材料的設計及表面修飾；將帶血管組織瓣吻合至修復區的顯微外科技術等。其中，細胞共培養研究策略模擬骨組織胚胎發育期和骨修復過程成骨細胞和內皮細胞的相互關系[11]，構建兩種類型細胞共培養體系，為血管化組織工程骨的研究帶來了新希望。本文廣泛查閱近年有關血管化組織工程骨構建中細胞共培養的相關文獻，并對成骨細胞和內皮細胞兩種類型細胞的選擇、培養模型和維度、支架材料制備及表面修飾、作用機制、培養條件和應用進展進行綜述。
1 共培養體系中兩種類型細胞的來源及組合
目前用于構建血管化組織工程骨共培養體系的細胞來源主要包括終末分化成熟的成體細胞，如成骨細胞、內皮細胞；成體干/祖細胞，如MSCs和內皮祖細胞（endothelial progenitor cells，EPCs）；胚胎干細胞（embryonic stem cells，ESCs）、誘導多能干細胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）[12]。ESCs因具有強大的增殖能力和全能分化潛能備受關注，但其應用于臨床的最大問題是存在倫理道德爭議和致瘤性缺點[13]。基于重編程體細胞（如人皮膚成纖維細胞）獲得的iPSCs由于來源于成體細胞，無倫理道德爭議和免疫排斥反應，為再生醫學的臨床應用帶來了新突破，但其應用于臨床的安全性和有效性尚待解決[14-15]。通過體外構建兩種類型細胞組合共培養系統，可模擬天然骨組織發育和修復局部的成骨細胞及內皮細胞相互作用，其共培養組合類型主要有：內皮細胞和成骨細胞共培養、MSCs和EPCs共培養、成骨細胞和EPCs共培養、內皮細胞和MSCs共培養等。
終末分化成熟的成骨細胞來源包括不同部位天然骨分離獲得的原代成骨細胞和成骨細胞系，如MG63、MC3T3-E1等[16-17]。由于終末分化成熟的細胞來源有限、增殖能力較差、體外培養擴增較困難、且生物活性較低，近年來更多學者通過模擬骨發育過程中多潛能干/祖細胞間的相互作用，以促進血管化組織工程骨發生，構建能分化為成骨細胞與內皮細胞的成體干/祖細胞共培養體系。相比終末分化成熟的成骨細胞，中胚層來源的成體干細胞MSCs因取材簡便，具有更強的自我更新能力、優良的成骨潛能及免疫調控功能等優點，已被廣泛應用于骨再生的基礎研究和臨床應用[18]。MSCs還能通過釋放促血管生成因子促進新生血管形成。骨髓是MSCs最主要的來源，也是用于血管化組織工程骨構建最多的種子細胞來源。但BMSCs在骨髓中含量很低（約0.001%），且存在供區并發癥[19]，體外擴增伴隨細胞增殖能力和分化潛能的下降，逐漸失去其“干性”特點[20]。因此開發其他來源的MSCs用于構建血管化組織工程骨有重要意義。MSCs還廣泛分布于骨、軟骨、肌肉、肌腱/韌帶、脂肪組織、骨膜、滑膜、外周血等[21-27]。脂肪來源MSCs因易于取材、來源豐富，近年來有較多將其用于構建血管化組織工程骨共培養系統的報道[28]。能分化為成骨細胞的成體干細胞MSCs來源及其成骨能力的比較是目前研究熱點。
內皮細胞在骨發育階段發揮非常重要的作用，其位于骨形成、代謝、重塑和修復區域成骨細胞的附近，我們推測其可能影響成骨細胞的生物學特征[29]。內皮細胞和成骨細胞共培養是血管化組織工程骨共培養體系中最常見的細胞組合類型，接種后的內皮細胞通過與成骨細胞的復雜“對話”來促進血管發生和骨再生[30]。內皮細胞根據脈管來源可分為大血管和微血管兩種類型：大血管內皮細胞除了最常見的人臍靜脈內皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs），還來源于隱靜脈、主動脈、肺動脈等[31]；微血管內皮細胞可從脂肪、真皮和肺微血管等獲得，它們較HUVECs擁有與天然骨局部更相似的微環境，且取材分離簡便，利于未來的臨床應用[32]。內皮細胞主要來源于臍靜脈和血管內膜，但前者存在倫理道德爭議，且不能實現自體移植；后者來源的內皮細胞非常有限。另外，有報道內皮細胞植入體內后出現顯著凋亡[33]。相比終末分化成熟的內皮細胞，能定向分化為成熟內皮細胞的成體祖細胞EPCs因其優良的成血管和增殖能力以及更強的體內生物活性，成為內皮細胞很好的替代[34]。EPCs主要駐留于骨髓，在某些病理情況或使用藥物動員時，EPCs離開骨髓微環境遷移進入外周循環，參與組織的修復過程[35]。除了骨髓，EPCs還可從臍帶血、脂肪、外周血等組織中分離。臍帶血來源的EPCs由于獲取過程中易污染、分離集落形成率低、不能實現自體移植以及倫理道德爭議，使其臨床應用受限[36]；骨髓和脂肪來源的EPCs均存在數量非常有限、取材創傷較大及供區并發癥等缺點[37-38]。而外周血來源的EPCs因取材微創，更有利于實現自體移植目標，具有廣闊的臨床應用前景；且相比骨髓來源的EPCs，其表現更強的增殖能力、典型的內皮標記表達和更高的成血管潛能，當其與MSCs共培養時，能顯著增強成骨和血管化關鍵標志物的表達，包括ALP、BMP-2、VEGF等[39]。在EPCs與MSCs共培養體系中，一方面EPCs促進MSCs的成骨分化，另一方面MSCs為EPCs的血管化提供局部微環境。能定向分化為內皮細胞的EPCs應用于血管化組織工程骨細胞共培養體系是目前的研究熱點。
2 共培養體系的模型和維度
從骨血管化的微環境方面，很多學者通過成骨細胞和內皮細胞體外共培養體系研究兩者的相互關系，以闡明骨血管化機制。細胞共培養技術一般可分為直接接觸共培養和非接觸共培養（如Transwell小室共培養）兩種。由于體外直接接觸共培養技術能更好模擬體內骨發育或骨修復區域微環境中兩種細胞的直接接觸，其應用于血管化組織工程骨細胞共培養體系的研究較多。直接接觸共培養常分為傳統二維平面培養和復合設計的三維結構支架材料培養[30]。
傳統二維平面培養體系可研究成骨細胞和內皮細胞相互接觸及調控其分化的分子事件。二維細胞共培養模型將兩種細胞直接接種于培養瓶上或預涂特異細胞外基質蛋白（如Ⅰ型膠原、纖維蛋白、層粘連蛋白或Matrigel等）上，通過兩種細胞的直接接觸或旁分泌、自分泌的細胞因子相互發生作用。Dariima等[40]研究發現大鼠主動脈內皮細胞協同成骨細胞系 MC3T3-E1促進成骨基因表達，并刺激成骨細胞表達早期成骨標志物如ALP，同時成骨細胞也支持內皮細胞血管樣結構形成。
三維模型即將兩種細胞接種于具有三維結構的生物支架材料上或細胞三維成團培養，可為構建血管化組織工程骨和細胞-細胞間的相互作用提供最佳微環境。表 1總結了通過不同細胞類型和培養模型來研究血管化組織工程骨共培養體系的細胞間相互作用。成骨標記檢測包括成骨鑒定茜素紅染色，早期成骨標記（如ALP表達），成骨特異基因或蛋白表達（如Runx2、BMP-2、Ⅰ型膠原、骨鈣素、骨橋蛋白、骨唾液酸蛋白）等；成血管標志檢測有成管實驗、內皮特異基因或蛋白表達（如VEGF、CD31、VEGF受體2、VE-cadherin、Tie-2、內皮型一氧化氮合酶、血管性血友病因子等）。體內實驗包括免疫缺陷動物皮下埋置或骨缺損的原位修復。有學者報道將HUVECs和人MSCs以 1∶1比例接種于纖維蛋白膠上，先在內皮細胞培養基（endothelial cell growth medium，EGM）中培養2 周，再在 1∶1比例EGM和成骨培養基（osteogenic medium，OM）中培養4周，結果發現有血管網絡形成，兩種類型細胞復合小牛脫細胞松質骨支架埋置于裸鼠皮下6 周，大體觀察和組織學染色發現骨質沉積和血管網狀結構，與宿主血管網吻合相連[45]。三維模型的共培養體系中，內皮細胞具有骨誘導性，能促進MSCs向成骨細胞分化，因此內皮細胞在共培養體系中被認為是骨誘導性的“調解人”[30]；MSCs也能為內皮細胞提供黏附并通過分泌信號分子促進新生血管形成。
表1
構建血管化組織工程骨的細胞共培養體系
Table1.
The co-culture system for constructing vascularized tissue engineered bone
3 支架材料制備及表面修飾
三維支架材料能給內皮細胞提供黏附、增殖、遷移和發揮功能的場所，還通過增強共培養體系中兩種細胞的相互作用來促進骨形成和血管化進程。共培養細胞復合的三維支架材料有以下類型：以鈣鹽為基礎的無機材料[52]，如HA、β-TCP、聚磷酸鈣；天然衍生材料，如膠原、透明質酸、殼聚糖、海藻酸鹽、蠶絲蛋白、脫細胞骨基質[16, 47]；人工合成高分子支架，如PLA、聚乙交酯、PCL、聚對二氧環已酮、PU等[53]。任何單一支架材料都難以滿足天然骨組織生物化學和生物力學性能的綜合需求，因此綜合天然和合成、有機和無機各自優點的復合材料用于構建血管化組織工程骨支架材料成為研究熱點。
支架材料的制備方法和表面修飾都有利于細胞的黏附和血管化骨形成。Guerrero等[49]將人MSCs和EPCs接種于由普魯蘭多糖和葡聚糖以3∶1質量比合成的多糖支架上，體外實驗結果可見成骨和成血管標志物表達及縫隙連接蛋白Connexin 43表達，體內實驗結果顯示細胞-支架材料復合物組有更多類骨質形成。Thein-Han等[41]采用氣體發泡技術制備大孔磷酸鈣支架材料，以4∶1比例復合HUVECs和人成骨細胞，體外培養42 d，發現支架上有微血管樣結構和礦化結節形成。有學者將脂肪來源MSCs體外成骨誘導9 d后，以1∶1比例與HUVECs混合，負載于采用固體自由成型技術制備的PCL/PLGA/TCP復合支架上，修復直徑8 mm大鼠顱骨全層缺損，12周顯示75%支架區域由新生骨組織填充，微焦點計算機斷層掃描和組織學分析顯示MSCs與HUVECs共混細胞-支架材料復合物組顯示良好的骨形成[48]。Kim等[54]通過納米技術和表面形貌設計支架仿生骨組織特異微環境調控血管化骨共培養體系。他們利用紫外線輔助毛細管力光刻技術設計和構建的仿生骨基質納米表面形貌溝槽，協同促進人脂肪MSCs和HUVECs共培養體系（1∶1比例）血管化骨的構建，有利于縫隙連接蛋白Connexin 43的表達，并促進其向成骨表型分化。還有學者通過肝素結合方法將VEGF固定于鈦表面，能顯著增強成骨細胞/內皮細胞共培養體系中內皮細胞的生物活性和礦化進程，該研究顯示VEGF在成骨和成血管的相互作用方面發揮重要作用[55]。
4 構建血管化組織工程骨細胞共培養體系的培養條件
血管化組織工程骨構建中細胞共培養策略取決于最佳培養條件。兩種細胞共培養的條件包括：細胞的接種密度與比例、接種順序、培養基的選擇及培養時間等。Ma 等[56]的MSCs與HUVECs共培養體系中，MSCs與HUVECs比例為50∶50時可獲得最佳成骨（ALP活性和礦化測試）和血管分化（CD31+染色）結果。有學者認為血管形成應先于骨形成，因此他們建議共培養體系中兩種類型細胞先在EGM培養基中培養，待成血管后再加入OM培養基以誘導或維持成骨[45]。一般認為，OM更適合MSCs向成骨分化，而EGM支持血管EPCs或內皮細胞形成。也有學者先接種3份MSCs或成骨細胞于OM中，24 h或3 d后再接種2 份EPCs于1∶1比例EGM和OM培養基中[17, 57]，可獲得較穩定的血管狀網絡結構和特異的成骨標志物表達。不同的培養條件取決于研究體系中細胞的來源（物種、年齡、組織）、類型、代次和分化狀態等因素。
5 構建血管化組織工程骨細胞共培養體系的作用機制
細胞共培養體系中直接接觸的兩種細胞相互作用促進血管化組織工程骨的構建，主要通過以下3種作用機制[30, 58]：① 緊密連接的鄰近細胞膜分子的直接相互作用；② 鄰近細胞間通過縫隙連接形成細胞質的相互作用；③ 分泌到細胞外環境中的信號分子與目標細胞的特異受體相互作用，通過旁分泌/自分泌的生長因子/細胞因子發揮間接接觸作用。縫隙連接的相互作用由成骨細胞上的Connexin43和內皮細胞上的Connexin40介導[59]。內皮細胞能分泌很多信號分子促進成骨，如PDGF-AB、TGF-β1、TGF-β2、FGF-2、EGF、骨保護素、BMP-2等；內皮細胞還能刺激成骨細胞表達早期成骨標志物ALP[60]。MSCs也能產生很多促血管生成因子來促進新生微血管形成，如VEGF、血管生成素1、FGF-2、IGF、PDGF、TGF-β等[61]。成骨轉錄因子Runx2 可通過調控VEGF的表達和下調抗血管生成因子來促進血管形成[62]。研究發現MSCs與HUVECs直接接觸共培養的早期階段（24～48 h），神經鈣黏蛋白通過促進細胞間的黏附和激活細胞內的β-catenin和T細胞因子1信號分子事件來促進MSCs早期向成骨細胞分化[63]。在成骨細胞-內皮細胞共培養體系中，內皮細胞支持成骨分化和維持成骨細胞的功能（上調成骨細胞的ALP表達），是通過介導p38絲裂原活化蛋白激酶信號通路的轉錄后調控而發揮作用的[64]。在該體系中，成骨細胞釋放許多促血管生成因子，包括VEGF和很多骨營養因子如IGF-1，其中VEGF結合內皮細胞受體使VEGF受體2/Flk-1磷酸化，激活細胞外調節蛋白激酶1/2和誘導COX-2產生，促進前列腺素的釋放，調控成骨；成骨細胞通過自分泌/旁分泌的VEGF直接介導與內皮細胞“對話”來影響骨形成[61]。原代成骨細胞與EPCs共培養系統的分子機制還包括Sonic Hedgehog，也參與促血管發生和骨形成[65]。
6 展望
骨血管化形成涉及不同類型細胞的相互作用，是一系列分子信號事件等多因素相互作用、多步驟的復雜過程。如何真正模擬胚胎時期骨發育和骨愈合的微環境（包括生物化學組分、生長因子、力學刺激和低氧條件構成的微生態環境），為骨再生的臨床應用提供參考，尚需進一步研究。另外，如何實現微創和自體移植為目標的種子細胞的優選、支架材料的仿生設計、共培養條件的優化、體內模型的構建及它們之間的相互作用，都是未來臨床轉化研究的關鍵和熱點。
盡管目前臨床常用的骨缺損和骨不愈合治療手段，如自體骨或同種異體骨移植等取得了一定效果[1]，但均存在不足，難以達到天然骨組織結構和功能的完美統一。以細胞治療和組織工程為基礎的再生醫學策略以生物學修復為目標，為臨床骨缺損或骨不愈合的治療帶來新思路[2-4]。體外設計、構建的復雜組織工程骨在體內的轉歸和存活，是其進一步臨床應用的關鍵環節。有學者報道植入至體內的種子細胞在短期內（＜ 4 d）死亡率高達99%[5]。移植至體內的種子細胞存活主要依靠周圍血供的彌散作用，其彌散距離為100～200μm[6]。傳統的骨組織工程復合物由于缺乏血供，常導致植入物存活率較低及構建的組織工程骨中心區域壞死[7]。
如何通過構建血管化組織工程骨促進植入細胞長期存活及與在體宿主骨整合并參與缺損區骨修復，是其臨床轉化的關鍵點[8-9]。目前有很多通過構建血管化組織工程骨促進骨再生的研究策略[10]：細胞共培養研究策略；促進血管生成的生物活性分子在修復區的控釋；內皮細胞自發地自組裝成管狀結構及細胞共培養體系的建立；機械力學刺激的應用；具備合適生物力學和生物學特性的促血管發生支架材料的設計及表面修飾；將帶血管組織瓣吻合至修復區的顯微外科技術等。其中，細胞共培養研究策略模擬骨組織胚胎發育期和骨修復過程成骨細胞和內皮細胞的相互關系[11]，構建兩種類型細胞共培養體系，為血管化組織工程骨的研究帶來了新希望。本文廣泛查閱近年有關血管化組織工程骨構建中細胞共培養的相關文獻，并對成骨細胞和內皮細胞兩種類型細胞的選擇、培養模型和維度、支架材料制備及表面修飾、作用機制、培養條件和應用進展進行綜述。
1 共培養體系中兩種類型細胞的來源及組合
目前用于構建血管化組織工程骨共培養體系的細胞來源主要包括終末分化成熟的成體細胞，如成骨細胞、內皮細胞；成體干/祖細胞，如MSCs和內皮祖細胞（endothelial progenitor cells，EPCs）；胚胎干細胞（embryonic stem cells，ESCs）、誘導多能干細胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）[12]。ESCs因具有強大的增殖能力和全能分化潛能備受關注，但其應用于臨床的最大問題是存在倫理道德爭議和致瘤性缺點[13]。基于重編程體細胞（如人皮膚成纖維細胞）獲得的iPSCs由于來源于成體細胞，無倫理道德爭議和免疫排斥反應，為再生醫學的臨床應用帶來了新突破，但其應用于臨床的安全性和有效性尚待解決[14-15]。通過體外構建兩種類型細胞組合共培養系統，可模擬天然骨組織發育和修復局部的成骨細胞及內皮細胞相互作用，其共培養組合類型主要有：內皮細胞和成骨細胞共培養、MSCs和EPCs共培養、成骨細胞和EPCs共培養、內皮細胞和MSCs共培養等。
終末分化成熟的成骨細胞來源包括不同部位天然骨分離獲得的原代成骨細胞和成骨細胞系，如MG63、MC3T3-E1等[16-17]。由于終末分化成熟的細胞來源有限、增殖能力較差、體外培養擴增較困難、且生物活性較低，近年來更多學者通過模擬骨發育過程中多潛能干/祖細胞間的相互作用，以促進血管化組織工程骨發生，構建能分化為成骨細胞與內皮細胞的成體干/祖細胞共培養體系。相比終末分化成熟的成骨細胞，中胚層來源的成體干細胞MSCs因取材簡便，具有更強的自我更新能力、優良的成骨潛能及免疫調控功能等優點，已被廣泛應用于骨再生的基礎研究和臨床應用[18]。MSCs還能通過釋放促血管生成因子促進新生血管形成。骨髓是MSCs最主要的來源，也是用于血管化組織工程骨構建最多的種子細胞來源。但BMSCs在骨髓中含量很低（約0.001%），且存在供區并發癥[19]，體外擴增伴隨細胞增殖能力和分化潛能的下降，逐漸失去其“干性”特點[20]。因此開發其他來源的MSCs用于構建血管化組織工程骨有重要意義。MSCs還廣泛分布于骨、軟骨、肌肉、肌腱/韌帶、脂肪組織、骨膜、滑膜、外周血等[21-27]。脂肪來源MSCs因易于取材、來源豐富，近年來有較多將其用于構建血管化組織工程骨共培養系統的報道[28]。能分化為成骨細胞的成體干細胞MSCs來源及其成骨能力的比較是目前研究熱點。
內皮細胞在骨發育階段發揮非常重要的作用，其位于骨形成、代謝、重塑和修復區域成骨細胞的附近，我們推測其可能影響成骨細胞的生物學特征[29]。內皮細胞和成骨細胞共培養是血管化組織工程骨共培養體系中最常見的細胞組合類型，接種后的內皮細胞通過與成骨細胞的復雜“對話”來促進血管發生和骨再生[30]。內皮細胞根據脈管來源可分為大血管和微血管兩種類型：大血管內皮細胞除了最常見的人臍靜脈內皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs），還來源于隱靜脈、主動脈、肺動脈等[31]；微血管內皮細胞可從脂肪、真皮和肺微血管等獲得，它們較HUVECs擁有與天然骨局部更相似的微環境，且取材分離簡便，利于未來的臨床應用[32]。內皮細胞主要來源于臍靜脈和血管內膜，但前者存在倫理道德爭議，且不能實現自體移植；后者來源的內皮細胞非常有限。另外，有報道內皮細胞植入體內后出現顯著凋亡[33]。相比終末分化成熟的內皮細胞，能定向分化為成熟內皮細胞的成體祖細胞EPCs因其優良的成血管和增殖能力以及更強的體內生物活性，成為內皮細胞很好的替代[34]。EPCs主要駐留于骨髓，在某些病理情況或使用藥物動員時，EPCs離開骨髓微環境遷移進入外周循環，參與組織的修復過程[35]。除了骨髓，EPCs還可從臍帶血、脂肪、外周血等組織中分離。臍帶血來源的EPCs由于獲取過程中易污染、分離集落形成率低、不能實現自體移植以及倫理道德爭議，使其臨床應用受限[36]；骨髓和脂肪來源的EPCs均存在數量非常有限、取材創傷較大及供區并發癥等缺點[37-38]。而外周血來源的EPCs因取材微創，更有利于實現自體移植目標，具有廣闊的臨床應用前景；且相比骨髓來源的EPCs，其表現更強的增殖能力、典型的內皮標記表達和更高的成血管潛能，當其與MSCs共培養時，能顯著增強成骨和血管化關鍵標志物的表達，包括ALP、BMP-2、VEGF等[39]。在EPCs與MSCs共培養體系中，一方面EPCs促進MSCs的成骨分化，另一方面MSCs為EPCs的血管化提供局部微環境。能定向分化為內皮細胞的EPCs應用于血管化組織工程骨細胞共培養體系是目前的研究熱點。
2 共培養體系的模型和維度
從骨血管化的微環境方面，很多學者通過成骨細胞和內皮細胞體外共培養體系研究兩者的相互關系，以闡明骨血管化機制。細胞共培養技術一般可分為直接接觸共培養和非接觸共培養（如Transwell小室共培養）兩種。由于體外直接接觸共培養技術能更好模擬體內骨發育或骨修復區域微環境中兩種細胞的直接接觸，其應用于血管化組織工程骨細胞共培養體系的研究較多。直接接觸共培養常分為傳統二維平面培養和復合設計的三維結構支架材料培養[30]。
傳統二維平面培養體系可研究成骨細胞和內皮細胞相互接觸及調控其分化的分子事件。二維細胞共培養模型將兩種細胞直接接種于培養瓶上或預涂特異細胞外基質蛋白（如Ⅰ型膠原、纖維蛋白、層粘連蛋白或Matrigel等）上，通過兩種細胞的直接接觸或旁分泌、自分泌的細胞因子相互發生作用。Dariima等[40]研究發現大鼠主動脈內皮細胞協同成骨細胞系 MC3T3-E1促進成骨基因表達，并刺激成骨細胞表達早期成骨標志物如ALP，同時成骨細胞也支持內皮細胞血管樣結構形成。
三維模型即將兩種細胞接種于具有三維結構的生物支架材料上或細胞三維成團培養，可為構建血管化組織工程骨和細胞-細胞間的相互作用提供最佳微環境。表 1總結了通過不同細胞類型和培養模型來研究血管化組織工程骨共培養體系的細胞間相互作用。成骨標記檢測包括成骨鑒定茜素紅染色，早期成骨標記（如ALP表達），成骨特異基因或蛋白表達（如Runx2、BMP-2、Ⅰ型膠原、骨鈣素、骨橋蛋白、骨唾液酸蛋白）等；成血管標志檢測有成管實驗、內皮特異基因或蛋白表達（如VEGF、CD31、VEGF受體2、VE-cadherin、Tie-2、內皮型一氧化氮合酶、血管性血友病因子等）。體內實驗包括免疫缺陷動物皮下埋置或骨缺損的原位修復。有學者報道將HUVECs和人MSCs以 1∶1比例接種于纖維蛋白膠上，先在內皮細胞培養基（endothelial cell growth medium，EGM）中培養2 周，再在 1∶1比例EGM和成骨培養基（osteogenic medium，OM）中培養4周，結果發現有血管網絡形成，兩種類型細胞復合小牛脫細胞松質骨支架埋置于裸鼠皮下6 周，大體觀察和組織學染色發現骨質沉積和血管網狀結構，與宿主血管網吻合相連[45]。三維模型的共培養體系中，內皮細胞具有骨誘導性，能促進MSCs向成骨細胞分化，因此內皮細胞在共培養體系中被認為是骨誘導性的“調解人”[30]；MSCs也能為內皮細胞提供黏附并通過分泌信號分子促進新生血管形成。
表1
構建血管化組織工程骨的細胞共培養體系
Table1.
The co-culture system for constructing vascularized tissue engineered bone
3 支架材料制備及表面修飾
三維支架材料能給內皮細胞提供黏附、增殖、遷移和發揮功能的場所，還通過增強共培養體系中兩種細胞的相互作用來促進骨形成和血管化進程。共培養細胞復合的三維支架材料有以下類型：以鈣鹽為基礎的無機材料[52]，如HA、β-TCP、聚磷酸鈣；天然衍生材料，如膠原、透明質酸、殼聚糖、海藻酸鹽、蠶絲蛋白、脫細胞骨基質[16, 47]；人工合成高分子支架，如PLA、聚乙交酯、PCL、聚對二氧環已酮、PU等[53]。任何單一支架材料都難以滿足天然骨組織生物化學和生物力學性能的綜合需求，因此綜合天然和合成、有機和無機各自優點的復合材料用于構建血管化組織工程骨支架材料成為研究熱點。
支架材料的制備方法和表面修飾都有利于細胞的黏附和血管化骨形成。Guerrero等[49]將人MSCs和EPCs接種于由普魯蘭多糖和葡聚糖以3∶1質量比合成的多糖支架上，體外實驗結果可見成骨和成血管標志物表達及縫隙連接蛋白Connexin 43表達，體內實驗結果顯示細胞-支架材料復合物組有更多類骨質形成。Thein-Han等[41]采用氣體發泡技術制備大孔磷酸鈣支架材料，以4∶1比例復合HUVECs和人成骨細胞，體外培養42 d，發現支架上有微血管樣結構和礦化結節形成。有學者將脂肪來源MSCs體外成骨誘導9 d后，以1∶1比例與HUVECs混合，負載于采用固體自由成型技術制備的PCL/PLGA/TCP復合支架上，修復直徑8 mm大鼠顱骨全層缺損，12周顯示75%支架區域由新生骨組織填充，微焦點計算機斷層掃描和組織學分析顯示MSCs與HUVECs共混細胞-支架材料復合物組顯示良好的骨形成[48]。Kim等[54]通過納米技術和表面形貌設計支架仿生骨組織特異微環境調控血管化骨共培養體系。他們利用紫外線輔助毛細管力光刻技術設計和構建的仿生骨基質納米表面形貌溝槽，協同促進人脂肪MSCs和HUVECs共培養體系（1∶1比例）血管化骨的構建，有利于縫隙連接蛋白Connexin 43的表達，并促進其向成骨表型分化。還有學者通過肝素結合方法將VEGF固定于鈦表面，能顯著增強成骨細胞/內皮細胞共培養體系中內皮細胞的生物活性和礦化進程，該研究顯示VEGF在成骨和成血管的相互作用方面發揮重要作用[55]。
4 構建血管化組織工程骨細胞共培養體系的培養條件
血管化組織工程骨構建中細胞共培養策略取決于最佳培養條件。兩種細胞共培養的條件包括：細胞的接種密度與比例、接種順序、培養基的選擇及培養時間等。Ma 等[56]的MSCs與HUVECs共培養體系中，MSCs與HUVECs比例為50∶50時可獲得最佳成骨（ALP活性和礦化測試）和血管分化（CD31+染色）結果。有學者認為血管形成應先于骨形成，因此他們建議共培養體系中兩種類型細胞先在EGM培養基中培養，待成血管后再加入OM培養基以誘導或維持成骨[45]。一般認為，OM更適合MSCs向成骨分化，而EGM支持血管EPCs或內皮細胞形成。也有學者先接種3份MSCs或成骨細胞于OM中，24 h或3 d后再接種2 份EPCs于1∶1比例EGM和OM培養基中[17, 57]，可獲得較穩定的血管狀網絡結構和特異的成骨標志物表達。不同的培養條件取決于研究體系中細胞的來源（物種、年齡、組織）、類型、代次和分化狀態等因素。
5 構建血管化組織工程骨細胞共培養體系的作用機制
細胞共培養體系中直接接觸的兩種細胞相互作用促進血管化組織工程骨的構建，主要通過以下3種作用機制[30, 58]：① 緊密連接的鄰近細胞膜分子的直接相互作用；② 鄰近細胞間通過縫隙連接形成細胞質的相互作用；③ 分泌到細胞外環境中的信號分子與目標細胞的特異受體相互作用，通過旁分泌/自分泌的生長因子/細胞因子發揮間接接觸作用。縫隙連接的相互作用由成骨細胞上的Connexin43和內皮細胞上的Connexin40介導[59]。內皮細胞能分泌很多信號分子促進成骨，如PDGF-AB、TGF-β1、TGF-β2、FGF-2、EGF、骨保護素、BMP-2等；內皮細胞還能刺激成骨細胞表達早期成骨標志物ALP[60]。MSCs也能產生很多促血管生成因子來促進新生微血管形成，如VEGF、血管生成素1、FGF-2、IGF、PDGF、TGF-β等[61]。成骨轉錄因子Runx2 可通過調控VEGF的表達和下調抗血管生成因子來促進血管形成[62]。研究發現MSCs與HUVECs直接接觸共培養的早期階段（24～48 h），神經鈣黏蛋白通過促進細胞間的黏附和激活細胞內的β-catenin和T細胞因子1信號分子事件來促進MSCs早期向成骨細胞分化[63]。在成骨細胞-內皮細胞共培養體系中，內皮細胞支持成骨分化和維持成骨細胞的功能（上調成骨細胞的ALP表達），是通過介導p38絲裂原活化蛋白激酶信號通路的轉錄后調控而發揮作用的[64]。在該體系中，成骨細胞釋放許多促血管生成因子，包括VEGF和很多骨營養因子如IGF-1，其中VEGF結合內皮細胞受體使VEGF受體2/Flk-1磷酸化，激活細胞外調節蛋白激酶1/2和誘導COX-2產生，促進前列腺素的釋放，調控成骨；成骨細胞通過自分泌/旁分泌的VEGF直接介導與內皮細胞“對話”來影響骨形成[61]。原代成骨細胞與EPCs共培養系統的分子機制還包括Sonic Hedgehog，也參與促血管發生和骨形成[65]。
6 展望
骨血管化形成涉及不同類型細胞的相互作用，是一系列分子信號事件等多因素相互作用、多步驟的復雜過程。如何真正模擬胚胎時期骨發育和骨愈合的微環境（包括生物化學組分、生長因子、力學刺激和低氧條件構成的微生態環境），為骨再生的臨床應用提供參考，尚需進一步研究。另外，如何實現微創和自體移植為目標的種子細胞的優選、支架材料的仿生設計、共培養條件的優化、體內模型的構建及它們之間的相互作用，都是未來臨床轉化研究的關鍵和熱點。
