引用本文： 李春波, 陳增淦, 陳統一, 張峰, 周建平. 種子細胞在構建組織工程神經中的應用進展. 中國修復重建外科雜志, 2014, 28(2): 173-178. doi: 10.7507/1002-1892.20140038 復制
周圍神經缺損修復重建是臨床難題之一，其修復過程復雜，療效往往欠佳。自體神經移植是首選治療方法，但存在供體神經來源受限、殘留供區感覺功能障礙和增加供區創傷的缺點[1]。組織工程神經作為自體神經移植替代物已成為研究熱點。采用組織工程技術構建組織工程神經主要涉及種子細胞、神經營養因子和神經導管材料3個方面，其中種子細胞是該項技術的首要環節和基本要素。既往研究表明，單純使用神經導管修復大鼠坐骨神經缺損的最大長度為13 mm[2]，靈長類動物正中神經和尺神經缺損的最大修復長度分別為20 mm和30 mm[3]；臨床上對于人周圍神經損傷，超過60 mm的缺損修復效果往往較差[4]。但是當在神經導管中植入雪旺細胞（Schwann cells，SCs）或干細胞時，可大大延長修復長度。本文對種子細胞在組織工程神經中的研究現狀及應用前景作一綜述。
1 SCs
1.1 SCs在神經再生中的作用
SCs沿神經元突起分布，具有以下生物學功能：傳導神經沖動、促進神經軸突生長、分泌神經營養因子和調節神經突觸活性等。神經受損后，損傷神經遠側端SCs分泌大量促軸突再生的營養物質，如NGF、腦源性神經營養因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）、角質細胞源神經營養因子（glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF）、神經營養因子3（neurotrophin 3，NT-3）、FGF等；此外，SCs還能分泌趨化因子，包括IL-1β、白細胞抑制因子和單核細胞趨化蛋白1等，吸引巨噬細胞到達損傷部位。在損傷神經遠側端，SCs去分化而重新獲得分裂和增殖功能，形成柱狀結構作為軸突再生的支架，為軸突再生提供適宜微環境；隨后包繞新生軸突形成髓鞘，最終受損神經完成結構和功能的修復重建[5]。
1.2 SCs在構建組織工程神經中的應用
1991年，Morrissey等[6]從成年人膈神經中成功分離出SCs。隨后，Levi等[7]利用毛喉素（Forskolin）抑制成纖維細胞，并加入外源性分裂素刺激成年人SCs增殖，2周后可獲得純度達99.9%的SCs，增殖后的SCs能形成髓鞘，提示SCs可作為合適的種子細胞應用于周圍神經損傷修復。
研究表明[8]，SCs植入神經導管可提高軸突再生能力。Mosahebi等[9]以逆轉錄病毒為載體，用lacZ基因轉染擴增后的SCs，再將轉染后的SCs植入神經導管修復大鼠坐骨神經10 mm缺損；4周后，90%SCs表達lacZ基因并保持持續增殖狀態，角質纖維酸性蛋白（glibal fibrillary acidic protein，GFAP）、P75、主要組織相容性抗原（major histocompatibility complex，MHC）-Ⅰ和MHC-Ⅱ等SCs標記物表達無明顯變化，體內實驗表明SCs能顯著促進軸突再生。Berrocal等[10]用綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）標記從大鼠坐骨神經分離的SCs后，將其以細胞密度2 ×105個/mL植入可吸收膠原導管，修復大鼠坐骨神經13 mm缺損；術后12周，與單純膠原導管組比較，實驗組有髓神經再生軸突數量及范圍均擴大，步態分析及坐骨神經功能指數（sciatic nerve function index，SFI）評分均顯示大鼠下肢功能顯著提高。Zarbakhsh等[11]從大鼠坐骨神經和骨髓中分離出SCs和BMSCs，再將兩種細胞分別植入硅膠/纖維蛋白神經導管橋接大鼠坐骨神經10 mm缺損；結果顯示二者均能加強軸突再生，但SCs效果優于BMSCs。盡管SCs和神經導管聯合應用能加強周圍神經缺損修復，但自體SCs仍存在來源有限、自我增殖能力差、供區創傷等不足；而同種異體來源的SCs常引起免疫排斥反應。因此，擴大SCs來源、抑制同種異體SCs的免疫排斥反應及保持SCs功能穩定性等有待進一步研究。
2 干細胞
雖然SCs在神經再生和修復中具有重要作用，但其為終末期細胞，存在增殖能力差、體外分離培養困難、功能隨傳代次數增加而下降、需二次手術等缺點，不能完全滿足種子細胞的需求。干細胞是一種具有多向分化潛能的處于相對未分化狀態的細胞，可分化為成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞和肌細胞等。在特定誘導條件下，干細胞也可分化為表達S-100蛋白、GFAP和P75等SCs標記物的SCs樣細胞。研究表明已分化的干細胞可促進軸突再生[12]。
2.1 胚胎干細胞（embryonic stem cells，ESCs）
ESCs是位于胚胎發育早期囊胚內細胞團中的細胞，具有無限增殖、自我更新和多向分化特征，幾乎可分化為外胚層、中胚層和內胚層3種胚層的所有細胞類型，是具有最強增殖和分化潛能的干細胞。在特定誘導因子作用下，ESCs可分化為SCs。Ziegler等[13]用PA6基質細胞與ESCs共培養促進ESCs形成神經微球，4周后用含bFGF、神經調節蛋白1（neuregulin 1，NRG-1）等物質的誘導液作用8周，促使神經微球向SCs分化。誘導后的細胞表達GFAP、S-100、HNK1、P75、髓鞘堿性蛋白和周圍髓鞘蛋白22等SCs表面標記。Cui等[14]將ESCs誘導為神經元前體細胞（neuronal precursors cells，NPCs），再植入去除了神經內部纖維組織、僅保留10 mm神經外膜的大鼠坐骨神經；術后3 個月，移植至神經外膜內的ESCs誘導的NPCs存活良好并分化為SCs，缺損區域有新生軸突形成。ESCs雖具有最強分化能力，但存在無法抑制的增殖能力，移植至體內可能引起畸胎瘤；另外，ESCs獲取困難且有倫理學問題，同時同種異體移植引起免疫排斥反應等方面限制了其廣泛應用[15]。
2.2 誘導多能干細胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）
iPSCs是指采用細胞核重編程技術激活體細胞中特定基因，如Oct3/4、SOX2、c-Myc、KLF4或Oct3/4、SOX2、Nanog、Lin28等，從而使體細胞去分化為多能干細胞[16]。iPSCs不僅在細胞形態、生長特性及干細胞標志物表達等方面與ESCs非常相似，而且在DNA甲基化方式、基因表達譜及染色質狀態等方面與ESCs幾乎完全相同。由于iPSCs來源于機體的體細胞，避免了同種異體間免疫排斥反應和倫理學問題，在組織工程神經構建方面具有很大應用價值。Wang等[17]將iPSCs分化為神經嵴干細胞（neural crest stem cells，NCSCs），并進一步誘導分化為SCs，誘導后的iPSCs表達SCs表面標記物，如髓磷脂蛋白、P75、HNK1和AP2等；將分化形成的SCs植入納米纖維神經導管修復大鼠坐骨神經12 mm缺損，結果顯示由iPSCs誘導分化的SCs能夠顯著加強軸突再生并包繞軸突形成髓鞘。Ikeda等[18]將iPSCs誘導分化為含有神經干細胞（neural stem cells，NSCs）/神經前體細胞的神經球，再植入可吸收神經導管并局部注入bFGF，橋接大鼠坐骨神經5 mm缺損，結果顯示含有iPSCs和bFGF的神經導管能顯著促進周圍神經再生及下肢功能恢復。雖然iPSCs的研究取得了很大突破，但仍存在很多不足，如誘導體細胞重編程的分子機制尚未知、iPSCs的制備效率低及iPSCs可能會導致腫瘤發生等，這些都是亟待解決的問題。
2.3 MSCs
MSCs來源于胚胎發育早期的中胚層，是一種具有自我更新能力和多向分化潛能的成體干細胞，主要存在于骨髓、脂肪、臍帶、臍血、肌肉和羊水中。一般認為MSCs主要分化為中胚層細胞譜系，如肌肉細胞、骨細胞、脂肪細胞和軟骨細胞等[19]。但在特定誘導因子作用下，也可分化為少突膠質細胞、皮膚細胞、心肌細胞、內皮細胞和SCs等非中胚層細胞譜系[20-21]。將骨髓中分離獲得的BMSCs培養于含β-羥基乙醇、維甲酸、bFGF、PDGF、調蛋白1和Forskolin等成分的誘導液中，可分化為能表達S-100、GFAP和P75等標志物的SCs樣細胞[22]。Ao等[23]從大鼠骨髓中獲得BMSCs，誘導分化為SCs并植入殼聚糖神經導管，修復大鼠坐骨神經12 mm缺損；術后3個月，大鼠小腿周徑、坐骨神經傳導速度、再生髓鞘范圍和再生軸突數量均較單純材料有顯著提高。Yang等[24]將絲心蛋白神經導管和MSCs復合，結果表明MSCs能上調S-100蛋白的表達，并產生BDNF。Xue 等[25]從犬骨髓中分離獲得BMSCs，植入羥基乙酸共聚物（polylactic-co-glycolic acid，PLGA）神經導管，修復犬坐骨神經60 mm缺損，結果表明其療效與自體神經移植相當，且顯著優于單純材料。Shen等[26]從脂肪組織中分離出MSCs，并誘導為SCs樣細胞，植入京尼平-明膠-磷酸三鈣神經導管，修復大鼠坐骨神經10 mm缺損；術后1個月，組織學及免疫組織化學等觀察均顯示再生神經纖維的形態、分布與自體神經纖維相似。此外，從臍血和羊水中分離獲得的MSCs，在特定誘導條件下也可分化為SCs樣細胞[27-29]。總之，不同組織來源的MSCs均能分化為SCs樣細胞，植入神經導管可修復周圍神經缺損。MSCs因具有豐富來源，在組織工程神經構建中具有重要應用價值。
2.4 NSCs
NSCs來源于胚胎外胚層和腦組織等，作為神經系統的多能干細胞，可分化為神經元、星形角質細胞、少突角質細胞和SCs等。NSCs的發現打破了神經元不會再生的傳統觀念。研究表明，NSCs移植至周圍神經缺損部位后，可向SCs分化并形成髓鞘。Tong等[30]從大鼠腦組織中分離獲得NSCs，體外擴增后用含Forskolin、NRG-1、bFGF、PDGF-AA和全反式視黃酸等成分的誘導液處理，細胞表現出SCs的形態，并表達SCs特異性標記物P75和S-100等；將分化而來的SCs與NG108-15運動神經元共培養，SCs可顯著增加NG108-15運動神經元數量并促進其軸突生長。Liard等[31]認為植入靜脈導管的NSCs可以增強2’，3’-環腺苷酸-3’-磷酸二酯酶的表達，激活局部SCs，從而加強周圍神經再生。Xu等[32]從胎鼠的腦組織中分離獲得NSCs，擴增至5 ×105個/mL密度后再植入硅膠導管，修復大鼠坐骨神經10 mm缺損，用NGF和生理鹽水植入神經導管作為對照組；8周后，與對照組相比，實驗組能顯著增強軸突再生并增加再生髓鞘數量，SFI評分和坐骨神經傳導速度明顯優于對照組，提示大鼠下肢功能明顯提高。盡管NSCs可分化為SCs，但來源于胎兒或成體的NSCs具有取材及擴增困難、培養周期長等缺點，因而如何促進分離的NSCs擴增并避免老化是目前需克服的主要問題。
2.5 嗅鞘細胞（olfactory ensheathing cells，OECs）
OECs來源于嗅基板，是一種嗅神經的支持細胞，在中樞、外周神經系統均有分布。因其終身具有神經再生功能且能釋放各種神經營養因子、神經黏附分子等，被廣泛應用于脊髓損傷的治療。OECs和SCs在表型上有許多共同點，也可促進軸突再生，因此可用于周圍神經損傷的修復。Li等[33]將OECs植入PLGA神經導管，修復大鼠坐骨神經10 mm缺損，發現OECs沿軸突遷徙并存活較長時間，缺損部位遠側端再生神經纖維和脊髓前角神經元數量均明顯提高，再生髓鞘厚度增加，神經傳導速度及遠端肌肉組織動作電位均改善，但坐骨神經功能指數無明顯變化。Radtke等[34]總結了OECs在周圍神經缺損中的應用，認為OECs一方面可通過促進SCs增殖，間接促進周圍神經缺損修復；另一方面用GFP標記OECs后整合至損傷部位，發現OECs數量增多并直接促進軸突再生。建議未來更多研究集中于將OECs植入可吸收神經導管來加強受損神經的再生。
2.6 NCSCs
NCSCs即外周神經系統干細胞，起源于胚胎期的神經管背側，與中樞神經系統干細胞在形態學上有顯著不同；其可表達低親和力的P75神經營養因子受體，而不能分化為少突角質細胞。目前已確認，NCSCs可分化為SCs的前體細胞，并進一步分化為未成熟的SCs，最后分化為能形成髓鞘的SCs。Liu等[35]將人ESCs和iPSCs體外培養于含50%NSCs的培養基（包括MEM非必需氨基酸、戊二腈、B27和20 ng/ mL FGF-2）和50%PA6基質細胞系條件培養基（包含抗壞血酸和Rock抑制劑），4 d后用FACS系統可分離出NCSCs，分離出的NCSCs表達P75、SOX9、SOX10、CD44和HNK1等NCSCs表面標記物。來自于ESCs的NCSCs，在含有20 ng/mL NGF-β1的誘導液作用下可分化為表達S-100、P75和GFAP的SCs；在含有B27、BDNF、抗壞血酸、NGF和雙丁酰環酰甘酸的作用下，可分化為神經元；在成骨、成軟骨和成脂誘導液作用下，可分別向成骨細胞、軟骨細胞和脂肪細胞等非神經系統方向分化。Lin等[36]從大鼠毛囊處分離獲得的NCSCs，分別在含音猬因子/維甲酸和NRG-1的誘導液作用下，可分化為神經元和SCs；再將分化形成的SCs植入脫細胞異種神經導管，橋接修復大鼠坐骨神經4 cm缺損，結果顯示誘導分化形成的SCs能通過釋放神經營養因子促進軸突再生；其中NCSCs起“中繼站”的作用，一方面接受神經元傳遞的神經沖動，另一方面通過自身軸突將信號傳遞至相應受體，這種方式可彌補遠端肌肉的組織失神經化并減少肌肉萎 縮。
2.7 毛囊干細胞（hair follicle stem cells，HFSCs）
HFSCs定位于毛囊隆突部，具有慢周期性、未分化、自我更新及體外增殖能力強等成體干細胞特性，并表達CD34、角蛋白15（cytokeratin 15，CK15）、CK19和巢蛋白等表面標記，在特定誘導條件下可分化為神經元、平滑肌細胞、SCs和黑素細胞等[37]。研究表明[38]，將大鼠HFSCs植入坐骨神經缺損處，可促進軸突再生并恢復局部神經功能，同時HFSCs可分化為類SCs。Yu等[39]研究表明，人HFSCs表達ESCs表面標記Nanog和Oct4，也可分化為神經元、平滑肌細胞和黑色素細胞等。Amoh等[40]從人類毛囊處分離出HFSCs，培養于含B27、1%甲基纖維素和bFGF的DMEM/F12中，然后植入裸鼠坐骨神經損傷處，術后8 周HFSCs分化為表達GFAP的SCs，分化形成的SCs能夠在表達β3-微觀蛋白的再生軸突周圍形成髓鞘；電刺激裸鼠腓腸肌可引起功能性收縮。HFSCs作為組織工程神經的種子細胞具有易于獲得、培養和擴增，具有多向分化潛能及無倫理限制等優點，在組織工程神經構建領域具有廣闊應用前景。
3 基因修飾細胞（genetically modified cells，GMCs）
GMCs是神經組織工程研究領域熱點之一，通過基因轉染技術將目的基因導入SCs或干細胞等，然后將表達目的基因的種子細胞植入神經導管來橋接周圍神經缺損，從而提高目的基因所介導的營養因子釋放。研究表明，外源性FGF-2、NT-3、BDNF、GDNF等細胞因子的加入可促進軸突再生，通過基因轉染技術促進種子細胞自身分泌此類細胞因子[41]。Li等[42]用逆轉錄病毒修飾大鼠SCs的GDNF基因，橋接其坐骨神經10 mm缺損，結果顯示將GDNF基因修飾的SCs移植于周圍神經，能顯著促進局部GDNF相關mRNA表達，增加GDNF釋放，這種促進作用可維持6周，術后2周GDNF數量達高峰；同時基因修飾的SCs能增加再生髓鞘數量并促進大鼠下肢功能恢復。Timmer等[43]從新生大鼠坐骨神經中分離出SCs，以逆轉錄病毒轉染方法采用FGF-2基因修飾SCs，使其過表達FGF-2蛋白，將FGF-2基因修飾的SCs植入硅膠導管，橋接修復大鼠坐骨神經15 mm缺損；術后4周，FGF-2基因修飾的SCs聯合硅膠導管能顯著加強軸突再生，并增加神經纖維數量。Haastert等[44]用類似方法修飾大鼠SCs的FGF-2亞型基因，并植入硅膠導管橋接修復大鼠坐骨神經15 mm缺損，結果顯示FGF-2亞型基因修飾的SCs聯合硅膠導管可促進大鼠坐骨神經感覺功能恢復。施新革等[45]采用陽離子脂質法將NT-3基因轉入SCs，并植入細胞外基質（extracellular matrix，ECM）凝膠PLGA神經導管橋接修復大鼠坐骨神經10 mm缺損；術后12周，在運動神經傳導速度、軸突數、髓鞘厚度、神經纖維直徑、神經組織面積百分比等方面，NT-3基因修飾的SCs-ECM凝膠PLGA管橋接組優于未被NT-3基因修飾的SCs-ECM凝膠PLGA管橋接組和單純NT-3聯合ECM凝膠PLGA管橋接組。鄭明輝等[46]認為基因修飾的BMSCs也能加強周圍神經損傷修復。他們從大鼠骨髓中分離獲得BMSCs，利用慢病毒載體轉染方法制備BDNF基因修飾的BMSCs；將60只成年SD大鼠制備右側坐骨神經損傷模型，隨機分為3 組，在損傷處分別注射PBS（PBS組）、BMSCs混懸液（BMSCs組）和BDNF基因修飾的BMSCs（基因修飾組）混懸液各2 μL，術后2、4周辣根過氧化物酶示蹤結果顯示基因修飾組損傷側L4、5脊髓前角細胞的存活數量多于PBS組和MSCs組，且神經功能恢復也較好。GMCs可選擇性增強細胞因子的釋放，在周圍神經缺損修復中具有巨大優勢。
4 小結與展望
既往研究已表明SCs在周圍神經損傷修復過程中發揮重要作用。大鼠SCs在神經調節蛋白和Forskolin作用下，體外擴增后仍具有促進軸突再生能力；但人SCs體外擴增后部分功能會發生改變。Levi等[7]研究表明人SCs擴增5代后，其髓鞘形成及促進軸突再生能力會下降。因此，在應用SCs修復周圍神經缺損前，應首先檢驗SCs的髓鞘形成能力，同時調整培養、誘導方案。使SCs在擴增后仍保持促進軸突再生能力是未來研究重點之一。多種干細胞可分化為SCs并促進軸突再生，但經誘導而來的SCs修復周圍神經缺損能力不如自體SCs。因此干細胞向SCs分化的具體機制、如何提高干細胞誘導率以及如何維持誘導而來SCs的功能穩定性，需要進一步探索。GMCs是基因工程和細胞工程的結合產物，具有廣闊應用前景，在基因層面改變細胞特性，促進細胞釋放某種或幾種營養因子，加強修飾細胞的功能，可顯著促進周圍神經再生。另一方面，支架材料作為組織工程的重要組成部分，如何研發能夠刺激神經再生的人工材料與生物工程材料成為該領域的重要組成部分。在新材料不斷被發現的同時，神經導管的加工工藝已成為新的研究熱點。理想的神經導管應類似于神經的結構，并向導管內引入SCs、干細胞或GMCs以引導神經再生。加入神經營養因子可顯著促進神經在管道內的生長，甚至可形成類似于神經外膜、內膜或束膜的結構，以更好地發揮其功能。干細胞技術的發展、基因修飾技術的成熟以及新型神經導管材料的研發，將進一步推動組織工程神經的臨床應用。
周圍神經缺損修復重建是臨床難題之一，其修復過程復雜，療效往往欠佳。自體神經移植是首選治療方法，但存在供體神經來源受限、殘留供區感覺功能障礙和增加供區創傷的缺點[1]。組織工程神經作為自體神經移植替代物已成為研究熱點。采用組織工程技術構建組織工程神經主要涉及種子細胞、神經營養因子和神經導管材料3個方面，其中種子細胞是該項技術的首要環節和基本要素。既往研究表明，單純使用神經導管修復大鼠坐骨神經缺損的最大長度為13 mm[2]，靈長類動物正中神經和尺神經缺損的最大修復長度分別為20 mm和30 mm[3]；臨床上對于人周圍神經損傷，超過60 mm的缺損修復效果往往較差[4]。但是當在神經導管中植入雪旺細胞（Schwann cells，SCs）或干細胞時，可大大延長修復長度。本文對種子細胞在組織工程神經中的研究現狀及應用前景作一綜述。
1 SCs
1.1 SCs在神經再生中的作用
SCs沿神經元突起分布，具有以下生物學功能：傳導神經沖動、促進神經軸突生長、分泌神經營養因子和調節神經突觸活性等。神經受損后，損傷神經遠側端SCs分泌大量促軸突再生的營養物質，如NGF、腦源性神經營養因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）、角質細胞源神經營養因子（glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF）、神經營養因子3（neurotrophin 3，NT-3）、FGF等；此外，SCs還能分泌趨化因子，包括IL-1β、白細胞抑制因子和單核細胞趨化蛋白1等，吸引巨噬細胞到達損傷部位。在損傷神經遠側端，SCs去分化而重新獲得分裂和增殖功能，形成柱狀結構作為軸突再生的支架，為軸突再生提供適宜微環境；隨后包繞新生軸突形成髓鞘，最終受損神經完成結構和功能的修復重建[5]。
1.2 SCs在構建組織工程神經中的應用
1991年，Morrissey等[6]從成年人膈神經中成功分離出SCs。隨后，Levi等[7]利用毛喉素（Forskolin）抑制成纖維細胞，并加入外源性分裂素刺激成年人SCs增殖，2周后可獲得純度達99.9%的SCs，增殖后的SCs能形成髓鞘，提示SCs可作為合適的種子細胞應用于周圍神經損傷修復。
研究表明[8]，SCs植入神經導管可提高軸突再生能力。Mosahebi等[9]以逆轉錄病毒為載體，用lacZ基因轉染擴增后的SCs，再將轉染后的SCs植入神經導管修復大鼠坐骨神經10 mm缺損；4周后，90%SCs表達lacZ基因并保持持續增殖狀態，角質纖維酸性蛋白（glibal fibrillary acidic protein，GFAP）、P75、主要組織相容性抗原（major histocompatibility complex，MHC）-Ⅰ和MHC-Ⅱ等SCs標記物表達無明顯變化，體內實驗表明SCs能顯著促進軸突再生。Berrocal等[10]用綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）標記從大鼠坐骨神經分離的SCs后，將其以細胞密度2 ×105個/mL植入可吸收膠原導管，修復大鼠坐骨神經13 mm缺損；術后12周，與單純膠原導管組比較，實驗組有髓神經再生軸突數量及范圍均擴大，步態分析及坐骨神經功能指數（sciatic nerve function index，SFI）評分均顯示大鼠下肢功能顯著提高。Zarbakhsh等[11]從大鼠坐骨神經和骨髓中分離出SCs和BMSCs，再將兩種細胞分別植入硅膠/纖維蛋白神經導管橋接大鼠坐骨神經10 mm缺損；結果顯示二者均能加強軸突再生，但SCs效果優于BMSCs。盡管SCs和神經導管聯合應用能加強周圍神經缺損修復，但自體SCs仍存在來源有限、自我增殖能力差、供區創傷等不足；而同種異體來源的SCs常引起免疫排斥反應。因此，擴大SCs來源、抑制同種異體SCs的免疫排斥反應及保持SCs功能穩定性等有待進一步研究。
2 干細胞
雖然SCs在神經再生和修復中具有重要作用，但其為終末期細胞，存在增殖能力差、體外分離培養困難、功能隨傳代次數增加而下降、需二次手術等缺點，不能完全滿足種子細胞的需求。干細胞是一種具有多向分化潛能的處于相對未分化狀態的細胞，可分化為成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞和肌細胞等。在特定誘導條件下，干細胞也可分化為表達S-100蛋白、GFAP和P75等SCs標記物的SCs樣細胞。研究表明已分化的干細胞可促進軸突再生[12]。
2.1 胚胎干細胞（embryonic stem cells，ESCs）
ESCs是位于胚胎發育早期囊胚內細胞團中的細胞，具有無限增殖、自我更新和多向分化特征，幾乎可分化為外胚層、中胚層和內胚層3種胚層的所有細胞類型，是具有最強增殖和分化潛能的干細胞。在特定誘導因子作用下，ESCs可分化為SCs。Ziegler等[13]用PA6基質細胞與ESCs共培養促進ESCs形成神經微球，4周后用含bFGF、神經調節蛋白1（neuregulin 1，NRG-1）等物質的誘導液作用8周，促使神經微球向SCs分化。誘導后的細胞表達GFAP、S-100、HNK1、P75、髓鞘堿性蛋白和周圍髓鞘蛋白22等SCs表面標記。Cui等[14]將ESCs誘導為神經元前體細胞（neuronal precursors cells，NPCs），再植入去除了神經內部纖維組織、僅保留10 mm神經外膜的大鼠坐骨神經；術后3 個月，移植至神經外膜內的ESCs誘導的NPCs存活良好并分化為SCs，缺損區域有新生軸突形成。ESCs雖具有最強分化能力，但存在無法抑制的增殖能力，移植至體內可能引起畸胎瘤；另外，ESCs獲取困難且有倫理學問題，同時同種異體移植引起免疫排斥反應等方面限制了其廣泛應用[15]。
2.2 誘導多能干細胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）
iPSCs是指采用細胞核重編程技術激活體細胞中特定基因，如Oct3/4、SOX2、c-Myc、KLF4或Oct3/4、SOX2、Nanog、Lin28等，從而使體細胞去分化為多能干細胞[16]。iPSCs不僅在細胞形態、生長特性及干細胞標志物表達等方面與ESCs非常相似，而且在DNA甲基化方式、基因表達譜及染色質狀態等方面與ESCs幾乎完全相同。由于iPSCs來源于機體的體細胞，避免了同種異體間免疫排斥反應和倫理學問題，在組織工程神經構建方面具有很大應用價值。Wang等[17]將iPSCs分化為神經嵴干細胞（neural crest stem cells，NCSCs），并進一步誘導分化為SCs，誘導后的iPSCs表達SCs表面標記物，如髓磷脂蛋白、P75、HNK1和AP2等；將分化形成的SCs植入納米纖維神經導管修復大鼠坐骨神經12 mm缺損，結果顯示由iPSCs誘導分化的SCs能夠顯著加強軸突再生并包繞軸突形成髓鞘。Ikeda等[18]將iPSCs誘導分化為含有神經干細胞（neural stem cells，NSCs）/神經前體細胞的神經球，再植入可吸收神經導管并局部注入bFGF，橋接大鼠坐骨神經5 mm缺損，結果顯示含有iPSCs和bFGF的神經導管能顯著促進周圍神經再生及下肢功能恢復。雖然iPSCs的研究取得了很大突破，但仍存在很多不足，如誘導體細胞重編程的分子機制尚未知、iPSCs的制備效率低及iPSCs可能會導致腫瘤發生等，這些都是亟待解決的問題。
2.3 MSCs
MSCs來源于胚胎發育早期的中胚層，是一種具有自我更新能力和多向分化潛能的成體干細胞，主要存在于骨髓、脂肪、臍帶、臍血、肌肉和羊水中。一般認為MSCs主要分化為中胚層細胞譜系，如肌肉細胞、骨細胞、脂肪細胞和軟骨細胞等[19]。但在特定誘導因子作用下，也可分化為少突膠質細胞、皮膚細胞、心肌細胞、內皮細胞和SCs等非中胚層細胞譜系[20-21]。將骨髓中分離獲得的BMSCs培養于含β-羥基乙醇、維甲酸、bFGF、PDGF、調蛋白1和Forskolin等成分的誘導液中，可分化為能表達S-100、GFAP和P75等標志物的SCs樣細胞[22]。Ao等[23]從大鼠骨髓中獲得BMSCs，誘導分化為SCs并植入殼聚糖神經導管，修復大鼠坐骨神經12 mm缺損；術后3個月，大鼠小腿周徑、坐骨神經傳導速度、再生髓鞘范圍和再生軸突數量均較單純材料有顯著提高。Yang等[24]將絲心蛋白神經導管和MSCs復合，結果表明MSCs能上調S-100蛋白的表達，并產生BDNF。Xue 等[25]從犬骨髓中分離獲得BMSCs，植入羥基乙酸共聚物（polylactic-co-glycolic acid，PLGA）神經導管，修復犬坐骨神經60 mm缺損，結果表明其療效與自體神經移植相當，且顯著優于單純材料。Shen等[26]從脂肪組織中分離出MSCs，并誘導為SCs樣細胞，植入京尼平-明膠-磷酸三鈣神經導管，修復大鼠坐骨神經10 mm缺損；術后1個月，組織學及免疫組織化學等觀察均顯示再生神經纖維的形態、分布與自體神經纖維相似。此外，從臍血和羊水中分離獲得的MSCs，在特定誘導條件下也可分化為SCs樣細胞[27-29]。總之，不同組織來源的MSCs均能分化為SCs樣細胞，植入神經導管可修復周圍神經缺損。MSCs因具有豐富來源，在組織工程神經構建中具有重要應用價值。
2.4 NSCs
NSCs來源于胚胎外胚層和腦組織等，作為神經系統的多能干細胞，可分化為神經元、星形角質細胞、少突角質細胞和SCs等。NSCs的發現打破了神經元不會再生的傳統觀念。研究表明，NSCs移植至周圍神經缺損部位后，可向SCs分化并形成髓鞘。Tong等[30]從大鼠腦組織中分離獲得NSCs，體外擴增后用含Forskolin、NRG-1、bFGF、PDGF-AA和全反式視黃酸等成分的誘導液處理，細胞表現出SCs的形態，并表達SCs特異性標記物P75和S-100等；將分化而來的SCs與NG108-15運動神經元共培養，SCs可顯著增加NG108-15運動神經元數量并促進其軸突生長。Liard等[31]認為植入靜脈導管的NSCs可以增強2’，3’-環腺苷酸-3’-磷酸二酯酶的表達，激活局部SCs，從而加強周圍神經再生。Xu等[32]從胎鼠的腦組織中分離獲得NSCs，擴增至5 ×105個/mL密度后再植入硅膠導管，修復大鼠坐骨神經10 mm缺損，用NGF和生理鹽水植入神經導管作為對照組；8周后，與對照組相比，實驗組能顯著增強軸突再生并增加再生髓鞘數量，SFI評分和坐骨神經傳導速度明顯優于對照組，提示大鼠下肢功能明顯提高。盡管NSCs可分化為SCs，但來源于胎兒或成體的NSCs具有取材及擴增困難、培養周期長等缺點，因而如何促進分離的NSCs擴增并避免老化是目前需克服的主要問題。
2.5 嗅鞘細胞（olfactory ensheathing cells，OECs）
OECs來源于嗅基板，是一種嗅神經的支持細胞，在中樞、外周神經系統均有分布。因其終身具有神經再生功能且能釋放各種神經營養因子、神經黏附分子等，被廣泛應用于脊髓損傷的治療。OECs和SCs在表型上有許多共同點，也可促進軸突再生，因此可用于周圍神經損傷的修復。Li等[33]將OECs植入PLGA神經導管，修復大鼠坐骨神經10 mm缺損，發現OECs沿軸突遷徙并存活較長時間，缺損部位遠側端再生神經纖維和脊髓前角神經元數量均明顯提高，再生髓鞘厚度增加，神經傳導速度及遠端肌肉組織動作電位均改善，但坐骨神經功能指數無明顯變化。Radtke等[34]總結了OECs在周圍神經缺損中的應用，認為OECs一方面可通過促進SCs增殖，間接促進周圍神經缺損修復；另一方面用GFP標記OECs后整合至損傷部位，發現OECs數量增多并直接促進軸突再生。建議未來更多研究集中于將OECs植入可吸收神經導管來加強受損神經的再生。
2.6 NCSCs
NCSCs即外周神經系統干細胞，起源于胚胎期的神經管背側，與中樞神經系統干細胞在形態學上有顯著不同；其可表達低親和力的P75神經營養因子受體，而不能分化為少突角質細胞。目前已確認，NCSCs可分化為SCs的前體細胞，并進一步分化為未成熟的SCs，最后分化為能形成髓鞘的SCs。Liu等[35]將人ESCs和iPSCs體外培養于含50%NSCs的培養基（包括MEM非必需氨基酸、戊二腈、B27和20 ng/ mL FGF-2）和50%PA6基質細胞系條件培養基（包含抗壞血酸和Rock抑制劑），4 d后用FACS系統可分離出NCSCs，分離出的NCSCs表達P75、SOX9、SOX10、CD44和HNK1等NCSCs表面標記物。來自于ESCs的NCSCs，在含有20 ng/mL NGF-β1的誘導液作用下可分化為表達S-100、P75和GFAP的SCs；在含有B27、BDNF、抗壞血酸、NGF和雙丁酰環酰甘酸的作用下，可分化為神經元；在成骨、成軟骨和成脂誘導液作用下，可分別向成骨細胞、軟骨細胞和脂肪細胞等非神經系統方向分化。Lin等[36]從大鼠毛囊處分離獲得的NCSCs，分別在含音猬因子/維甲酸和NRG-1的誘導液作用下，可分化為神經元和SCs；再將分化形成的SCs植入脫細胞異種神經導管，橋接修復大鼠坐骨神經4 cm缺損，結果顯示誘導分化形成的SCs能通過釋放神經營養因子促進軸突再生；其中NCSCs起“中繼站”的作用，一方面接受神經元傳遞的神經沖動，另一方面通過自身軸突將信號傳遞至相應受體，這種方式可彌補遠端肌肉的組織失神經化并減少肌肉萎 縮。
2.7 毛囊干細胞（hair follicle stem cells，HFSCs）
HFSCs定位于毛囊隆突部，具有慢周期性、未分化、自我更新及體外增殖能力強等成體干細胞特性，并表達CD34、角蛋白15（cytokeratin 15，CK15）、CK19和巢蛋白等表面標記，在特定誘導條件下可分化為神經元、平滑肌細胞、SCs和黑素細胞等[37]。研究表明[38]，將大鼠HFSCs植入坐骨神經缺損處，可促進軸突再生并恢復局部神經功能，同時HFSCs可分化為類SCs。Yu等[39]研究表明，人HFSCs表達ESCs表面標記Nanog和Oct4，也可分化為神經元、平滑肌細胞和黑色素細胞等。Amoh等[40]從人類毛囊處分離出HFSCs，培養于含B27、1%甲基纖維素和bFGF的DMEM/F12中，然后植入裸鼠坐骨神經損傷處，術后8 周HFSCs分化為表達GFAP的SCs，分化形成的SCs能夠在表達β3-微觀蛋白的再生軸突周圍形成髓鞘；電刺激裸鼠腓腸肌可引起功能性收縮。HFSCs作為組織工程神經的種子細胞具有易于獲得、培養和擴增，具有多向分化潛能及無倫理限制等優點，在組織工程神經構建領域具有廣闊應用前景。
3 基因修飾細胞（genetically modified cells，GMCs）
GMCs是神經組織工程研究領域熱點之一，通過基因轉染技術將目的基因導入SCs或干細胞等，然后將表達目的基因的種子細胞植入神經導管來橋接周圍神經缺損，從而提高目的基因所介導的營養因子釋放。研究表明，外源性FGF-2、NT-3、BDNF、GDNF等細胞因子的加入可促進軸突再生，通過基因轉染技術促進種子細胞自身分泌此類細胞因子[41]。Li等[42]用逆轉錄病毒修飾大鼠SCs的GDNF基因，橋接其坐骨神經10 mm缺損，結果顯示將GDNF基因修飾的SCs移植于周圍神經，能顯著促進局部GDNF相關mRNA表達，增加GDNF釋放，這種促進作用可維持6周，術后2周GDNF數量達高峰；同時基因修飾的SCs能增加再生髓鞘數量并促進大鼠下肢功能恢復。Timmer等[43]從新生大鼠坐骨神經中分離出SCs，以逆轉錄病毒轉染方法采用FGF-2基因修飾SCs，使其過表達FGF-2蛋白，將FGF-2基因修飾的SCs植入硅膠導管，橋接修復大鼠坐骨神經15 mm缺損；術后4周，FGF-2基因修飾的SCs聯合硅膠導管能顯著加強軸突再生，并增加神經纖維數量。Haastert等[44]用類似方法修飾大鼠SCs的FGF-2亞型基因，并植入硅膠導管橋接修復大鼠坐骨神經15 mm缺損，結果顯示FGF-2亞型基因修飾的SCs聯合硅膠導管可促進大鼠坐骨神經感覺功能恢復。施新革等[45]采用陽離子脂質法將NT-3基因轉入SCs，并植入細胞外基質（extracellular matrix，ECM）凝膠PLGA神經導管橋接修復大鼠坐骨神經10 mm缺損；術后12周，在運動神經傳導速度、軸突數、髓鞘厚度、神經纖維直徑、神經組織面積百分比等方面，NT-3基因修飾的SCs-ECM凝膠PLGA管橋接組優于未被NT-3基因修飾的SCs-ECM凝膠PLGA管橋接組和單純NT-3聯合ECM凝膠PLGA管橋接組。鄭明輝等[46]認為基因修飾的BMSCs也能加強周圍神經損傷修復。他們從大鼠骨髓中分離獲得BMSCs，利用慢病毒載體轉染方法制備BDNF基因修飾的BMSCs；將60只成年SD大鼠制備右側坐骨神經損傷模型，隨機分為3 組，在損傷處分別注射PBS（PBS組）、BMSCs混懸液（BMSCs組）和BDNF基因修飾的BMSCs（基因修飾組）混懸液各2 μL，術后2、4周辣根過氧化物酶示蹤結果顯示基因修飾組損傷側L4、5脊髓前角細胞的存活數量多于PBS組和MSCs組，且神經功能恢復也較好。GMCs可選擇性增強細胞因子的釋放，在周圍神經缺損修復中具有巨大優勢。
4 小結與展望
既往研究已表明SCs在周圍神經損傷修復過程中發揮重要作用。大鼠SCs在神經調節蛋白和Forskolin作用下，體外擴增后仍具有促進軸突再生能力；但人SCs體外擴增后部分功能會發生改變。Levi等[7]研究表明人SCs擴增5代后，其髓鞘形成及促進軸突再生能力會下降。因此，在應用SCs修復周圍神經缺損前，應首先檢驗SCs的髓鞘形成能力，同時調整培養、誘導方案。使SCs在擴增后仍保持促進軸突再生能力是未來研究重點之一。多種干細胞可分化為SCs并促進軸突再生，但經誘導而來的SCs修復周圍神經缺損能力不如自體SCs。因此干細胞向SCs分化的具體機制、如何提高干細胞誘導率以及如何維持誘導而來SCs的功能穩定性，需要進一步探索。GMCs是基因工程和細胞工程的結合產物，具有廣闊應用前景，在基因層面改變細胞特性，促進細胞釋放某種或幾種營養因子，加強修飾細胞的功能，可顯著促進周圍神經再生。另一方面，支架材料作為組織工程的重要組成部分，如何研發能夠刺激神經再生的人工材料與生物工程材料成為該領域的重要組成部分。在新材料不斷被發現的同時，神經導管的加工工藝已成為新的研究熱點。理想的神經導管應類似于神經的結構，并向導管內引入SCs、干細胞或GMCs以引導神經再生。加入神經營養因子可顯著促進神經在管道內的生長，甚至可形成類似于神經外膜、內膜或束膜的結構，以更好地發揮其功能。干細胞技術的發展、基因修飾技術的成熟以及新型神經導管材料的研發，將進一步推動組織工程神經的臨床應用。