引用本文： 林強, 蔡楊庭, 李皓莘. 負載濃度梯度NGF的周圍神經導管修復大鼠周圍神經缺損的實驗研究. 中國修復重建外科雜志, 2014, 28(2): 167-172. doi: 10.7507/1002-1892.20140037 復制
周圍神經損傷是臨床常見的創傷并發癥，受損神經的再生及功能修復是臨床難題。近年來，應用組織工程技術構建具有良好生物相容性的周圍神經導管修復神經損傷，成為研究熱點[1]。研究表明，周圍神經導管上負載生長因子能顯著提高神經修復效果。在神經系統發育過程中，生長因子呈濃度梯度分布，形成一種空間或方向信號，引導軸突再生[2]。理論上，將生長因子呈濃度梯度負載于周圍神經導管上，更接近生理結構。為此，我們利用吸附絲蛋白/NGF的時間差異，制備負載濃度梯度NGF的周圍神經導管，并建立大鼠坐骨神經缺損模型，用該周圍神經導管橋接缺損神經，探討其修復效果，以期為臨床應用提供實驗依據。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
健康雄性成年SD大鼠24只，體重220～250 g，由中山大學實驗動物中心提供。B.mori蠶絲（浙江衢州市桑蠶協會）；聚己內酯-丙交酯嵌段共聚物[poly（ε-caprolactone）-block-poly（L-lactide-co-ε-caprolactone），PCL-b-P（LLA-co-CL）] 由廣州醫學院朱繼翔博士提供；四氫呋喃（廣州化學試劑廠）；NGF（PeproTech公司，美國）；ELISA試劑盒（Becton Dickinson公司，美國）。玻璃干燥器（四川蜀牛玻璃儀器廠）；微量注射泵（KD Scientific公司，美國）；Image J分析軟件（Bethesda公司，美國）；透射電鏡（Hitachi公司，日本）。
1.2 負載濃度梯度NGF的周圍神經導管制備及檢測
1.2.1 絲蛋白制備
稱取干燥蠶絲8 g，放入飽和Na2CO3溶液中煮沸，每3小時更換新鮮飽和Na2CO3 溶液1次，共3次；過濾，干燥，獲得純絲蛋白。將純絲蛋白溶解于LiBr（1 g/mL）水溶液中制得10%絲蛋白溶液，將絲蛋白溶液放入截留分子量為5 000的透析袋中，用超純水透析3 d；每半天更換透析液1次，除去LiBr；定容后獲得3%絲蛋白溶液，置于4℃冰箱備用[3]。
1.2.2 周圍神經導管制備
于55℃水浴條件下，將PCL-b-P（LLA-co-CL）溶解于四氫呋喃中，配制成6%溶液。將其注入內徑1.5 mm、外徑3.0 mm、長15 mm的圓柱形模具中；迅速降溫至- 40℃，凝膠化3 h；- 40℃無水乙醇浸泡，置換樣品中的四氫呋喃，每隔6 h更換1次無水乙醇，共6次；置于4℃去離子水浸泡，置換樣品中的無水乙醇，每隔6 h更換1次去離子水，共6次； - 20℃冷凍干燥5 d，取出后室溫真空干燥1 d，置于干燥器中備用[4]。
1.2.3 均勻負載NGF
取周圍神經導管置于無水乙醇中，真空（0.04 MPa）除氣1 h；PBS清洗3次，每次10 min，除去乙醇。將10 μg NGF溶解于1 mL 3%絲蛋白溶液中；將除氣后的周圍神經導管浸泡于含絲蛋白和NGF的混合溶液中，4℃、搖床40 r/min浸泡2 h； PBS清洗5 min；浸入90%甲醇溶液10 min；超純水清洗3次，每次5 min。獲得均勻負載NGF的周圍神經導管，備用[5]。
1.2.4 濃度梯度負載NGF
將10 μg NGF溶解于1 mL 3%絲蛋白溶液。取已除氣的周圍神經導管豎立固定于長10 mm、寬5 mm、高50 mm的玻璃器皿。使用微量注射泵將含有NGF的絲蛋白溶液按照3.2 μL/ min 注入玻璃器皿中，4 h后停止注射，此時液面稍沒過樣品上緣。取出導管，PBS清洗5 min；浸入90%甲醇溶液中 10 min； PBS清洗3次，每次5 min。獲得濃度梯度負載NGF的周圍神經導管，備用。
1.2.5 NGF釋放檢測
取均勻負載NGF和濃度梯度負載NGF的兩種周圍神經導管，平均切割成5段，每段3 mm。將樣品分別置于1 mL塑料試管中，加入400 μL PBS液。于37℃、搖床40 r/ min條件下，分別于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12周取PBS液，用ELISA試劑盒檢測NGF含量，取均值，并制作緩釋曲線，計算12周累積釋放量。各時間點均更換新鮮PBS 液。
1.3 實驗方法及分組
取24只SD大鼠，以10%水合氯醛（0.4 mL/ kg）腹腔注射麻醉后，于右下肢后部作斜形切口，長約20 mm。鈍性分離皮下，沿后外側肌間隙鈍性分離至閉孔處，顯露并切除5 mm長坐骨神經，使其自然回縮，制備14 mm長坐骨神經缺損模型。根據修復方法不同，將大鼠隨機分為A、B、C、D 4組（n=6）：分別采用單純周圍神經導管、均勻負載NGF的周圍神經導管、濃度梯度負載NGF的周圍神經導管、自體神經修復缺損。A、B、C組：將導管兩端套于坐骨神經兩斷端，每端套入長約 0.5 mm，采用9-0顯微縫合線固定1針，以防大鼠肢體活動時神經脫出導管。D組：采用9-0顯微縫線將切取的自體神經直接與兩斷端縫合修復。間斷縫合肌筋膜，縫合皮膚。
1.4 觀測指標
1.4.1 一般情況
術后觀察各組大鼠存活、切口愈合及肢體運動情況。
1.4.2 大體觀察
術后12周，各組大鼠同上法麻醉后，沿原切口入路顯露坐骨神經，大體觀察A、B、C組移植物形態及橋接的神經有無脫出。
1.4.3 電生理檢測
大體觀察后，用雙根銀絲刺激電極置于各組缺損橋接物近端神經干及腓總神經橫跨腓骨肌處，兩刺激電極間距為2 cm。同心針記錄雙電極45°斜行插入腓腸肌肌腹中部，記錄誘發的復合肌肉動作電位波幅；刺激強度750 mV，刺激頻率1 Hz，持續時間1 ms。同時測定健側腓腸肌的復合肌肉動作電位波幅，將各組結果與健側值進行比較，并以與健側值的百分比表示復合肌肉動作電位結果[6]。
1.4.4 組織學觀察
電生理檢測后取移植物和所支配的腓腸肌。將移植物置于2.5%戊二醛固定3 h，丙酮逐級脫水，Epon812環氧樹脂包埋劑與100%丙酮按1∶1比例浸泡包埋。取移植物中段先行半薄切片，片厚1 μm，常規甲苯胺藍溶液染色，光鏡下觀察軸突。于400倍鏡下，每組取5張切片，每張切片取5個視野，采用Image J分析軟件計數軸突，觀察再生的神經橫截面積，按以下公式計算軸突密度，軸突密度=軸突總數 /神經橫截面積）[7]。
將腓腸肌標本置入4%多聚甲醛固定5 h，30%蔗糖溶液脫水，OCT包埋后冰凍切片，行HE染色，光鏡下觀察肌肉及膠原纖維。于400倍鏡下，每組取5張切片，每張切片取5個視野，采用Image J分析軟件測量肌纖維橫截面積。
1.4.5 透射電鏡觀察
取1.4.4中切片再行超薄切片，片厚60 nm，用醋酸鈾及硝酸鉛雙重染色，透射電鏡觀察再生神經纖維超微結構。于5 800倍鏡下，每組取5 張切片，每張切片取10個視野，采用Image J分析軟件測量髓鞘厚度及軸突直徑，取均值。
1.5 統計學方法
采用SPSS13.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 NGF釋放檢測
隨著時間延長，兩種周圍神經導管NGF累積釋放量均不斷增加，各時間點兩組間比較差異均無統計學意義（P＞ 0.05），見圖 1。濃度梯度負載NGF和均勻負載NGF的導管12周內NGF累積釋放量分別為（14.2 ± 1.4）、（13.7 ± 1.3）ng/mg，兩組比較差異無統計學意義（t=0.564，P=0.570）。
圖1
兩種周圍神經導管NGF緩釋曲線 ? ?2.2 一般情況
大鼠切口均Ⅰ期愈合，存活至實驗完成。術后4 d各組大鼠均出現足底潰瘍，3周時最嚴重，之后逐漸愈合，至12周時足底潰瘍基本愈合；其中C、D組大鼠愈合情況優于A、B組。
2.3 大體觀察
術后12周，A、B、C組移植物貼附于一側肌肉，表面已完全血管化，有結締組織包裹，神經導管與坐骨神經兩端連接，未見神經瘤形成。見圖 2。
2.4 電生理檢測
術后12周，A、B、C、D組復合肌肉動作電位分別為25.1% ± 4.2%、42.3% ± 9.3%、57.1% ± 10.3%、62.1% ± 13.7 %。A組顯著低于B、C、D組，B組顯著低于C、D組，比較差異均有統計學意義（P＜ 0.05）；C、D組間比較，差異無統計學意義（P＞ 0.05）。
2.5 組織學觀察
2.5.1 移植物
術后12 周，甲苯胺藍染色示C、D組再生神經纖維形成大小不等的纖維束，神經纖維髓鞘化明顯；A、B組觀察結果與C、D組相似，但軸突分布較C、D組稀疏。見圖 3。D組軸突總數顯著高于A、B、C組，C組高于A、B組，B組高于A組，比較差異均有統計學意義（P＜ 0.05）。C組軸突密度顯著高于A、B、D組，B組高于A、D組，D組高于A組，比較差異均有統計學意義（P＜ 0.05）。見表 1。
表1
各組組織學及透射電鏡測量指標比較（n=6，2.5.2 腓腸肌
術后12周，Masson染色示D組肌纖維最粗、膠原纖維最細，之后為C、B組，而A組肌肉萎縮最嚴重，有大量膠原纖維增生。見圖 4。D組肌纖維橫截面積顯著高于A、B、C組，C組高于A、B組，B組高于A組，比較差異均有統計學意義（P＜ 0.05），見表 1。
2.6 透射電鏡觀察
術后12 周，透射電鏡下各組均可見再生有髓神經纖維和無髓纖維混合，雪旺細胞形態正常，包繞再生軸突形成有髓纖維，大多數髓鞘結構發育良好，呈同心圓板層樣結構，少數為未完全閉合的不成熟髓鞘。其中C、D組髓鞘較厚，排列整齊，新生神經纖維較密集，神經纖維基本發育成熟。而A、B組新生神經纖維數量較少，髓鞘厚度也略小于C、D組。見圖 5。
D組軸突直徑顯著高于A、B、C組，C組高于A、B組，B組高于A組，比較差異均有統計學意義（P＜ 0.05）。C、D組髓鞘厚度比較差異無統計學意義（P＞ 0.05），但均優于A、B組，差異有統計學意義（P＜ 0.05）；B組優于A組，差異有統計學意義（P＜ 0.05）。見表 1。
3 討論
目前，許多利用組織工程原理修復周圍神經損傷的效果仍不理想，主要原因是軸突生長缺乏方向性，在導管內彌漫生長[8]。在神經系統發育過程中，生長錐被多種生長因子引導，朝著靶向組織生長。這些因子被稱為趨化因子或趨觸因子，均呈濃度梯度分布[9]。這些呈濃度梯度分布的生長因子給予軸突生長一種空間或方向信號，能引導軸突再生[10]。如小鼠前腦的嗅球有中間神經元，其生于前腦亞室管膜層，需沿著頭端遷移渠道向前遷移幾毫米才能達到嗅球[11]。因此，構建組織工程神經支架時，除需負載生長因子，除需考慮長時間保持生長因子活性外，還需考慮將生長因子呈濃度梯度負載。
目前出現了一些濃度梯度負載生長因子至二維支架上的方法，如微流體法、擴散法、光雕刻法等[12-14]。但是將生長因子以濃度梯度負載至三維支架上，并用于體內實驗的報道較少。本實驗中利用吸附絲蛋白/NGF的時間差異，制備出了濃度梯度負載NGF的周圍神經導管。在進行梯度NGF負載時，變化的是吸附時間。支架靠近器皿底部的部分，由于接觸含有NGF的絲蛋白溶液時間長，所以吸附 的 NGF量多；而頂部由于接觸時間短，吸附的NGF量少。我們通過變化吸附時間，成功獲得濃度梯度負載NGF的周圍神經導管。
絲蛋白是從蠶絲中提取的天然生物材料，具有良好的生物相容性、降解速率及與組織生成相匹配等優點，在生物醫學領域有廣泛用途，目前已用于組織工程領域和藥物控釋領域[15-16]。絲蛋白擁有親水基團和疏水基團，在一定條件下，如低溫、甲醇等環境會發生蛋白的構象轉變，形成β-折疊，從溶于水變為不溶于水，同時將小分子蛋白包裹[17]；其在體內外降解速度慢，作為藥物載體時，藥物釋放時間長，因此用絲蛋白負載生長因子是一種溫和的方法[18]。本實驗中，當絲蛋白和NGF吸附在材料表面后，通過加入甲醇，使得絲蛋白形成β-折疊，從溶于水變為不溶于水，并固定在材料表面，同時也包裹了固定在材料表面的NGF。因此，NGF的釋放與絲蛋白降解有關，隨著絲蛋白的降解，被包裹住的NGF分子被釋放。由于絲蛋白具有較慢的降解速率，因此本實驗在體外12周時，仍能檢測到具有活性的NGF釋放。
體外研究表明，負載梯度信號的支架能引導并促進軸突生長[19]。其作用機制主要為：生長錐直徑改為10 μm，它能感受該直徑范圍內NGF的濃度[20]。當生長錐表面的絲狀偽足探測到外周導向分子（如NGF），微管就能優先沿該絲狀偽足內的肌動蛋白絲生長，整個軸突就會發生轉向反應[21]。同時，生長錐內不對稱的信號能引起肌動蛋白mRNA在生長因子濃度高的一側快速募集，通過激活轉錄因子調節分子eIF4B結合蛋白，迅速產生大量β-肌動蛋白，為軸突的生長提供充足原料，從而加快軸突生長速度[22]。但是負載濃度梯度信號的神經導管在體內是否能促進神經再生目前罕見報道。本實驗中，我們采用的是大鼠14 mm坐骨神經缺損模型，屬于長節段缺損，自行修復效果較差，因此能更好地顯示各種導管在體內的修復效果[23]。本實驗通過大體觀察、電生理檢測、組織學觀察及透射電鏡觀察，結果表明采用不同周圍神經導管修復后，再生的神經纖維均成功長入材料內，并穿過損傷區，成功支配肌肉。但在軸突總數、軸突密度、髓鞘厚度、軸突直徑、肌纖維面積及復合肌肉動作電位指標上，負載NGF的周圍神經導管優于單純周圍神經導管，而濃度梯度負載NGF的周圍神經導管則優于均勻負載NGF的周圍神經導管。其中采用濃度梯度負載NGF的周圍神經導管修復后，髓鞘厚度和軸突總數與自體神經修復相近，提示該導管在體內能更好地促進神經再生。
綜上述，本實驗利用絲蛋白差異吸附成功將NGF以濃度梯度方式負載至周圍神經導管上，體外釋放實驗提示NGF的活性能維持12周以上；體內實驗提示，濃度梯度負載NGF的周圍神經導管能有效促進神經再生。
周圍神經損傷是臨床常見的創傷并發癥，受損神經的再生及功能修復是臨床難題。近年來，應用組織工程技術構建具有良好生物相容性的周圍神經導管修復神經損傷，成為研究熱點[1]。研究表明，周圍神經導管上負載生長因子能顯著提高神經修復效果。在神經系統發育過程中，生長因子呈濃度梯度分布，形成一種空間或方向信號，引導軸突再生[2]。理論上，將生長因子呈濃度梯度負載于周圍神經導管上，更接近生理結構。為此，我們利用吸附絲蛋白/NGF的時間差異，制備負載濃度梯度NGF的周圍神經導管，并建立大鼠坐骨神經缺損模型，用該周圍神經導管橋接缺損神經，探討其修復效果，以期為臨床應用提供實驗依據。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
健康雄性成年SD大鼠24只，體重220～250 g，由中山大學實驗動物中心提供。B.mori蠶絲（浙江衢州市桑蠶協會）；聚己內酯-丙交酯嵌段共聚物[poly（ε-caprolactone）-block-poly（L-lactide-co-ε-caprolactone），PCL-b-P（LLA-co-CL）] 由廣州醫學院朱繼翔博士提供；四氫呋喃（廣州化學試劑廠）；NGF（PeproTech公司，美國）；ELISA試劑盒（Becton Dickinson公司，美國）。玻璃干燥器（四川蜀牛玻璃儀器廠）；微量注射泵（KD Scientific公司，美國）；Image J分析軟件（Bethesda公司，美國）；透射電鏡（Hitachi公司，日本）。
1.2 負載濃度梯度NGF的周圍神經導管制備及檢測
1.2.1 絲蛋白制備
稱取干燥蠶絲8 g，放入飽和Na2CO3溶液中煮沸，每3小時更換新鮮飽和Na2CO3 溶液1次，共3次；過濾，干燥，獲得純絲蛋白。將純絲蛋白溶解于LiBr（1 g/mL）水溶液中制得10%絲蛋白溶液，將絲蛋白溶液放入截留分子量為5 000的透析袋中，用超純水透析3 d；每半天更換透析液1次，除去LiBr；定容后獲得3%絲蛋白溶液，置于4℃冰箱備用[3]。
1.2.2 周圍神經導管制備
于55℃水浴條件下，將PCL-b-P（LLA-co-CL）溶解于四氫呋喃中，配制成6%溶液。將其注入內徑1.5 mm、外徑3.0 mm、長15 mm的圓柱形模具中；迅速降溫至- 40℃，凝膠化3 h；- 40℃無水乙醇浸泡，置換樣品中的四氫呋喃，每隔6 h更換1次無水乙醇，共6次；置于4℃去離子水浸泡，置換樣品中的無水乙醇，每隔6 h更換1次去離子水，共6次； - 20℃冷凍干燥5 d，取出后室溫真空干燥1 d，置于干燥器中備用[4]。
1.2.3 均勻負載NGF
取周圍神經導管置于無水乙醇中，真空（0.04 MPa）除氣1 h；PBS清洗3次，每次10 min，除去乙醇。將10 μg NGF溶解于1 mL 3%絲蛋白溶液中；將除氣后的周圍神經導管浸泡于含絲蛋白和NGF的混合溶液中，4℃、搖床40 r/min浸泡2 h； PBS清洗5 min；浸入90%甲醇溶液10 min；超純水清洗3次，每次5 min。獲得均勻負載NGF的周圍神經導管，備用[5]。
1.2.4 濃度梯度負載NGF
將10 μg NGF溶解于1 mL 3%絲蛋白溶液。取已除氣的周圍神經導管豎立固定于長10 mm、寬5 mm、高50 mm的玻璃器皿。使用微量注射泵將含有NGF的絲蛋白溶液按照3.2 μL/ min 注入玻璃器皿中，4 h后停止注射，此時液面稍沒過樣品上緣。取出導管，PBS清洗5 min；浸入90%甲醇溶液中 10 min； PBS清洗3次，每次5 min。獲得濃度梯度負載NGF的周圍神經導管，備用。
1.2.5 NGF釋放檢測
取均勻負載NGF和濃度梯度負載NGF的兩種周圍神經導管，平均切割成5段，每段3 mm。將樣品分別置于1 mL塑料試管中，加入400 μL PBS液。于37℃、搖床40 r/ min條件下，分別于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12周取PBS液，用ELISA試劑盒檢測NGF含量，取均值，并制作緩釋曲線，計算12周累積釋放量。各時間點均更換新鮮PBS 液。
1.3 實驗方法及分組
取24只SD大鼠，以10%水合氯醛（0.4 mL/ kg）腹腔注射麻醉后，于右下肢后部作斜形切口，長約20 mm。鈍性分離皮下，沿后外側肌間隙鈍性分離至閉孔處，顯露并切除5 mm長坐骨神經，使其自然回縮，制備14 mm長坐骨神經缺損模型。根據修復方法不同，將大鼠隨機分為A、B、C、D 4組（n=6）：分別采用單純周圍神經導管、均勻負載NGF的周圍神經導管、濃度梯度負載NGF的周圍神經導管、自體神經修復缺損。A、B、C組：將導管兩端套于坐骨神經兩斷端，每端套入長約 0.5 mm，采用9-0顯微縫合線固定1針，以防大鼠肢體活動時神經脫出導管。D組：采用9-0顯微縫線將切取的自體神經直接與兩斷端縫合修復。間斷縫合肌筋膜，縫合皮膚。
1.4 觀測指標
1.4.1 一般情況
術后觀察各組大鼠存活、切口愈合及肢體運動情況。
1.4.2 大體觀察
術后12周，各組大鼠同上法麻醉后，沿原切口入路顯露坐骨神經，大體觀察A、B、C組移植物形態及橋接的神經有無脫出。
1.4.3 電生理檢測
大體觀察后，用雙根銀絲刺激電極置于各組缺損橋接物近端神經干及腓總神經橫跨腓骨肌處，兩刺激電極間距為2 cm。同心針記錄雙電極45°斜行插入腓腸肌肌腹中部，記錄誘發的復合肌肉動作電位波幅；刺激強度750 mV，刺激頻率1 Hz，持續時間1 ms。同時測定健側腓腸肌的復合肌肉動作電位波幅，將各組結果與健側值進行比較，并以與健側值的百分比表示復合肌肉動作電位結果[6]。
1.4.4 組織學觀察
電生理檢測后取移植物和所支配的腓腸肌。將移植物置于2.5%戊二醛固定3 h，丙酮逐級脫水，Epon812環氧樹脂包埋劑與100%丙酮按1∶1比例浸泡包埋。取移植物中段先行半薄切片，片厚1 μm，常規甲苯胺藍溶液染色，光鏡下觀察軸突。于400倍鏡下，每組取5張切片，每張切片取5個視野，采用Image J分析軟件計數軸突，觀察再生的神經橫截面積，按以下公式計算軸突密度，軸突密度=軸突總數 /神經橫截面積）[7]。
將腓腸肌標本置入4%多聚甲醛固定5 h，30%蔗糖溶液脫水，OCT包埋后冰凍切片，行HE染色，光鏡下觀察肌肉及膠原纖維。于400倍鏡下，每組取5張切片，每張切片取5個視野，采用Image J分析軟件測量肌纖維橫截面積。
1.4.5 透射電鏡觀察
取1.4.4中切片再行超薄切片，片厚60 nm，用醋酸鈾及硝酸鉛雙重染色，透射電鏡觀察再生神經纖維超微結構。于5 800倍鏡下，每組取5 張切片，每張切片取10個視野，采用Image J分析軟件測量髓鞘厚度及軸突直徑，取均值。
1.5 統計學方法
采用SPSS13.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗；檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 NGF釋放檢測
隨著時間延長，兩種周圍神經導管NGF累積釋放量均不斷增加，各時間點兩組間比較差異均無統計學意義（P＞ 0.05），見圖 1。濃度梯度負載NGF和均勻負載NGF的導管12周內NGF累積釋放量分別為（14.2 ± 1.4）、（13.7 ± 1.3）ng/mg，兩組比較差異無統計學意義（t=0.564，P=0.570）。
圖1
兩種周圍神經導管NGF緩釋曲線 ? ?2.2 一般情況
大鼠切口均Ⅰ期愈合，存活至實驗完成。術后4 d各組大鼠均出現足底潰瘍，3周時最嚴重，之后逐漸愈合，至12周時足底潰瘍基本愈合；其中C、D組大鼠愈合情況優于A、B組。
2.3 大體觀察
術后12周，A、B、C組移植物貼附于一側肌肉，表面已完全血管化，有結締組織包裹，神經導管與坐骨神經兩端連接，未見神經瘤形成。見圖 2。
2.4 電生理檢測
術后12周，A、B、C、D組復合肌肉動作電位分別為25.1% ± 4.2%、42.3% ± 9.3%、57.1% ± 10.3%、62.1% ± 13.7 %。A組顯著低于B、C、D組，B組顯著低于C、D組，比較差異均有統計學意義（P＜ 0.05）；C、D組間比較，差異無統計學意義（P＞ 0.05）。
2.5 組織學觀察
2.5.1 移植物
術后12 周，甲苯胺藍染色示C、D組再生神經纖維形成大小不等的纖維束，神經纖維髓鞘化明顯；A、B組觀察結果與C、D組相似，但軸突分布較C、D組稀疏。見圖 3。D組軸突總數顯著高于A、B、C組，C組高于A、B組，B組高于A組，比較差異均有統計學意義（P＜ 0.05）。C組軸突密度顯著高于A、B、D組，B組高于A、D組，D組高于A組，比較差異均有統計學意義（P＜ 0.05）。見表 1。
表1
各組組織學及透射電鏡測量指標比較（n=6，2.5.2 腓腸肌
術后12周，Masson染色示D組肌纖維最粗、膠原纖維最細，之后為C、B組，而A組肌肉萎縮最嚴重，有大量膠原纖維增生。見圖 4。D組肌纖維橫截面積顯著高于A、B、C組，C組高于A、B組，B組高于A組，比較差異均有統計學意義（P＜ 0.05），見表 1。
2.6 透射電鏡觀察
術后12 周，透射電鏡下各組均可見再生有髓神經纖維和無髓纖維混合，雪旺細胞形態正常，包繞再生軸突形成有髓纖維，大多數髓鞘結構發育良好，呈同心圓板層樣結構，少數為未完全閉合的不成熟髓鞘。其中C、D組髓鞘較厚，排列整齊，新生神經纖維較密集，神經纖維基本發育成熟。而A、B組新生神經纖維數量較少，髓鞘厚度也略小于C、D組。見圖 5。
D組軸突直徑顯著高于A、B、C組，C組高于A、B組，B組高于A組，比較差異均有統計學意義（P＜ 0.05）。C、D組髓鞘厚度比較差異無統計學意義（P＞ 0.05），但均優于A、B組，差異有統計學意義（P＜ 0.05）；B組優于A組，差異有統計學意義（P＜ 0.05）。見表 1。
3 討論
目前，許多利用組織工程原理修復周圍神經損傷的效果仍不理想，主要原因是軸突生長缺乏方向性，在導管內彌漫生長[8]。在神經系統發育過程中，生長錐被多種生長因子引導，朝著靶向組織生長。這些因子被稱為趨化因子或趨觸因子，均呈濃度梯度分布[9]。這些呈濃度梯度分布的生長因子給予軸突生長一種空間或方向信號，能引導軸突再生[10]。如小鼠前腦的嗅球有中間神經元，其生于前腦亞室管膜層，需沿著頭端遷移渠道向前遷移幾毫米才能達到嗅球[11]。因此，構建組織工程神經支架時，除需負載生長因子，除需考慮長時間保持生長因子活性外，還需考慮將生長因子呈濃度梯度負載。
目前出現了一些濃度梯度負載生長因子至二維支架上的方法，如微流體法、擴散法、光雕刻法等[12-14]。但是將生長因子以濃度梯度負載至三維支架上，并用于體內實驗的報道較少。本實驗中利用吸附絲蛋白/NGF的時間差異，制備出了濃度梯度負載NGF的周圍神經導管。在進行梯度NGF負載時，變化的是吸附時間。支架靠近器皿底部的部分，由于接觸含有NGF的絲蛋白溶液時間長，所以吸附 的 NGF量多；而頂部由于接觸時間短，吸附的NGF量少。我們通過變化吸附時間，成功獲得濃度梯度負載NGF的周圍神經導管。
絲蛋白是從蠶絲中提取的天然生物材料，具有良好的生物相容性、降解速率及與組織生成相匹配等優點，在生物醫學領域有廣泛用途，目前已用于組織工程領域和藥物控釋領域[15-16]。絲蛋白擁有親水基團和疏水基團，在一定條件下，如低溫、甲醇等環境會發生蛋白的構象轉變，形成β-折疊，從溶于水變為不溶于水，同時將小分子蛋白包裹[17]；其在體內外降解速度慢，作為藥物載體時，藥物釋放時間長，因此用絲蛋白負載生長因子是一種溫和的方法[18]。本實驗中，當絲蛋白和NGF吸附在材料表面后，通過加入甲醇，使得絲蛋白形成β-折疊，從溶于水變為不溶于水，并固定在材料表面，同時也包裹了固定在材料表面的NGF。因此，NGF的釋放與絲蛋白降解有關，隨著絲蛋白的降解，被包裹住的NGF分子被釋放。由于絲蛋白具有較慢的降解速率，因此本實驗在體外12周時，仍能檢測到具有活性的NGF釋放。
體外研究表明，負載梯度信號的支架能引導并促進軸突生長[19]。其作用機制主要為：生長錐直徑改為10 μm，它能感受該直徑范圍內NGF的濃度[20]。當生長錐表面的絲狀偽足探測到外周導向分子（如NGF），微管就能優先沿該絲狀偽足內的肌動蛋白絲生長，整個軸突就會發生轉向反應[21]。同時，生長錐內不對稱的信號能引起肌動蛋白mRNA在生長因子濃度高的一側快速募集，通過激活轉錄因子調節分子eIF4B結合蛋白，迅速產生大量β-肌動蛋白，為軸突的生長提供充足原料，從而加快軸突生長速度[22]。但是負載濃度梯度信號的神經導管在體內是否能促進神經再生目前罕見報道。本實驗中，我們采用的是大鼠14 mm坐骨神經缺損模型，屬于長節段缺損，自行修復效果較差，因此能更好地顯示各種導管在體內的修復效果[23]。本實驗通過大體觀察、電生理檢測、組織學觀察及透射電鏡觀察，結果表明采用不同周圍神經導管修復后，再生的神經纖維均成功長入材料內，并穿過損傷區，成功支配肌肉。但在軸突總數、軸突密度、髓鞘厚度、軸突直徑、肌纖維面積及復合肌肉動作電位指標上，負載NGF的周圍神經導管優于單純周圍神經導管，而濃度梯度負載NGF的周圍神經導管則優于均勻負載NGF的周圍神經導管。其中采用濃度梯度負載NGF的周圍神經導管修復后，髓鞘厚度和軸突總數與自體神經修復相近，提示該導管在體內能更好地促進神經再生。
綜上述，本實驗利用絲蛋白差異吸附成功將NGF以濃度梯度方式負載至周圍神經導管上，體外釋放實驗提示NGF的活性能維持12周以上；體內實驗提示，濃度梯度負載NGF的周圍神經導管能有效促進神經再生。
