引用本文： 舒申友, 陳露, 李雪雪, 李海紅. 人體外泌汗腺細胞的三維培養及形態學觀察. 中國修復重建外科雜志, 2014, 28(2): 162-166. doi: 10.7507/1002-1892.20140036 復制
人體外泌汗腺分布于除嘴唇、外耳道、陰蒂和陰唇的全身各處，其分泌低滲汗液，汗液通過蒸發散熱來降低體溫，外泌汗腺是控制人體溫度的必需結構。大面積燒傷患者因外泌汗腺損傷，運動和溫熱環境下體溫會不斷升高，嚴重影響患者生活質量[1-3]。因此，汗腺再生研究具有重要意義。
傳統細胞和組織的研究主要采用二維培養模式獲得細胞 [4-5]，但二維培養的細胞不能很好模擬體內細胞微環境，并且不能保持在體細胞分化功能，而三維培養模式可彌補以上不足。近年，隨著細胞外基質的發展，體外三維重建外泌汗腺結構成為可能[6]。本研究通過將人體外泌汗腺細胞在Matrigel 基底膜基質中三維培養，觀察細胞生長情況及組織結構，為汗腺的三維重建奠定基礎。
1 材料與方法
1.1 實驗標本及主要試劑、儀器
取2011年3月－4月于汕頭大學醫學院第二附屬醫院燒傷整形顯微外科接受整形手術患者自愿捐贈的正常腹部全層皮膚。男4例，女5例；年齡18～42歲，平均23.4歲。
DMEM/F12（1∶1）、FBS、0.25%胰蛋白酶、Ⅱ型膠原酶、Ⅳ型膠原、重組人EGF、牛垂體提取物、無血清角質細胞培養基（keratinocyte serum-free medium，KSFM）、平衡鹽溶液（GIBCO 公司，美國）；Matrigel 基底膜基質（BD公司，美國）；小鼠抗人細胞角蛋白7（cytokeratin 7，CK7）、CK19（北京中杉金橋生物技術有限公司）；Cy3-偶聯的山羊抗小鼠IgG（碧云天生物技術研究所）。培養板、培養皿（Corning 公司，美國）；倒置相差顯微鏡及照相系統（Olympus 公司，日本）。
1.2 人汗腺細胞分離及二維培養
參照本研究組既往汗腺細胞培養方法 [5]并進行改進。取大小為2.0 cm × 0.3 cm全層皮膚，置于含100 U/ mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的平衡鹽溶液中反復漂洗后，去除皮下脂肪。在60 mm培養皿中，用眼科剪將皮膚剪成泥狀，加入3 mL含2 mg/mLⅡ型膠原酶、5%FBS、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的DMEM/F12，置37℃、5%CO2及飽和濕度培養箱中孵育5～6 h，100 μL微量移液器吸取游離汗腺，轉移至含5%FBS、100 U/mL青霉素、100 μg/ mL鏈霉素的DMEM/F12的60 mm培養皿中；再從此培養皿中吸取汗腺至預先包被Ⅳ型膠原的60 mm培養皿中，加入1 mL汗腺培養基（含5 ng/mL重組人EGF、25 mg/ mL牛垂體提取物、100 U/mL青霉素和100 μg/ mL鏈霉素的KSFM），置37℃、5%CO2及飽和濕度培養箱中培養；24 h后補加2 mL汗腺培養基繼續培養。每2～3天換液1次，換液時吸棄原培養液，平衡鹽溶液洗2次。待原代汗腺細胞達約80%融合后，吸棄原培養液，用無鈣、鎂離子的平衡鹽溶液洗2次，加入2 mL含0.25%胰蛋白酶的消化液，置37℃、5%CO2及飽和濕度培養箱中孵育2～5 min，加入4 mL含10%FBS的DMEM/ F12終止消化；以離心半徑10.7 cm、1 000 r/ min離心5 min，收集細胞。細胞分離培養期間，采用倒置相差顯微鏡觀察細胞形態變化。
1.3 人汗腺細胞三維培養及觀測
1.3.1 人汗腺細胞三維培養
把收集的汗腺細胞用KSFM懸浮，調整細胞濃度至1 ×105個/mL。取0.3 mL細胞懸液與0.3 mL 4℃液態Matrigel 基底膜基質于冰上快速混勻，避免產生氣泡。將混勻液加入至預冷的12孔板，室溫放置30 min，待凝固后加入汗腺培養基，置37℃、5%CO2及飽和濕度培養箱中培養。之后隔天換液1次，倒置相差顯微鏡下觀察細胞生長和形態變化。
1.3.2 HE染色觀察
培養14 d后，將長有細胞團的Matrigel 凝膠加入OCT 包埋劑，速凍20 min后切片，片厚20 μm，室溫下晾干20 min，置4℃丙酮固定15 min。取部分切片常規水化，HE染色，中性樹脂封片，室溫下晾干，光鏡下觀察細胞形態結構。
1.3.3 免疫組織化學染色觀察
采用免疫組織化學二步法進行染色觀察。取部分切片，常規脫蠟、水化；3%H2O2室溫孵育5 min，以消除內源性過氧化物酶活性；枸櫞酸液（pH6.0）95℃高溫熱修復抗原；分別滴加1∶100稀釋的小鼠抗人CK7或CK19一抗，4℃孵育過夜；滴加1∶500 稀釋的Cy3-偶聯山羊抗小鼠IgG 二抗，4℃孵育30 min；DAPI復染；免疫熒光封片液封片。各步驟間均用0.01 mol/L PBS洗3次，每次5 min。熒光顯微鏡下觀察染色細胞和染色部位，細胞質染成棕色為陽性。
2 結果
2.1 人汗腺細胞二維培養觀察
倒置相差顯微鏡觀察示，皮膚標本經眼科剪剪成泥狀后即可見少量游離汗腺組織；經Ⅱ型膠原酶消化4～5 h，大量汗腺組織從周圍結締組織中游離（圖 1 a）。挑取的汗腺組織中50%～70%貼壁（圖 1 b）；貼壁后3～5 d，60%～80%貼壁汗腺組織長出汗腺細胞（圖 1 c）。汗腺細胞呈多邊形，“鋪路石”樣生長，持續分裂達2～3周，形成緊密相連的圍繞汗腺組織塊的環狀單層（圖 1 d）；并可在單層細胞基礎上生長為多層。培養3～4周細胞衰老，有空泡形成并停止分裂。
圖1
人汗腺細胞二維培養形態學觀察（倒置相差顯微鏡×100） ? 游離的汗腺組織 ? 貼壁的汗腺組織 ? 培養4 d汗腺細胞圍繞汗腺組織塊 ? 培養14 d汗腺細胞呈“鋪路石”樣生長 ? ?2.2 人汗腺細胞三維培養及觀察
2.2.1 形態學觀察
汗腺細胞和Matrigel基底膜基質混合物室溫放置30 min，即凝固形成透明膠凍狀物。倒置相差顯微鏡下可見汗腺細胞散在分布于Matrigel基底膜基質中（圖 2 a），呈單個圓形細胞；接種后2～3 d，部分細胞開始分裂成2～4個細胞（圖 2 b、 c）；4～5 d細胞分裂形成小細胞團，這些小細胞團形成管狀結構（圖 2 d），管狀結構纏繞成類球狀結構（圖 2 e、 f）。培養2周左右混合培養物開始液化，培養終止。
2.2.2 HE染色和免疫組織化學染色觀察
HE 染色示人汗腺細胞細胞核呈藍染，細胞質呈紅染；部分細胞形成中空管狀結構，管壁由1～2層細胞構成（圖 3 a、b），類似于在體汗腺的分泌部和導管部（圖 3 c）。免疫組織化學染色示培養的汗腺細胞CK7和CK19表達均呈陽性（圖 4）。
3 討論
人體有（3～4）×106個汗腺，分為頂泌汗腺和外泌汗腺。外泌汗腺為單曲管狀結構，深部盤屈成球狀，穿過真皮和表皮，直接開口于皮膚表面[3, 7]。汗腺的主要功能是通過汗液蒸發來調控體溫，在基礎條件下，約 25%體熱通過發汗來發散，且汗腺也可保護機體免受細菌和其他病毒物質的侵害[3, 8]。大面積重度燒傷患者因大部分汗腺結構破壞，失去該功能，嚴重影響患者生存質量 [9-11]。組織工程技術的發展為大面積皮膚缺損修復提供了新方法，并獲得了一定療效，但目前尚無一種人工皮膚能重建毛囊、皮脂腺、汗腺等皮膚附屬器[9-10, 12-13]。為此，構建含有表皮、真皮和皮膚附屬器的人工皮膚成為研究熱點。
細胞外基質和上皮細胞間的相互作用是形成上皮三維結構和功能的必要因素[14-15]。Matrigel基底膜基質來源于富含細胞外基質蛋白的EHS小鼠腫瘤，其主要成分有Ⅳ型膠原、層粘連蛋白、硫酸肝素糖蛋白、巢蛋白、生長因子和基質金屬蛋白酶等[6, 15-17]。Matrigel三維基質模擬體內細胞基底膜的結構、組成、物理特性和功能，有利于體外細胞的培養和分化，可用于對細胞形態、細胞遷移、細胞侵襲、生化功能和基因表達等的研究[6, 15-17]。為此，本研究選擇在Matrigel基底膜基質上進行人汗腺細胞的三維培養。
研究表明，Matrigel可促進多種類型細胞的分化，細胞生長在 Matrigel中可形成類似于在體的三維結構[6]。唾液腺來源細胞在Matrigel中可形成極性的類分泌腺泡結構，并分泌腺泡細胞蛋白，如α-淀粉酶、水通道蛋白質5和CK[18]。乳腺上皮細胞在Matrigel中可形成具有中空腔的三維腺泡結構，結構類似于功能活躍的乳腺腺泡，表達整合素受體和緊密連接蛋白，并分泌β-酪蛋白[14]。內皮細胞在Matrigel 中可排列成類帶狀單層，然后形成具有空腔、薄層、類管狀的結構[19]。
本研究結果顯示，體外在Matrigel基底膜基質中培養的人外泌汗腺細胞，可形成類管狀結構，這些類管狀結構進一步形成類球狀結構，這與在體汗腺結構相似。HE染色示，類管狀結構形成中空管腔，大多數類管狀結構的管腔由單層細胞包繞，少量由雙層細胞包繞，分別類似于汗腺的分泌部和導管部。在皮膚組織中，CK7只在汗腺表達，CK19表達在汗腺的分泌部和導管部及表皮基底層和毛囊。因此，CK7和CK19聯合應用，可作為汗腺細胞的標志[20]。本研究免疫組織化學染色結果提示，培養的汗腺細胞CK7和CK19表達均呈陽性。
綜上述，本研究結果顯示人外泌汗腺細胞生長在Matrigel 中可形成三維結構，與二維培養的汗腺單層相比，更接近于在體汗腺的形態和結構。但本研究僅對體外三維培養的汗腺細胞從大體形態進行研究，這種三維培養的汗腺是否含有在體汗腺所有類型細胞、是否具有基底膜及泌汗功能，尚有待進一步研究。
人體外泌汗腺分布于除嘴唇、外耳道、陰蒂和陰唇的全身各處，其分泌低滲汗液，汗液通過蒸發散熱來降低體溫，外泌汗腺是控制人體溫度的必需結構。大面積燒傷患者因外泌汗腺損傷，運動和溫熱環境下體溫會不斷升高，嚴重影響患者生活質量[1-3]。因此，汗腺再生研究具有重要意義。
傳統細胞和組織的研究主要采用二維培養模式獲得細胞 [4-5]，但二維培養的細胞不能很好模擬體內細胞微環境，并且不能保持在體細胞分化功能，而三維培養模式可彌補以上不足。近年，隨著細胞外基質的發展，體外三維重建外泌汗腺結構成為可能[6]。本研究通過將人體外泌汗腺細胞在Matrigel 基底膜基質中三維培養，觀察細胞生長情況及組織結構，為汗腺的三維重建奠定基礎。
1 材料與方法
1.1 實驗標本及主要試劑、儀器
取2011年3月－4月于汕頭大學醫學院第二附屬醫院燒傷整形顯微外科接受整形手術患者自愿捐贈的正常腹部全層皮膚。男4例，女5例；年齡18～42歲，平均23.4歲。
DMEM/F12（1∶1）、FBS、0.25%胰蛋白酶、Ⅱ型膠原酶、Ⅳ型膠原、重組人EGF、牛垂體提取物、無血清角質細胞培養基（keratinocyte serum-free medium，KSFM）、平衡鹽溶液（GIBCO 公司，美國）；Matrigel 基底膜基質（BD公司，美國）；小鼠抗人細胞角蛋白7（cytokeratin 7，CK7）、CK19（北京中杉金橋生物技術有限公司）；Cy3-偶聯的山羊抗小鼠IgG（碧云天生物技術研究所）。培養板、培養皿（Corning 公司，美國）；倒置相差顯微鏡及照相系統（Olympus 公司，日本）。
1.2 人汗腺細胞分離及二維培養
參照本研究組既往汗腺細胞培養方法 [5]并進行改進。取大小為2.0 cm × 0.3 cm全層皮膚，置于含100 U/ mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的平衡鹽溶液中反復漂洗后，去除皮下脂肪。在60 mm培養皿中，用眼科剪將皮膚剪成泥狀，加入3 mL含2 mg/mLⅡ型膠原酶、5%FBS、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的DMEM/F12，置37℃、5%CO2及飽和濕度培養箱中孵育5～6 h，100 μL微量移液器吸取游離汗腺，轉移至含5%FBS、100 U/mL青霉素、100 μg/ mL鏈霉素的DMEM/F12的60 mm培養皿中；再從此培養皿中吸取汗腺至預先包被Ⅳ型膠原的60 mm培養皿中，加入1 mL汗腺培養基（含5 ng/mL重組人EGF、25 mg/ mL牛垂體提取物、100 U/mL青霉素和100 μg/ mL鏈霉素的KSFM），置37℃、5%CO2及飽和濕度培養箱中培養；24 h后補加2 mL汗腺培養基繼續培養。每2～3天換液1次，換液時吸棄原培養液，平衡鹽溶液洗2次。待原代汗腺細胞達約80%融合后，吸棄原培養液，用無鈣、鎂離子的平衡鹽溶液洗2次，加入2 mL含0.25%胰蛋白酶的消化液，置37℃、5%CO2及飽和濕度培養箱中孵育2～5 min，加入4 mL含10%FBS的DMEM/ F12終止消化；以離心半徑10.7 cm、1 000 r/ min離心5 min，收集細胞。細胞分離培養期間，采用倒置相差顯微鏡觀察細胞形態變化。
1.3 人汗腺細胞三維培養及觀測
1.3.1 人汗腺細胞三維培養
把收集的汗腺細胞用KSFM懸浮，調整細胞濃度至1 ×105個/mL。取0.3 mL細胞懸液與0.3 mL 4℃液態Matrigel 基底膜基質于冰上快速混勻，避免產生氣泡。將混勻液加入至預冷的12孔板，室溫放置30 min，待凝固后加入汗腺培養基，置37℃、5%CO2及飽和濕度培養箱中培養。之后隔天換液1次，倒置相差顯微鏡下觀察細胞生長和形態變化。
1.3.2 HE染色觀察
培養14 d后，將長有細胞團的Matrigel 凝膠加入OCT 包埋劑，速凍20 min后切片，片厚20 μm，室溫下晾干20 min，置4℃丙酮固定15 min。取部分切片常規水化，HE染色，中性樹脂封片，室溫下晾干，光鏡下觀察細胞形態結構。
1.3.3 免疫組織化學染色觀察
采用免疫組織化學二步法進行染色觀察。取部分切片，常規脫蠟、水化；3%H2O2室溫孵育5 min，以消除內源性過氧化物酶活性；枸櫞酸液（pH6.0）95℃高溫熱修復抗原；分別滴加1∶100稀釋的小鼠抗人CK7或CK19一抗，4℃孵育過夜；滴加1∶500 稀釋的Cy3-偶聯山羊抗小鼠IgG 二抗，4℃孵育30 min；DAPI復染；免疫熒光封片液封片。各步驟間均用0.01 mol/L PBS洗3次，每次5 min。熒光顯微鏡下觀察染色細胞和染色部位，細胞質染成棕色為陽性。
2 結果
2.1 人汗腺細胞二維培養觀察
倒置相差顯微鏡觀察示，皮膚標本經眼科剪剪成泥狀后即可見少量游離汗腺組織；經Ⅱ型膠原酶消化4～5 h，大量汗腺組織從周圍結締組織中游離（圖 1 a）。挑取的汗腺組織中50%～70%貼壁（圖 1 b）；貼壁后3～5 d，60%～80%貼壁汗腺組織長出汗腺細胞（圖 1 c）。汗腺細胞呈多邊形，“鋪路石”樣生長，持續分裂達2～3周，形成緊密相連的圍繞汗腺組織塊的環狀單層（圖 1 d）；并可在單層細胞基礎上生長為多層。培養3～4周細胞衰老，有空泡形成并停止分裂。
圖1
人汗腺細胞二維培養形態學觀察（倒置相差顯微鏡×100） ? 游離的汗腺組織 ? 貼壁的汗腺組織 ? 培養4 d汗腺細胞圍繞汗腺組織塊 ? 培養14 d汗腺細胞呈“鋪路石”樣生長 ? ?2.2 人汗腺細胞三維培養及觀察
2.2.1 形態學觀察
汗腺細胞和Matrigel基底膜基質混合物室溫放置30 min，即凝固形成透明膠凍狀物。倒置相差顯微鏡下可見汗腺細胞散在分布于Matrigel基底膜基質中（圖 2 a），呈單個圓形細胞；接種后2～3 d，部分細胞開始分裂成2～4個細胞（圖 2 b、 c）；4～5 d細胞分裂形成小細胞團，這些小細胞團形成管狀結構（圖 2 d），管狀結構纏繞成類球狀結構（圖 2 e、 f）。培養2周左右混合培養物開始液化，培養終止。
2.2.2 HE染色和免疫組織化學染色觀察
HE 染色示人汗腺細胞細胞核呈藍染，細胞質呈紅染；部分細胞形成中空管狀結構，管壁由1～2層細胞構成（圖 3 a、b），類似于在體汗腺的分泌部和導管部（圖 3 c）。免疫組織化學染色示培養的汗腺細胞CK7和CK19表達均呈陽性（圖 4）。
3 討論
人體有（3～4）×106個汗腺，分為頂泌汗腺和外泌汗腺。外泌汗腺為單曲管狀結構，深部盤屈成球狀，穿過真皮和表皮，直接開口于皮膚表面[3, 7]。汗腺的主要功能是通過汗液蒸發來調控體溫，在基礎條件下，約 25%體熱通過發汗來發散，且汗腺也可保護機體免受細菌和其他病毒物質的侵害[3, 8]。大面積重度燒傷患者因大部分汗腺結構破壞，失去該功能，嚴重影響患者生存質量 [9-11]。組織工程技術的發展為大面積皮膚缺損修復提供了新方法，并獲得了一定療效，但目前尚無一種人工皮膚能重建毛囊、皮脂腺、汗腺等皮膚附屬器[9-10, 12-13]。為此，構建含有表皮、真皮和皮膚附屬器的人工皮膚成為研究熱點。
細胞外基質和上皮細胞間的相互作用是形成上皮三維結構和功能的必要因素[14-15]。Matrigel基底膜基質來源于富含細胞外基質蛋白的EHS小鼠腫瘤，其主要成分有Ⅳ型膠原、層粘連蛋白、硫酸肝素糖蛋白、巢蛋白、生長因子和基質金屬蛋白酶等[6, 15-17]。Matrigel三維基質模擬體內細胞基底膜的結構、組成、物理特性和功能，有利于體外細胞的培養和分化，可用于對細胞形態、細胞遷移、細胞侵襲、生化功能和基因表達等的研究[6, 15-17]。為此，本研究選擇在Matrigel基底膜基質上進行人汗腺細胞的三維培養。
研究表明，Matrigel可促進多種類型細胞的分化，細胞生長在 Matrigel中可形成類似于在體的三維結構[6]。唾液腺來源細胞在Matrigel中可形成極性的類分泌腺泡結構，并分泌腺泡細胞蛋白，如α-淀粉酶、水通道蛋白質5和CK[18]。乳腺上皮細胞在Matrigel中可形成具有中空腔的三維腺泡結構，結構類似于功能活躍的乳腺腺泡，表達整合素受體和緊密連接蛋白，并分泌β-酪蛋白[14]。內皮細胞在Matrigel 中可排列成類帶狀單層，然后形成具有空腔、薄層、類管狀的結構[19]。
本研究結果顯示，體外在Matrigel基底膜基質中培養的人外泌汗腺細胞，可形成類管狀結構，這些類管狀結構進一步形成類球狀結構，這與在體汗腺結構相似。HE染色示，類管狀結構形成中空管腔，大多數類管狀結構的管腔由單層細胞包繞，少量由雙層細胞包繞，分別類似于汗腺的分泌部和導管部。在皮膚組織中，CK7只在汗腺表達，CK19表達在汗腺的分泌部和導管部及表皮基底層和毛囊。因此，CK7和CK19聯合應用，可作為汗腺細胞的標志[20]。本研究免疫組織化學染色結果提示，培養的汗腺細胞CK7和CK19表達均呈陽性。
綜上述，本研究結果顯示人外泌汗腺細胞生長在Matrigel 中可形成三維結構，與二維培養的汗腺單層相比，更接近于在體汗腺的形態和結構。但本研究僅對體外三維培養的汗腺細胞從大體形態進行研究，這種三維培養的汗腺是否含有在體汗腺所有類型細胞、是否具有基底膜及泌汗功能，尚有待進一步研究。
