引用本文： 鄭宣, 許世超, 全仁夫. 慢病毒載體介導VEGF165基因修飾大鼠毛囊干細胞的實驗研究. 中國修復重建外科雜志, 2014, 28(2): 155-161. doi: 10.7507/1002-1892.20140035 復制
外傷引起的皮膚大面積缺損常導致非常嚴重的肢體殘疾，甚至死亡。目前治療方法主要有使用各種傷口覆蓋物、自體皮膚移植、同種異體皮膚移植以及組織工程皮膚修復等，均有一定缺陷。傷口覆蓋物無生理功能；自體皮膚移植取材面積有限；同種異體皮膚移植存在免疫排斥反應、皮膚壞死脫落等不足，易造成二次損傷，增加患者痛苦。應用組織工程皮膚修復皮膚缺損是較理想治療方法，但存在創面感染、不愈合等并發癥。究其原因與創面修復的血管化程度不足密切相關[1-2]。血管生成能力差易導致移植的組織工程皮膚早期無血管系統供給營養，從而使皮膚替代物壞死而移植失敗。因此，如何加快組織工程皮膚血管化進程是當前皮膚組織工程領域面臨的重大難題之一[2-5]。
毛囊干細胞（hair follicle stem cells，HFSCs）是一種具有未分化性、自我更新快和體外增殖能力強等特點的細胞，主要存在于毛囊外根鞘的隆突部[6-7]。研究表明體外培養的HFSCs表現出高克隆形成能力，且具有非常強的再生潛能[8]。HFSCs不僅能夠分化形成毛囊組織，還可分化形成神經細胞、黑色素細胞、平滑肌細胞和表皮細胞；它來源于皮膚、毛發，從患者自身獲取簡便，數量可觀，且無嚴重并發癥[9-11]。VEGF作為特異性的血管內皮細胞有絲分裂原，在血管生成、組織缺血修復過程中起重要作用，VEGF165是VEGF 5種亞型之一，其活性最強、分布范圍最廣[12]。慢病毒作為一種高效的基因轉染載體，具有可轉染非分裂期細胞、容納外源性目的基因片段大、免疫反應小等優點，其可經多次修飾改造，具有可靠性和安全性[13-14]。因此，本實驗通過慢病毒載體介導VEGF165基因轉染大鼠HFSCs（rat HFSCs，rHFSCs），獲得持續、穩定、高表達VEGF165的HFSCs，以改善和促進血管再生，解決組織工程皮膚早期血管化難題，為人工皮膚的構建奠定實驗基礎。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
清潔級封閉群1周齡SD大鼠6只，雌雄不限，體重（25 ± 2）g，購自上海斯萊克實驗動物公司。pLV-內部核糖體進入位點（internal ribosome entry site，IRES）-增強型綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）及 pLV-IRES-VEGF165-EGFP質粒由同濟大學生命科學學院常劍鋒博士惠贈。293T細胞由同濟大學干細胞中心范國平課題組提供。
DMEM/F12（1∶1）培養基、H-DMEM培養基、KSR血清替代物、Ⅳ 型膠原酶、Dispase酶、Coating Matrix（50 ×）試劑盒、TrypLETM Express胰蛋白酶替代酶、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、羥基乙醇（GIBCO公司，美國）；重組人EGF、重組人bFGF（R&D公司，美國）；青-鏈霉素混合液（北京索萊寶科技有限公司）；氫化可的松（上海生工生物工程有限公司）；水性封片劑Mounting Solution（北京康為世紀生物科技有限公司）；Ⅳ型膠原（BD公司，美國）；Trizol RNA提取試劑、反轉錄酶、Taq DNA 聚合酶（Invitrogen公司，美國）；實時熒光定量PCR（real time quantitative PCR，RT-qPCR）反應試劑盒（ABI公司，美國）；整合素β1多克隆抗體、角蛋白15（cytokeratin 15，CK15）多克隆抗體（Abcam公司，美國）；整合素α6多克隆抗體（Santa Cruz公司，美國）；兔抗鼠IgG（Jackson公司，美國）；DAPI（Roche公司，瑞士）；Lenti-X慢病毒表達系統（3種包裝質粒VSVG、RSV-REV、RRE；Clontech公司，美國）；磷酸鈣法細胞轉染試劑盒（深圳百恩維生物科技有限公司）。倒置熒光顯微鏡、倒置相差顯微鏡（Olympus公司，日本）；RT-qPCR儀、電泳儀、凝膠成像系統（Bio-Rad公司，美國）；Odyssey機器（LI-COR公司，美國）。
1.2 rHFSCs分離、培養及鑒定
1.2.1 rHFSCs分離培養及純化
采用文獻[15-16]方法分離培養rHFSCs。取1周齡SD大鼠頸椎脫臼法處死，放入75%乙醇消毒后取出，用眼科剪剪下觸須部皮膚，大小2 mm × 2 mm，PBS漂洗3次。用1%Dispase酶和1%Ⅳ型膠原酶混合液37℃消化90 min，PBS漂洗3次。體視顯微鏡下用注射器針頭將毛囊從結締組織鞘中分離出來，切去兩端，留下隆突部；將毛囊隆突部接種至預鋪Matrix膠的培養皿中，加入1 mL完全培養基（869 μL/mL DMEM/F12、100 μL/ mL KSR、10 μL/ mL青、鏈霉素混合液、10 μL/mL L-谷氨酰胺、10 μL/mL非必需氨基酸、20 ng/mL EGF、10 ng/ mL bFGF、1 μL/mL羥基乙醇、10 ng/mL氫化可的松），于37℃、5%CO2及飽和濕度培養箱中培養2 d，待組織塊貼壁后，緩慢加入5 mL完全培養基，之后每3天換液，倒置相差顯微鏡觀察細胞遷移、生長狀況。采用TrypLETM Express胰蛋白酶替代酶消化法進行傳代，消化條件為37℃、8 min。
參考文獻[17-18]方法并加以改良，將Ⅳ型膠原包被于培養皿中，室溫靜置1 h。將原代細胞用TrypLETM Express胰蛋白酶替代酶37℃下消化8 min，500 × g離心5 min收集細胞后，吹打成單細胞懸液接種于培養皿中，20 min后將未貼壁細胞連同培養液一起吸出；貼壁細胞用完全培養基培養，每3天換液1次；原代細胞純化1次后第2代細胞再純化1次。倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態。
1.2.2 RT-qPCR相關基因鑒定
對分選純化后的第3代rHFSCs行RT-qPCR檢測。將目的基因CK10、CK15、CK19、CD34、整合素β1、整合素α6和內參基因ACTB分別于不同反應管中擴增，引物設計由Primier5.0軟件完成，各引物序列及產物長度見表 1。PCR反應體系為20 μL：2 × SYBR Green Mix 10 μL、引物Mix 1 μL、模板1 μL、超純水8 μL。然后分裝至AXYGEN PCR 8連管，微型離心機瞬時離心混勻PCR反應體系后，將上述樣品放入RT-qPCR儀，用SYBR Green法行RT-qPCR。退火溫度結合引物的Tm值及RT-qPCR預實驗結果自行設定，融解曲線設置從80℃開始。最后用-ΔΔCt法檢測各基因的mRNA相對表達量。
表1
各基因引物序列及產物長度
Table1.
Primer sequences and production size
1.2.3 細胞免疫熒光染色鑒定
將第3代細胞培養至對數生長期，用TrypLETM Express胰蛋白酶替代酶消化8 min，500 × g離心5 min后，按1 ×105個/孔濃度接種于玻片上，貼壁培養2 d后，吸去培養液，PBST漂洗，加入4%多聚甲醛固定后，再用5%牛血清白蛋白室溫封閉。分別加入一抗整合素β1抗體（1∶100）、整合素α6抗體（1∶50）以及CK15抗體（1∶100）；陰性對照組以PBST代替一抗，排除非特異性二抗的結合。然后室溫孵育，PBST洗滌后，加入TRITC熒光素標記兔抗鼠二抗避光30 min；加DAPI（1∶2 000）染核5 min，避光晾干，用水性封片劑Mounting Solution封片。倒置熒光顯微鏡下觀察紅色熒光表達。
1.2.4 細胞增殖能力測定
挑選生長狀態良好的第3、5、7、9代rHFSCs，37℃下TrypLETM Express胰蛋白酶替代酶消化8 min后，以1 ×105個 /孔濃度接種于24孔板上，分別于1、2、3、4、5、6、7 d進行細胞計數板計數，每天設置6個復孔，取均值，繪制細胞生長曲線。
1.3 慢病毒基因修飾rHFSCs
1.3.1 包裝慢病毒
采用磷酸鈣法細胞轉染試劑盒進行實驗。取對數生長期的293T細胞，提前24 h接種于100 mm培養皿中，待次日細胞長至50%～70%融合即可；轉染前將培養基更換為不含雙抗（青-鏈霉素）、含10%FBS的H-DMEM培養基。目的質粒pLV-IRES-VEGF165-EGFP和3種包裝質粒VSVG、RSV-REV、RRE按2∶1∶1∶1比例加入HBS緩沖液中輕輕混勻，補充ddH2O作為A液，將CaCl2液加入A液，室溫放置20 min；然后逐滴加入細胞培養皿中，“十”字水平搖晃多次。在37℃、5%CO2及飽和濕度條件下孵育培養10～12 h后，更換為含10 μL/ mL青、鏈霉素雙抗的H-DMEM培養基；48 h后待細胞出現融合并有強綠色熒光表達時，收集培養上清，用0.45 μm孔徑濾膜過濾，16℃超速離心機（55 000 × g）離心3 h，棄上清，加入完全培養基吹打分裝成2管，-80℃保存病毒液（實驗組）。pLV-IRES-EGFP空載體質粒包裝步驟同上，作為對照組。
1.3.2 慢病毒轉染rHFSCs
轉染前1 d按1 ×105 個 / 孔濃度將生長狀態良好的第3代rHFSCs以TrypLETM Express胰蛋白酶替代酶消化8 min，500 × g離心5 min后，實驗組和對照組分別加入50 μL相應病毒液，補充50 μL完全培養基，吹打混勻后接種于預鋪Matrix膠的24孔板，于37℃、5%CO2及飽和濕度培養箱靜置30 min；再補加完全培養基繼續培養，24 h后換液。
1.3.3 倒置熒光顯微鏡觀察
實驗組于培養72 h及14 d后倒置熒光顯微鏡下觀察，綠色熒光為陽性表達。隨機取12個200倍視野按以下公式計算轉染效率。轉染效率=陽性表達細胞數/視野內細胞總數×100%，重復3次取均值。
1.3.4 RT-PCR檢測
轉染后7 d采用RT-PCR檢測兩組VEGF165基因表達。按照Trizol RNA提取試劑盒說明書提取兩組細胞總RNA，加反轉錄酶反轉錄獲得cDNA。引物設計由Primier5.0軟件完成，各基因引物序列及產物大小見表 1。PCR反應體系為20 μL： cDNA模板1 μL、10 × PCR buffer 2 μL、Taq DNA 聚合酶 1 U、上下引物各0.5 μL、超純水補足20 μL。擴增條件：94℃、5 min；95℃變性1 min，58℃退火1 min，72℃延伸1 min，35個循環；72℃延伸10 min。取出擴增產物5 μL行2%瓊脂糖凝膠電泳30 min，凝膠成像系統顯影、拍照。
1.3.5 Western
blot 檢測轉染后7 d，采用Western blot法檢測VEGF165蛋白表達。于冰上裂解細胞，提取細胞總蛋白。4℃下以4 000 × g離心5 min，吸上清至1.5 mL離心管。配制SDS-PAGE膠，轉聚偏氟乙烯膜；取出膜，5%脫脂牛奶浸泡1 h，移至封閉液中，室溫下封閉過夜；取出膜，1 × PBS漂洗3次，加入VEGF165一抗（1∶2 000）孵育1 h。TBST漂洗3次后，加入兔抗羊二抗（1∶1 000），室溫孵育1 h。TBST洗膜3次，加ECL試劑顯色，Odyssey機器顯影、拍照。
2 結果
2.1 rHFSCs分離培養及鑒定
2.1.1 rHFSCs形態學觀察
接種3 d，有少量細胞從毛囊隆突部周圍爬出（圖 1 a）；7 d細胞數量逐漸增多，包繞毛囊隆突部（圖 1 b）。倒置相差顯微鏡觀察示，原代培養14 d后，約60%細胞呈“鋪路石”狀，排列較為緊密，屬典型上皮樣細胞，其余呈圓形、梭形，貼壁較牢（圖 1 c）。經2次Ⅳ型膠原貼壁篩選純化，約95%細胞呈典型“鋪路石”狀、“鳥巢”狀，立體感強，折光率高，克隆形成能力強，細胞體積小，細胞質近中央處有圓形核，核大且明顯，具有典型的干細胞形態學特性（圖 1 d、e）。
圖1
倒置相差顯微鏡觀察rHFSCs形態變化 ? 培養3 d少量細胞從大鼠毛囊隆突部四周爬出（× 40） ? 培養7 d細胞數量逐漸增多（× 40） ? 原代培養14 d （× 40） ? 原代細胞純化1次后（×100） ? 第2代細胞純化1次后（×100） ? ?2.1.2 RT-qPCR檢測
HFSCs 標志物CK15、CK19、整合素β1、整合素α6的mRNA相對表達量較高，分別為-9.91 ± 0.23、-5.42 ± 0.05、-6.97 ± 0.37、-7.14 ± 0.31；角質形成細胞標志物CK10及表皮干細胞標志物CD34的mRNA相對表達量較低，分別為-23.25 ± 0.26、-15.81 ± 0.13。
2.1.3 細胞免疫熒光染色鑒定
CK15、整合素β1和整合素α6免疫熒光染色示，實驗組細胞質均可見明顯紅色熒光，陰性對照組呈陰性表達。見圖 2。
2.1.4 細胞增殖能力檢測
純化后的第3、5、7、9代細胞接種后1～2 d，細胞處于生長潛伏期，生長緩慢；3～4 d出現干細胞克隆；5～6 d細胞處于對數生長期；隨后細胞生長速度開始減緩，逐漸進入平臺期。第7、9代細胞增殖能力稍弱于第3、5代細胞，但增殖能力仍較強。見圖 3。
2.2 慢病毒基因修飾rHFSCs
2.2.1 倒置熒光顯微鏡觀察
實驗組轉染后72 h可見較強綠色熒光（圖 4），慢病毒轉染效率可達71.52% ± 1.83%。連續觀察14 d，慢病毒轉染效率持續穩定，為85.76% ± 1.91%。
2.2.2 RT-PCR和Western
blot檢測結果顯示，實驗組VEGF165 mRNA和蛋白表達均呈陽性，對照組均呈陰性。見圖 5、6。
3 討論
3.1 HFSCs的原代分離培養
種子細胞來源是組織工程皮膚發展中的主要問題，其中研究最多的是干細胞，胚胎干細胞（embryonic stem cells，ESCs）、MSCs、表皮干細胞、脂肪干細胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）、HFSCs等均有報道，各有優缺點。雖然ESCs具有全能分化能力，但其細胞來源的倫理問題嚴重限制了其應用[19]。MSCs具有易分離培養、增殖能力強、排斥反應低的優點，在皮膚創面微環境下可分化為表皮細胞、成纖維細胞等，但其主要通過抽取骨髓獲得，對供體創傷大，單次抽取量不宜過多，均限制了其在皮膚組織工程中的應用[20-21]。表皮干細胞可形成擁有毛囊、汗腺等附屬器官的完整組織工程皮膚，然而將其作為種子細胞存在自身取材會造成新創傷、異體移植免疫排斥反應大等問題[22-23]。ADSCs獲取容易、具有自我更新能力與多向分化潛能，但其誘導條件尚需優化，目前定向分化報道較少[24]。研究發現HFSCs具有強大的增殖能力和向表皮及相關附屬器細胞方向分化的潛能，且來源充足、取材簡便、創傷小，均提示HFSCs可能成為組織工程皮膚理想的種子細胞[6-11]。
Tayor等[9]通過鼠皮下注射5-溴脫氧尿嘧啶核苷后觀察發現，毛囊間表皮干細胞（hair follicle epidermal stem cells，HFESCs）和HFSCs可追蹤至毛囊外根鞘的特定部位--隆突部，且HFSCs比HFESCs具有更高的克隆形成能力。Lavker等[25]研究指出，HFSCs和HFESCs在根本上屬于同一種干細胞，位于毛囊隆突部，具有形成毛發和表皮的能力。因此，為獲取HFSCs，毛囊隆突部細胞的分離培養是最基礎一步。目前常用的分離培養方法均有其不足，如流式細胞儀分選標記的細胞體外培養活力較差，不易傳代培養；純組織塊法分離得到的HFSCs純度太低；單獨顯微分離技術分離純化獲得的細胞純度不高。另外，有學者認為HFSCs在本質上是一種表皮干細胞，具有黏附特性，對Ⅳ型膠原、層粘連蛋白（基底膜的主要成分）及細胞外基質的黏附速度明顯快于其他類型細胞，大多數表皮干細胞在10 min內即黏附在膠原等細胞外基質上，而大多數短暫擴增細胞的黏附時間為20～60 min[26]。因此，可以利用HFSCs黏附性強、20 min內貼壁的特點，應用Ⅳ型膠原差速貼壁分選法來純化HFSCs。研究表明，細胞外基質差速貼壁法在表皮干細胞類的分選中已得到成功應用，是一種簡便有效的方法[27]。本實驗利用HFSCs主要存在于毛囊隆突部、強黏附性、快速貼壁的特點，聯合顯微分離技術、Dispase酶和Ⅳ型膠原酶混合消化、Matrix膠包被、Ⅳ型膠原差速貼壁分選法，得到了增殖能力強、可大量擴增的高純度HFSCs。
由于當前HFSCs的鑒定缺乏確切可靠的特異性標記物，一般采用檢測2種以上標記物，CD200、CD34、P63、CK10、CK15、CK19、整合素β1、整合素α6等均被認為是HFSCs相對特異性標記物[28-31]。我們利用特異性標記物與相關基因水平檢測相結合鑒定細胞類型。Lavker等[32]報道，隨著細胞生長，CK15表達減少較CK19表達減少更早，CK15陰性而CK19陽性的細胞可能是早期短暫擴增細胞。因此有學者[32]提出CK15可能較CK19對于HFSCs更有鑒別意義。而在RT-qPCR檢測中，通常目的基因與內參基因的循環數差異（ΔΔCt）＜ 7，認為該基因表達豐度高；＞ 7則認為該基因表達豐度為中低水平[33]。本實驗結果可見，HFSCs標志物CK19基因的表達量居高，CK15表達量中等，整合素β1、整合素α6表達量居于CK19和CK15之間，而表皮干細胞標志物CD34表達量較低，角質形成細胞標志物CK10表達量極低。本實驗中篩選純化后的細胞免疫熒光染色顯示CK15、整合素β1、整合素α6表達均為陽性。因此，綜合RT-qPCR和免疫熒光染色結果，提示我們分離培養、純化得到的大鼠毛囊隆突部細胞即為rHFSCs。
3.2 VEGF165基因修飾HFSCs
常規的基因修飾技術有磷酸鈣法、人工脂質體法、病毒介導法和物理方法等[34]，各有優劣性。磷酸鈣、脂質體、物理轉染等方法都是通過一定程度破壞細胞膜結構以使目標核苷酸進入干細胞，如果靶基因片段較大，則對細胞造成損害更大，細胞增殖較前緩慢，甚至凋亡。此外，脂質體等轉移至細胞內的小分子干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）半衰期短，體外合成siRNA對基因表達的抑制作用短暫。有研究發現rHFSCs很難被外源性基因轉染，常用的脂質體、磷酸鈣轉染法等均不能達到理想結果，而慢病毒載體相較于其他載體系統更能達到基因修飾的長期穩定表達[35]。慢病毒作為siRNA的攜帶者，表達載體由RNA聚合酶Ⅲ啟動子來指導RNA合成，而RNA聚合酶Ⅲ有明確的起始和終止序列，合成的RNA不會帶poly A尾。慢病毒介導法采用的載體，可整合在靶細胞基因組穩定表達，重復性高，轉染效率強，且無需借助輔助試劑、有效避免了抗性篩選物質對靶細胞的影響，具有高效、穩定的特點[36]。因此，本實驗采用慢病毒介導方法，可使rHFSCs高效、穩定地表達VEGF165。
隨著基因修飾技術的迅速發展，將一些目的基因修飾靶細胞，使其具有特定的生物學特性逐漸成為研究熱點。其中，以VEGF為基礎的基因轉染技術備受關注，VEGF基因經轉錄水平剪切可產生5種亞型，其中VEGF165活性最強，分布范圍廣，是體內發揮作用的主要形式[12]。但VEGF165半衰期很短，注入體內易稀釋，僅為數小時甚至更短。Shima等[37]認為VEGF165 的生物半衰期在正常氧分壓下是30～45 min，在低氧下是6～8 h。故在組織工程皮膚中添加外源VEGF165蛋白進行治療效力有限，為克服該缺點，遂考慮應用基因治療。利用慢病毒介導技術很好地解決了細胞因子自身半衰期短、注射或其他方法使用時無法長期穩定表達刺激細胞發揮作用的缺陷。李傳勇等[38]通過慢病毒介導的VEGF165基因轉染HFSCs，3周后鏡下未見三角形、梭形、紡錘形等血管內皮祖細胞特異性形態學改變，但能觀察到該細胞VEGF165基因和蛋白表達上調（強綠色熒光），提示HFSCs經基因修飾后的定向分化能力及其應用于組織工程皮膚促血管化效果尚待進一步研究。而張向榮等[39]通過實驗發現VEGF165基因轉染BMSCs移植可在組織工程皮膚與創面之間微循環尚未建立的早期發揮重要作用。
下一步，我們將重點研究HFSCs的定向分化能力，以其為種子細胞接種于特定組織工程三維支架，構建復合皮膚替代物，并移植于裸鼠皮膚表面，從組織學、形態學、免疫學等方面觀察其血管形成能力和創面愈合情況，以解決目前人工皮膚修復中僅能恢復正常皮膚的部分解剖結構和生理功能的缺陷，為提高組織工程皮膚成活率提供一條新途徑。
外傷引起的皮膚大面積缺損常導致非常嚴重的肢體殘疾，甚至死亡。目前治療方法主要有使用各種傷口覆蓋物、自體皮膚移植、同種異體皮膚移植以及組織工程皮膚修復等，均有一定缺陷。傷口覆蓋物無生理功能；自體皮膚移植取材面積有限；同種異體皮膚移植存在免疫排斥反應、皮膚壞死脫落等不足，易造成二次損傷，增加患者痛苦。應用組織工程皮膚修復皮膚缺損是較理想治療方法，但存在創面感染、不愈合等并發癥。究其原因與創面修復的血管化程度不足密切相關[1-2]。血管生成能力差易導致移植的組織工程皮膚早期無血管系統供給營養，從而使皮膚替代物壞死而移植失敗。因此，如何加快組織工程皮膚血管化進程是當前皮膚組織工程領域面臨的重大難題之一[2-5]。
毛囊干細胞（hair follicle stem cells，HFSCs）是一種具有未分化性、自我更新快和體外增殖能力強等特點的細胞，主要存在于毛囊外根鞘的隆突部[6-7]。研究表明體外培養的HFSCs表現出高克隆形成能力，且具有非常強的再生潛能[8]。HFSCs不僅能夠分化形成毛囊組織，還可分化形成神經細胞、黑色素細胞、平滑肌細胞和表皮細胞；它來源于皮膚、毛發，從患者自身獲取簡便，數量可觀，且無嚴重并發癥[9-11]。VEGF作為特異性的血管內皮細胞有絲分裂原，在血管生成、組織缺血修復過程中起重要作用，VEGF165是VEGF 5種亞型之一，其活性最強、分布范圍最廣[12]。慢病毒作為一種高效的基因轉染載體，具有可轉染非分裂期細胞、容納外源性目的基因片段大、免疫反應小等優點，其可經多次修飾改造，具有可靠性和安全性[13-14]。因此，本實驗通過慢病毒載體介導VEGF165基因轉染大鼠HFSCs（rat HFSCs，rHFSCs），獲得持續、穩定、高表達VEGF165的HFSCs，以改善和促進血管再生，解決組織工程皮膚早期血管化難題，為人工皮膚的構建奠定實驗基礎。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
清潔級封閉群1周齡SD大鼠6只，雌雄不限，體重（25 ± 2）g，購自上海斯萊克實驗動物公司。pLV-內部核糖體進入位點（internal ribosome entry site，IRES）-增強型綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）及 pLV-IRES-VEGF165-EGFP質粒由同濟大學生命科學學院常劍鋒博士惠贈。293T細胞由同濟大學干細胞中心范國平課題組提供。
DMEM/F12（1∶1）培養基、H-DMEM培養基、KSR血清替代物、Ⅳ 型膠原酶、Dispase酶、Coating Matrix（50 ×）試劑盒、TrypLETM Express胰蛋白酶替代酶、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、羥基乙醇（GIBCO公司，美國）；重組人EGF、重組人bFGF（R&D公司，美國）；青-鏈霉素混合液（北京索萊寶科技有限公司）；氫化可的松（上海生工生物工程有限公司）；水性封片劑Mounting Solution（北京康為世紀生物科技有限公司）；Ⅳ型膠原（BD公司，美國）；Trizol RNA提取試劑、反轉錄酶、Taq DNA 聚合酶（Invitrogen公司，美國）；實時熒光定量PCR（real time quantitative PCR，RT-qPCR）反應試劑盒（ABI公司，美國）；整合素β1多克隆抗體、角蛋白15（cytokeratin 15，CK15）多克隆抗體（Abcam公司，美國）；整合素α6多克隆抗體（Santa Cruz公司，美國）；兔抗鼠IgG（Jackson公司，美國）；DAPI（Roche公司，瑞士）；Lenti-X慢病毒表達系統（3種包裝質粒VSVG、RSV-REV、RRE；Clontech公司，美國）；磷酸鈣法細胞轉染試劑盒（深圳百恩維生物科技有限公司）。倒置熒光顯微鏡、倒置相差顯微鏡（Olympus公司，日本）；RT-qPCR儀、電泳儀、凝膠成像系統（Bio-Rad公司，美國）；Odyssey機器（LI-COR公司，美國）。
1.2 rHFSCs分離、培養及鑒定
1.2.1 rHFSCs分離培養及純化
采用文獻[15-16]方法分離培養rHFSCs。取1周齡SD大鼠頸椎脫臼法處死，放入75%乙醇消毒后取出，用眼科剪剪下觸須部皮膚，大小2 mm × 2 mm，PBS漂洗3次。用1%Dispase酶和1%Ⅳ型膠原酶混合液37℃消化90 min，PBS漂洗3次。體視顯微鏡下用注射器針頭將毛囊從結締組織鞘中分離出來，切去兩端，留下隆突部；將毛囊隆突部接種至預鋪Matrix膠的培養皿中，加入1 mL完全培養基（869 μL/mL DMEM/F12、100 μL/ mL KSR、10 μL/ mL青、鏈霉素混合液、10 μL/mL L-谷氨酰胺、10 μL/mL非必需氨基酸、20 ng/mL EGF、10 ng/ mL bFGF、1 μL/mL羥基乙醇、10 ng/mL氫化可的松），于37℃、5%CO2及飽和濕度培養箱中培養2 d，待組織塊貼壁后，緩慢加入5 mL完全培養基，之后每3天換液，倒置相差顯微鏡觀察細胞遷移、生長狀況。采用TrypLETM Express胰蛋白酶替代酶消化法進行傳代，消化條件為37℃、8 min。
參考文獻[17-18]方法并加以改良，將Ⅳ型膠原包被于培養皿中，室溫靜置1 h。將原代細胞用TrypLETM Express胰蛋白酶替代酶37℃下消化8 min，500 × g離心5 min收集細胞后，吹打成單細胞懸液接種于培養皿中，20 min后將未貼壁細胞連同培養液一起吸出；貼壁細胞用完全培養基培養，每3天換液1次；原代細胞純化1次后第2代細胞再純化1次。倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態。
1.2.2 RT-qPCR相關基因鑒定
對分選純化后的第3代rHFSCs行RT-qPCR檢測。將目的基因CK10、CK15、CK19、CD34、整合素β1、整合素α6和內參基因ACTB分別于不同反應管中擴增，引物設計由Primier5.0軟件完成，各引物序列及產物長度見表 1。PCR反應體系為20 μL：2 × SYBR Green Mix 10 μL、引物Mix 1 μL、模板1 μL、超純水8 μL。然后分裝至AXYGEN PCR 8連管，微型離心機瞬時離心混勻PCR反應體系后，將上述樣品放入RT-qPCR儀，用SYBR Green法行RT-qPCR。退火溫度結合引物的Tm值及RT-qPCR預實驗結果自行設定，融解曲線設置從80℃開始。最后用-ΔΔCt法檢測各基因的mRNA相對表達量。
表1
各基因引物序列及產物長度
Table1.
Primer sequences and production size
1.2.3 細胞免疫熒光染色鑒定
將第3代細胞培養至對數生長期，用TrypLETM Express胰蛋白酶替代酶消化8 min，500 × g離心5 min后，按1 ×105個/孔濃度接種于玻片上，貼壁培養2 d后，吸去培養液，PBST漂洗，加入4%多聚甲醛固定后，再用5%牛血清白蛋白室溫封閉。分別加入一抗整合素β1抗體（1∶100）、整合素α6抗體（1∶50）以及CK15抗體（1∶100）；陰性對照組以PBST代替一抗，排除非特異性二抗的結合。然后室溫孵育，PBST洗滌后，加入TRITC熒光素標記兔抗鼠二抗避光30 min；加DAPI（1∶2 000）染核5 min，避光晾干，用水性封片劑Mounting Solution封片。倒置熒光顯微鏡下觀察紅色熒光表達。
1.2.4 細胞增殖能力測定
挑選生長狀態良好的第3、5、7、9代rHFSCs，37℃下TrypLETM Express胰蛋白酶替代酶消化8 min后，以1 ×105個 /孔濃度接種于24孔板上，分別于1、2、3、4、5、6、7 d進行細胞計數板計數，每天設置6個復孔，取均值，繪制細胞生長曲線。
1.3 慢病毒基因修飾rHFSCs
1.3.1 包裝慢病毒
采用磷酸鈣法細胞轉染試劑盒進行實驗。取對數生長期的293T細胞，提前24 h接種于100 mm培養皿中，待次日細胞長至50%～70%融合即可；轉染前將培養基更換為不含雙抗（青-鏈霉素）、含10%FBS的H-DMEM培養基。目的質粒pLV-IRES-VEGF165-EGFP和3種包裝質粒VSVG、RSV-REV、RRE按2∶1∶1∶1比例加入HBS緩沖液中輕輕混勻，補充ddH2O作為A液，將CaCl2液加入A液，室溫放置20 min；然后逐滴加入細胞培養皿中，“十”字水平搖晃多次。在37℃、5%CO2及飽和濕度條件下孵育培養10～12 h后，更換為含10 μL/ mL青、鏈霉素雙抗的H-DMEM培養基；48 h后待細胞出現融合并有強綠色熒光表達時，收集培養上清，用0.45 μm孔徑濾膜過濾，16℃超速離心機（55 000 × g）離心3 h，棄上清，加入完全培養基吹打分裝成2管，-80℃保存病毒液（實驗組）。pLV-IRES-EGFP空載體質粒包裝步驟同上，作為對照組。
1.3.2 慢病毒轉染rHFSCs
轉染前1 d按1 ×105 個 / 孔濃度將生長狀態良好的第3代rHFSCs以TrypLETM Express胰蛋白酶替代酶消化8 min，500 × g離心5 min后，實驗組和對照組分別加入50 μL相應病毒液，補充50 μL完全培養基，吹打混勻后接種于預鋪Matrix膠的24孔板，于37℃、5%CO2及飽和濕度培養箱靜置30 min；再補加完全培養基繼續培養，24 h后換液。
1.3.3 倒置熒光顯微鏡觀察
實驗組于培養72 h及14 d后倒置熒光顯微鏡下觀察，綠色熒光為陽性表達。隨機取12個200倍視野按以下公式計算轉染效率。轉染效率=陽性表達細胞數/視野內細胞總數×100%，重復3次取均值。
1.3.4 RT-PCR檢測
轉染后7 d采用RT-PCR檢測兩組VEGF165基因表達。按照Trizol RNA提取試劑盒說明書提取兩組細胞總RNA，加反轉錄酶反轉錄獲得cDNA。引物設計由Primier5.0軟件完成，各基因引物序列及產物大小見表 1。PCR反應體系為20 μL： cDNA模板1 μL、10 × PCR buffer 2 μL、Taq DNA 聚合酶 1 U、上下引物各0.5 μL、超純水補足20 μL。擴增條件：94℃、5 min；95℃變性1 min，58℃退火1 min，72℃延伸1 min，35個循環；72℃延伸10 min。取出擴增產物5 μL行2%瓊脂糖凝膠電泳30 min，凝膠成像系統顯影、拍照。
1.3.5 Western
blot 檢測轉染后7 d，采用Western blot法檢測VEGF165蛋白表達。于冰上裂解細胞，提取細胞總蛋白。4℃下以4 000 × g離心5 min，吸上清至1.5 mL離心管。配制SDS-PAGE膠，轉聚偏氟乙烯膜；取出膜，5%脫脂牛奶浸泡1 h，移至封閉液中，室溫下封閉過夜；取出膜，1 × PBS漂洗3次，加入VEGF165一抗（1∶2 000）孵育1 h。TBST漂洗3次后，加入兔抗羊二抗（1∶1 000），室溫孵育1 h。TBST洗膜3次，加ECL試劑顯色，Odyssey機器顯影、拍照。
2 結果
2.1 rHFSCs分離培養及鑒定
2.1.1 rHFSCs形態學觀察
接種3 d，有少量細胞從毛囊隆突部周圍爬出（圖 1 a）；7 d細胞數量逐漸增多，包繞毛囊隆突部（圖 1 b）。倒置相差顯微鏡觀察示，原代培養14 d后，約60%細胞呈“鋪路石”狀，排列較為緊密，屬典型上皮樣細胞，其余呈圓形、梭形，貼壁較牢（圖 1 c）。經2次Ⅳ型膠原貼壁篩選純化，約95%細胞呈典型“鋪路石”狀、“鳥巢”狀，立體感強，折光率高，克隆形成能力強，細胞體積小，細胞質近中央處有圓形核，核大且明顯，具有典型的干細胞形態學特性（圖 1 d、e）。
圖1
倒置相差顯微鏡觀察rHFSCs形態變化 ? 培養3 d少量細胞從大鼠毛囊隆突部四周爬出（× 40） ? 培養7 d細胞數量逐漸增多（× 40） ? 原代培養14 d （× 40） ? 原代細胞純化1次后（×100） ? 第2代細胞純化1次后（×100） ? ?2.1.2 RT-qPCR檢測
HFSCs 標志物CK15、CK19、整合素β1、整合素α6的mRNA相對表達量較高，分別為-9.91 ± 0.23、-5.42 ± 0.05、-6.97 ± 0.37、-7.14 ± 0.31；角質形成細胞標志物CK10及表皮干細胞標志物CD34的mRNA相對表達量較低，分別為-23.25 ± 0.26、-15.81 ± 0.13。
2.1.3 細胞免疫熒光染色鑒定
CK15、整合素β1和整合素α6免疫熒光染色示，實驗組細胞質均可見明顯紅色熒光，陰性對照組呈陰性表達。見圖 2。
2.1.4 細胞增殖能力檢測
純化后的第3、5、7、9代細胞接種后1～2 d，細胞處于生長潛伏期，生長緩慢；3～4 d出現干細胞克隆；5～6 d細胞處于對數生長期；隨后細胞生長速度開始減緩，逐漸進入平臺期。第7、9代細胞增殖能力稍弱于第3、5代細胞，但增殖能力仍較強。見圖 3。
2.2 慢病毒基因修飾rHFSCs
2.2.1 倒置熒光顯微鏡觀察
實驗組轉染后72 h可見較強綠色熒光（圖 4），慢病毒轉染效率可達71.52% ± 1.83%。連續觀察14 d，慢病毒轉染效率持續穩定，為85.76% ± 1.91%。
2.2.2 RT-PCR和Western
blot檢測結果顯示，實驗組VEGF165 mRNA和蛋白表達均呈陽性，對照組均呈陰性。見圖 5、6。
3 討論
3.1 HFSCs的原代分離培養
種子細胞來源是組織工程皮膚發展中的主要問題，其中研究最多的是干細胞，胚胎干細胞（embryonic stem cells，ESCs）、MSCs、表皮干細胞、脂肪干細胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）、HFSCs等均有報道，各有優缺點。雖然ESCs具有全能分化能力，但其細胞來源的倫理問題嚴重限制了其應用[19]。MSCs具有易分離培養、增殖能力強、排斥反應低的優點，在皮膚創面微環境下可分化為表皮細胞、成纖維細胞等，但其主要通過抽取骨髓獲得，對供體創傷大，單次抽取量不宜過多，均限制了其在皮膚組織工程中的應用[20-21]。表皮干細胞可形成擁有毛囊、汗腺等附屬器官的完整組織工程皮膚，然而將其作為種子細胞存在自身取材會造成新創傷、異體移植免疫排斥反應大等問題[22-23]。ADSCs獲取容易、具有自我更新能力與多向分化潛能，但其誘導條件尚需優化，目前定向分化報道較少[24]。研究發現HFSCs具有強大的增殖能力和向表皮及相關附屬器細胞方向分化的潛能，且來源充足、取材簡便、創傷小，均提示HFSCs可能成為組織工程皮膚理想的種子細胞[6-11]。
Tayor等[9]通過鼠皮下注射5-溴脫氧尿嘧啶核苷后觀察發現，毛囊間表皮干細胞（hair follicle epidermal stem cells，HFESCs）和HFSCs可追蹤至毛囊外根鞘的特定部位--隆突部，且HFSCs比HFESCs具有更高的克隆形成能力。Lavker等[25]研究指出，HFSCs和HFESCs在根本上屬于同一種干細胞，位于毛囊隆突部，具有形成毛發和表皮的能力。因此，為獲取HFSCs，毛囊隆突部細胞的分離培養是最基礎一步。目前常用的分離培養方法均有其不足，如流式細胞儀分選標記的細胞體外培養活力較差，不易傳代培養；純組織塊法分離得到的HFSCs純度太低；單獨顯微分離技術分離純化獲得的細胞純度不高。另外，有學者認為HFSCs在本質上是一種表皮干細胞，具有黏附特性，對Ⅳ型膠原、層粘連蛋白（基底膜的主要成分）及細胞外基質的黏附速度明顯快于其他類型細胞，大多數表皮干細胞在10 min內即黏附在膠原等細胞外基質上，而大多數短暫擴增細胞的黏附時間為20～60 min[26]。因此，可以利用HFSCs黏附性強、20 min內貼壁的特點，應用Ⅳ型膠原差速貼壁分選法來純化HFSCs。研究表明，細胞外基質差速貼壁法在表皮干細胞類的分選中已得到成功應用，是一種簡便有效的方法[27]。本實驗利用HFSCs主要存在于毛囊隆突部、強黏附性、快速貼壁的特點，聯合顯微分離技術、Dispase酶和Ⅳ型膠原酶混合消化、Matrix膠包被、Ⅳ型膠原差速貼壁分選法，得到了增殖能力強、可大量擴增的高純度HFSCs。
由于當前HFSCs的鑒定缺乏確切可靠的特異性標記物，一般采用檢測2種以上標記物，CD200、CD34、P63、CK10、CK15、CK19、整合素β1、整合素α6等均被認為是HFSCs相對特異性標記物[28-31]。我們利用特異性標記物與相關基因水平檢測相結合鑒定細胞類型。Lavker等[32]報道，隨著細胞生長，CK15表達減少較CK19表達減少更早，CK15陰性而CK19陽性的細胞可能是早期短暫擴增細胞。因此有學者[32]提出CK15可能較CK19對于HFSCs更有鑒別意義。而在RT-qPCR檢測中，通常目的基因與內參基因的循環數差異（ΔΔCt）＜ 7，認為該基因表達豐度高；＞ 7則認為該基因表達豐度為中低水平[33]。本實驗結果可見，HFSCs標志物CK19基因的表達量居高，CK15表達量中等，整合素β1、整合素α6表達量居于CK19和CK15之間，而表皮干細胞標志物CD34表達量較低，角質形成細胞標志物CK10表達量極低。本實驗中篩選純化后的細胞免疫熒光染色顯示CK15、整合素β1、整合素α6表達均為陽性。因此，綜合RT-qPCR和免疫熒光染色結果，提示我們分離培養、純化得到的大鼠毛囊隆突部細胞即為rHFSCs。
3.2 VEGF165基因修飾HFSCs
常規的基因修飾技術有磷酸鈣法、人工脂質體法、病毒介導法和物理方法等[34]，各有優劣性。磷酸鈣、脂質體、物理轉染等方法都是通過一定程度破壞細胞膜結構以使目標核苷酸進入干細胞，如果靶基因片段較大，則對細胞造成損害更大，細胞增殖較前緩慢，甚至凋亡。此外，脂質體等轉移至細胞內的小分子干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）半衰期短，體外合成siRNA對基因表達的抑制作用短暫。有研究發現rHFSCs很難被外源性基因轉染，常用的脂質體、磷酸鈣轉染法等均不能達到理想結果，而慢病毒載體相較于其他載體系統更能達到基因修飾的長期穩定表達[35]。慢病毒作為siRNA的攜帶者，表達載體由RNA聚合酶Ⅲ啟動子來指導RNA合成，而RNA聚合酶Ⅲ有明確的起始和終止序列，合成的RNA不會帶poly A尾。慢病毒介導法采用的載體，可整合在靶細胞基因組穩定表達，重復性高，轉染效率強，且無需借助輔助試劑、有效避免了抗性篩選物質對靶細胞的影響，具有高效、穩定的特點[36]。因此，本實驗采用慢病毒介導方法，可使rHFSCs高效、穩定地表達VEGF165。
隨著基因修飾技術的迅速發展，將一些目的基因修飾靶細胞，使其具有特定的生物學特性逐漸成為研究熱點。其中，以VEGF為基礎的基因轉染技術備受關注，VEGF基因經轉錄水平剪切可產生5種亞型，其中VEGF165活性最強，分布范圍廣，是體內發揮作用的主要形式[12]。但VEGF165半衰期很短，注入體內易稀釋，僅為數小時甚至更短。Shima等[37]認為VEGF165 的生物半衰期在正常氧分壓下是30～45 min，在低氧下是6～8 h。故在組織工程皮膚中添加外源VEGF165蛋白進行治療效力有限，為克服該缺點，遂考慮應用基因治療。利用慢病毒介導技術很好地解決了細胞因子自身半衰期短、注射或其他方法使用時無法長期穩定表達刺激細胞發揮作用的缺陷。李傳勇等[38]通過慢病毒介導的VEGF165基因轉染HFSCs，3周后鏡下未見三角形、梭形、紡錘形等血管內皮祖細胞特異性形態學改變，但能觀察到該細胞VEGF165基因和蛋白表達上調（強綠色熒光），提示HFSCs經基因修飾后的定向分化能力及其應用于組織工程皮膚促血管化效果尚待進一步研究。而張向榮等[39]通過實驗發現VEGF165基因轉染BMSCs移植可在組織工程皮膚與創面之間微循環尚未建立的早期發揮重要作用。
下一步，我們將重點研究HFSCs的定向分化能力，以其為種子細胞接種于特定組織工程三維支架，構建復合皮膚替代物，并移植于裸鼠皮膚表面，從組織學、形態學、免疫學等方面觀察其血管形成能力和創面愈合情況，以解決目前人工皮膚修復中僅能恢復正常皮膚的部分解剖結構和生理功能的缺陷，為提高組織工程皮膚成活率提供一條新途徑。
