引用本文： 王慧建, 李彥林, 陳建明, 王鑫, 趙灃凱, 曹樹海. TGF-β3基因轉染誘導滇南小耳豬BMSCs向軟骨分化的初步研究. 中國修復重建外科雜志, 2014, 28(2): 149-154. doi: 10.7507/1002-1892.20140034 復制
因創傷或其他原因引起的關節軟骨損傷十分常見，軟骨自身修復困難。組織工程技術為修復全層軟骨缺損提供了新方法。BMSCs在特定條件下可誘導形成軟骨細胞，在軟骨組織工程中有良好應用前景，成為軟骨缺損修復的首選種子細胞[1-3]。TGF-β家族在軟骨損傷修復重建中起重要作用，TGF-β1、β2具有促進膠原合成與成熟的作用，但過度表達可導致病理性瘢痕形成；TGF-β3能促進BMSCs向軟骨方向增殖、分化[4-5]，還可調節TGF-β1、β2比例，抑制成纖維細胞增生，降低纖維化形成[6]，提高軟骨修復質量。本研究通過構建攜帶TGF-β3轉染基因的重組腺病毒表達系統，以期持續充分發揮TGF-β3促進BMSCs向軟骨方向增殖、分化的作用，為臨床應用基因治療軟骨缺損提供實驗依據。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
成年滇南小耳豬5只，雌雄不限，體重12～15 kg，由昆明醫科大學實驗動物中心提供，實驗過程符合《關于善待實驗動物的指導性意見》要求。
TGF-β3（R&D公司，美國）；血清5型重組腺病毒（recombinant adenovirus 5，rAd5）構建系統、pGSadeno腺病毒表達載體（武漢晶賽生物工程技術有限公司）；HEK293細胞、pOTB7-TGF-β3載體（ATCC公司，美國）；限制性內切酶（Takara公司，日本）；增強型綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGPF；Sigma公司，美國）；質粒提取試劑盒、質粒中提試劑盒（北京天根生化科技有限公司）。CO2培養箱（Thermo公司，美國）；倒置相差顯微鏡（Olympus公司，日本）；掃描電鏡（Philips公司，荷蘭）；序列測定和引物合成由昆明莫里克生物科技公司完成。
1.2 TGF-β3重組腺病毒載體的構建及鑒定
1.2.1 PCR擴增TGF-β3基因
以pOTB7-TGF-β3載體為模板，PCR擴增TGF-β3基因。TGF-β3引物：正義5'-CCCAAGCTTATGAAGATGCACTTGCAAAG-3'，引入BamHⅠ酶切位點；反義5'-CGCGGATCCTCACCG-GAAGCAGTAATTG-3'，引入 EcoRⅠ酶切位點。用上述特異性引物和高保真DNA聚合酶進行擴增，將PCR產物行1%瓊脂糖凝膠電泳并回收TGF-β3條帶，連接PCR產物至T載體中并測序。BamHⅠ、EcoRⅠ雙切酶鑒定，選取正確克隆TGF-β3片段擴大保存。
1.2.2 重組腺病毒穿梭質粒的構建
將測序正確的人TGF-β3基因亞克隆入腺病毒穿梭質粒載體pEC3.1（已克隆EGFP）上的相應多克隆位點間，連接HindⅢ和BamHⅠ雙酶切后的TGF-β3基因片段和pEC3.1載體，分別回收小片段和大片段。獲得質粒pEC3.1 HindⅢ+ BamHⅠ大片段和質粒TGF-β3 HindⅢ+ BamHⅠ小片段，通過連接酶T4連接，命名為pEC3.1-TGF-β3。質粒中提試劑盒提取質粒，HindⅢ、BamHⅠ行雙酶切鑒定。
1.2.3 攜帶TGF-β3轉染基因的重組腺病毒表達系統構建
通過體外同源重組，將TGF-β3表達框移至pGSadeno腺病毒表達載體上，用質粒中提試劑盒提取質粒，行PCR鑒定。鑒定后的重組腺病毒質粒用Pacl酶切，Pacl線性化的腺病毒DNA 250 μL加入至1個已接種1.5 ×106個HEK293細胞的60 mL培養瓶內，轉染后24 h更換為含10%FBS的L-DMEM培養基，轉染3 d后觀察細胞病態反應。當細胞有明顯病態反應且超過50%細胞脫壁時，收集細胞；以離心半徑13 cm、1 000 r/min離心5 min后去上清，加PBS液1 mL，- 80、37℃反復凍融3次，收集病毒行PCR分析；當出現上述現象時裂解上清，感染HEK293細胞，放大培養重組腺病毒，并采用半數組織培養感染劑量法測定腺病毒感染滴度＞ 1 ×109 PFU/mL。
1.3 滇南小耳豬BMSCs分離培養及鑒定
參照文獻[2]方法，采用密度梯度離心和貼壁篩選相結合的方法分離培養BMSCs。取滇南小耳豬5 只，經耳緣靜脈注射3%戊巴比妥（1 mL/kg）麻醉，雙側髂嵴脫毛。無菌操作下，分別于雙側髂嵴穿刺抽取骨髓約20 mL，置于50 mL離心管，加入L-DMEM培養液，充分吹打混勻后，以離心半徑13.5 cm、1 000 r/ min離心10 min；吸棄上層脂肪及上清液，再次加入含10%FBS 的L-DMEM培養基，充分吹打混勻后，分裝至25 cm2培養瓶中，48 h后換液，以后每2天換液1次，逐漸除去未貼壁細胞及紅細胞；當原代細胞培養10 d，細胞融合并覆蓋瓶底80%～90%時，0.25%胰蛋白酶2 mL消化。倒置相差顯微鏡下觀察，待細胞快要收縮時，吸棄胰蛋白酶，加入含10%FBS的L-DMEM培養基終止消化；輕輕吹打使細胞脫壁，檢測并調整細胞密度，按1∶2 比例傳代培養獲取第2代細胞備用。
待第2代細胞達80%～90%融合時收集細胞，吸棄培養基，PBS漂洗3次；胰蛋白酶消化制成單細胞懸液，流式細胞儀檢測細胞表面標記 CD29、CD44、CD45 的表達。
1.4 rAd5-TGF-β3轉染BMSCs
取第2代BMSCs以2 ×105個/孔密度接種于6 孔板，待細胞生長至70%～80%融合時，以感染復數為25（預實驗確定）加入rAd5-TGF-β3病毒液進行轉染，作為實驗組；轉染人腺病毒陰性（HK）空病毒載體為對照組；并設未轉染的細胞為空白對照組。培養24 h后吸棄病毒液，更換為含10%FBS的L-DMEM培養基繼續培養。
1.4.1 基因轉染BMSCs后轉染效果觀測
轉染24、48、72、96 h后行熒光顯微鏡觀測實驗組轉染效果。用0.25%胰蛋白酶消化細胞，PBS洗細胞1次，流式細胞儀檢測實驗組細胞轉染效率。
1.4.2 免疫熒光染色及Western
blot檢測TGF-β3蛋白表達 轉染72 h采用免疫熒光染色[7]檢測實驗組TGF-β3蛋白表達。轉染7、21 d提取實驗組、對照組及空白對照組蛋白，行Western blot檢測TGF-β3蛋白表達情況。
1.4.3 基因轉染后BMSCs成軟骨分化鑒定
實驗組細胞病毒轉染后每天行倒置相差顯微鏡觀察細胞形態。各組于21 d時行Western blot檢測Ⅱ型膠原蛋白表達情況。
2 結果
2.1 TGF-β3重組腺病毒載體的構建及鑒定
PCR擴增TGF-β3基因大小為930 bp，與TGF-β3大小相符（圖 1）；亞克隆至TGF-β3穿梭載體pE3.1后，HindⅢ、EcoRⅠ雙酶切鑒定，克隆大小為930 bp，為正確克隆，說明載體均有TGF-β3基因片段存在。TGF-β3載體體外同源重組后，PCR產物凝膠電泳結果顯示4 個克隆大小均為930 bp，為正確克隆，說明質粒中均有TGF-β3基因片段存在（圖 2）；轉染HEK293細胞后呈病態反應，細胞圓縮、聚合、相互抱成團狀（圖 3）。收集病毒行PCR分析目的條帶大小約為514 bp，符合預期，說明重組腺病毒rAd5-TGF-β3包裝成功（圖 4）。
圖1
TGF-β3基因陽性克隆的PCR檢測 M：Marker 1、2：TGF-β3 ? ?2.2 滇南小耳豬BMSCs形態學觀察及鑒定
原代細胞接種后3 h可見單核小圓形細胞貼壁；首次換液后可見少量梭形細胞，夾雜部分紅細胞；第2 次換液后可見梭形細胞增多，其他細胞明顯減少；原代培養10 d，細胞已基本融合呈漩渦樣生長（圖 5 a）。傳代后細胞形態良好呈束狀排列生長，增殖活躍，6～7 d可達90%融合（圖 5 b）。經流式細胞儀檢測，第2代細胞CD29、CD44、CD45特異性表面標志物均呈陽性表達，陽性率分別為99.49%、99.98%、99.93%。
2.3 rAd5-TGF-β3轉染BMSCs相關檢測
2.3.1 轉染效果觀測
rAd5-TGF-β3轉染BMSCs 24～96 h，熒光顯微鏡下均可觀察到熒光表達，且隨時間延長熒光表達明顯增加（圖 6）。流式細胞儀檢測示，轉染后24、48、72、96 h實驗組細胞轉染效率分別為28.15%、77.84%、84.86%、81.57%，轉染72 h時病毒達最佳轉染效果。
2.3.2 免疫熒光染色及Western
blot檢測TGF-β3蛋白表達 rAd5-TGF-β3 轉染BMSCs 72 h免疫熒光染色示，細胞質內有明顯TGF-β3蛋白表達（圖 7）。轉染后7、21 d Western blot檢測示，實驗組在相對分子質量為30 ×103處有TGF-β3陽性條帶，而對照組和空白對照組均呈陰性（圖 8）。
2.3.3 基因轉染后BMSCs成軟骨分化鑒定
實驗組培養7 d時，細胞呈紡錘形或梭形（圖 9 a）；14 d時細胞形態進一步改變，呈漩渦狀排列，一部分不規則形態像軟骨細胞以集落方式生長；21 d時細胞形態猶如軟骨細胞，為多邊形，較圓，呈“鋪路石”樣外觀（圖 9 b）。對照組和空白對照組細胞向軟骨分化不明顯，7 d呈長梭形；14 d大多數細胞沿胞體長軸呈有序排列；21 d細胞呈均勻分布的紡錘形（圖 9 c、d）。培養21 d時Western blot檢測示，在相對分子質量為130 ×103處，實驗組有Ⅱ型膠原陽性條帶，對照組和空白對照組均呈陰性（圖 10）。
圖10
培養21 d各組Western blot檢測Ⅱ型膠原蛋白表達 Mr：相對分子質量 1：空白對照組 2：對照組 3：實驗組
Figure10.
Western blot detection of collagen type Ⅱ in BMSCs at 21 days after culture in each group Mr: Relative molecular mass Lane 1: Blank control group Lane 2: Control group Lane 3: Experimental group
3 討論
BMSCs作為軟骨組織工程的種子細胞來源，其優越性已被多項研究證實[8-9]。滇南小耳豬在解剖學、生理學、疾病發生機制等方面與人相似，逐漸成為生命科學研究的重要實驗動物[10-12]。故本實驗選擇滇南小耳豬BMSCs進行研究。
尋找合適條件促進BMSCs增殖并向軟骨細胞分化，是目前軟骨組織工程學研究的方向之一[13]。在軟骨分化過程中，生長因子起重要作用。TGF-β3能誘導多種細胞合成和分泌細胞外基質，調控干細胞的增殖 和定向分化，尤其是誘導BMSCs向軟骨細胞分化，它參與了BMSCs向軟骨分化過程中的細胞聚集、增殖、分化過程，是觸發BMSCs向軟骨分化的起始因子[14] 。
基因增強組織工程是以MSCs作為靶細胞的基因治療和組織工程相結合的技術，在實際應用中，可通過一定載體將目的基因轉染入靶細胞，內源性誘導其分化[15]。轉基因技術可將多種軟骨生長因子導入細胞，促進軟骨再生，具有廣闊應用前景[16]。本實驗采用軟骨組織工程與基因治療相結合的技術，利用腺病毒載體將TGF-β3基因導入靶細胞，使其在靶細胞內高效表達，誘導BMSCs向軟骨細胞轉化。我們采用更直接的細菌內同源重組方法產生重組腺病毒，將TGF-β3全長基因介導入種子細胞BMSCs，使其自身表達TGF-β3。腺病毒是目前常用的基因轉移載體，其優點在于安全性高、免疫途徑簡便、插入外源基因容量大[17]，攜帶的基因是以附加體形式存在于宿主細胞核內，不整合至宿主細胞基因組，故不引起插入突變，且介導的基因表達持續穩定[18]。本實驗選擇的rAd5含有外源基因，被插入E1區，可被HEK293細胞基因整合，從而持續得到E1區蛋白。
本研究采用EGFP作為報告基因，EGFP是一種能發出綠色熒光的報告分子，常用于插入載體中與目的基因一起表達融合蛋白，通過檢測熒光的位置及強度來了解目的基因的表達及定位[19]；EGFP作為報告分子，具有無需加任何底物、熒光性質穩定、相對分子質量小、對細胞無毒性、作為熒光靶使用簡便及可直接用于活體測定等優點[20]。由于我們將載體進行了改建，使載體上帶有EGFP，因此只要出現熒光則表示有TGF-β3蛋白形成。本研究結果表明，BMSCs表達綠色熒光，提示有TGF-β3蛋白表達。
轉染72 h免疫熒光染色檢測示干細胞中有強綠色熒光表達，說明成功轉染并表達TGF-β3目的基因。實驗觀察各組培養細胞形態變化，實驗組向軟骨細胞分化明顯，對照組和空白對照組不明顯，表明rAd5-TGF-β3可促使BMSCs向成軟骨細胞分化。分別于7、21 d取細胞行Western blot檢測示，實驗組在相對分子質量為30 ×103處有陽性條帶，說明rAd5-TGF-β3轉染滇南小耳豬BMSCs后TGF-β3有表達。21 d取細胞行Western blot檢測示實驗組在相對分子質量為130 ×103處有陽性條帶，進一步表明rAd5-TGF-β3轉染滇南小耳豬BMSCs能誘導其向軟骨方向分化，有望成為軟骨組織工程種子細胞。
綜上述，本實驗成功構建豬TGF-β3基因表達腺病毒載體，并成功轉染BMSCs，提示TGF-β3蛋白可在BMSCs中較長時間穩定表達，促進BMSCs向軟骨細胞方向分化，有望為構建組織工程軟骨提供持續、高效表達TGF-β3的種子細胞。
因創傷或其他原因引起的關節軟骨損傷十分常見，軟骨自身修復困難。組織工程技術為修復全層軟骨缺損提供了新方法。BMSCs在特定條件下可誘導形成軟骨細胞，在軟骨組織工程中有良好應用前景，成為軟骨缺損修復的首選種子細胞[1-3]。TGF-β家族在軟骨損傷修復重建中起重要作用，TGF-β1、β2具有促進膠原合成與成熟的作用，但過度表達可導致病理性瘢痕形成；TGF-β3能促進BMSCs向軟骨方向增殖、分化[4-5]，還可調節TGF-β1、β2比例，抑制成纖維細胞增生，降低纖維化形成[6]，提高軟骨修復質量。本研究通過構建攜帶TGF-β3轉染基因的重組腺病毒表達系統，以期持續充分發揮TGF-β3促進BMSCs向軟骨方向增殖、分化的作用，為臨床應用基因治療軟骨缺損提供實驗依據。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要試劑、儀器
成年滇南小耳豬5只，雌雄不限，體重12～15 kg，由昆明醫科大學實驗動物中心提供，實驗過程符合《關于善待實驗動物的指導性意見》要求。
TGF-β3（R&D公司，美國）；血清5型重組腺病毒（recombinant adenovirus 5，rAd5）構建系統、pGSadeno腺病毒表達載體（武漢晶賽生物工程技術有限公司）；HEK293細胞、pOTB7-TGF-β3載體（ATCC公司，美國）；限制性內切酶（Takara公司，日本）；增強型綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGPF；Sigma公司，美國）；質粒提取試劑盒、質粒中提試劑盒（北京天根生化科技有限公司）。CO2培養箱（Thermo公司，美國）；倒置相差顯微鏡（Olympus公司，日本）；掃描電鏡（Philips公司，荷蘭）；序列測定和引物合成由昆明莫里克生物科技公司完成。
1.2 TGF-β3重組腺病毒載體的構建及鑒定
1.2.1 PCR擴增TGF-β3基因
以pOTB7-TGF-β3載體為模板，PCR擴增TGF-β3基因。TGF-β3引物：正義5'-CCCAAGCTTATGAAGATGCACTTGCAAAG-3'，引入BamHⅠ酶切位點；反義5'-CGCGGATCCTCACCG-GAAGCAGTAATTG-3'，引入 EcoRⅠ酶切位點。用上述特異性引物和高保真DNA聚合酶進行擴增，將PCR產物行1%瓊脂糖凝膠電泳并回收TGF-β3條帶，連接PCR產物至T載體中并測序。BamHⅠ、EcoRⅠ雙切酶鑒定，選取正確克隆TGF-β3片段擴大保存。
1.2.2 重組腺病毒穿梭質粒的構建
將測序正確的人TGF-β3基因亞克隆入腺病毒穿梭質粒載體pEC3.1（已克隆EGFP）上的相應多克隆位點間，連接HindⅢ和BamHⅠ雙酶切后的TGF-β3基因片段和pEC3.1載體，分別回收小片段和大片段。獲得質粒pEC3.1 HindⅢ+ BamHⅠ大片段和質粒TGF-β3 HindⅢ+ BamHⅠ小片段，通過連接酶T4連接，命名為pEC3.1-TGF-β3。質粒中提試劑盒提取質粒，HindⅢ、BamHⅠ行雙酶切鑒定。
1.2.3 攜帶TGF-β3轉染基因的重組腺病毒表達系統構建
通過體外同源重組，將TGF-β3表達框移至pGSadeno腺病毒表達載體上，用質粒中提試劑盒提取質粒，行PCR鑒定。鑒定后的重組腺病毒質粒用Pacl酶切，Pacl線性化的腺病毒DNA 250 μL加入至1個已接種1.5 ×106個HEK293細胞的60 mL培養瓶內，轉染后24 h更換為含10%FBS的L-DMEM培養基，轉染3 d后觀察細胞病態反應。當細胞有明顯病態反應且超過50%細胞脫壁時，收集細胞；以離心半徑13 cm、1 000 r/min離心5 min后去上清，加PBS液1 mL，- 80、37℃反復凍融3次，收集病毒行PCR分析；當出現上述現象時裂解上清，感染HEK293細胞，放大培養重組腺病毒，并采用半數組織培養感染劑量法測定腺病毒感染滴度＞ 1 ×109 PFU/mL。
1.3 滇南小耳豬BMSCs分離培養及鑒定
參照文獻[2]方法，采用密度梯度離心和貼壁篩選相結合的方法分離培養BMSCs。取滇南小耳豬5 只，經耳緣靜脈注射3%戊巴比妥（1 mL/kg）麻醉，雙側髂嵴脫毛。無菌操作下，分別于雙側髂嵴穿刺抽取骨髓約20 mL，置于50 mL離心管，加入L-DMEM培養液，充分吹打混勻后，以離心半徑13.5 cm、1 000 r/ min離心10 min；吸棄上層脂肪及上清液，再次加入含10%FBS 的L-DMEM培養基，充分吹打混勻后，分裝至25 cm2培養瓶中，48 h后換液，以后每2天換液1次，逐漸除去未貼壁細胞及紅細胞；當原代細胞培養10 d，細胞融合并覆蓋瓶底80%～90%時，0.25%胰蛋白酶2 mL消化。倒置相差顯微鏡下觀察，待細胞快要收縮時，吸棄胰蛋白酶，加入含10%FBS的L-DMEM培養基終止消化；輕輕吹打使細胞脫壁，檢測并調整細胞密度，按1∶2 比例傳代培養獲取第2代細胞備用。
待第2代細胞達80%～90%融合時收集細胞，吸棄培養基，PBS漂洗3次；胰蛋白酶消化制成單細胞懸液，流式細胞儀檢測細胞表面標記 CD29、CD44、CD45 的表達。
1.4 rAd5-TGF-β3轉染BMSCs
取第2代BMSCs以2 ×105個/孔密度接種于6 孔板，待細胞生長至70%～80%融合時，以感染復數為25（預實驗確定）加入rAd5-TGF-β3病毒液進行轉染，作為實驗組；轉染人腺病毒陰性（HK）空病毒載體為對照組；并設未轉染的細胞為空白對照組。培養24 h后吸棄病毒液，更換為含10%FBS的L-DMEM培養基繼續培養。
1.4.1 基因轉染BMSCs后轉染效果觀測
轉染24、48、72、96 h后行熒光顯微鏡觀測實驗組轉染效果。用0.25%胰蛋白酶消化細胞，PBS洗細胞1次，流式細胞儀檢測實驗組細胞轉染效率。
1.4.2 免疫熒光染色及Western
blot檢測TGF-β3蛋白表達 轉染72 h采用免疫熒光染色[7]檢測實驗組TGF-β3蛋白表達。轉染7、21 d提取實驗組、對照組及空白對照組蛋白，行Western blot檢測TGF-β3蛋白表達情況。
1.4.3 基因轉染后BMSCs成軟骨分化鑒定
實驗組細胞病毒轉染后每天行倒置相差顯微鏡觀察細胞形態。各組于21 d時行Western blot檢測Ⅱ型膠原蛋白表達情況。
2 結果
2.1 TGF-β3重組腺病毒載體的構建及鑒定
PCR擴增TGF-β3基因大小為930 bp，與TGF-β3大小相符（圖 1）；亞克隆至TGF-β3穿梭載體pE3.1后，HindⅢ、EcoRⅠ雙酶切鑒定，克隆大小為930 bp，為正確克隆，說明載體均有TGF-β3基因片段存在。TGF-β3載體體外同源重組后，PCR產物凝膠電泳結果顯示4 個克隆大小均為930 bp，為正確克隆，說明質粒中均有TGF-β3基因片段存在（圖 2）；轉染HEK293細胞后呈病態反應，細胞圓縮、聚合、相互抱成團狀（圖 3）。收集病毒行PCR分析目的條帶大小約為514 bp，符合預期，說明重組腺病毒rAd5-TGF-β3包裝成功（圖 4）。
圖1
TGF-β3基因陽性克隆的PCR檢測 M：Marker 1、2：TGF-β3 ? ?2.2 滇南小耳豬BMSCs形態學觀察及鑒定
原代細胞接種后3 h可見單核小圓形細胞貼壁；首次換液后可見少量梭形細胞，夾雜部分紅細胞；第2 次換液后可見梭形細胞增多，其他細胞明顯減少；原代培養10 d，細胞已基本融合呈漩渦樣生長（圖 5 a）。傳代后細胞形態良好呈束狀排列生長，增殖活躍，6～7 d可達90%融合（圖 5 b）。經流式細胞儀檢測，第2代細胞CD29、CD44、CD45特異性表面標志物均呈陽性表達，陽性率分別為99.49%、99.98%、99.93%。
2.3 rAd5-TGF-β3轉染BMSCs相關檢測
2.3.1 轉染效果觀測
rAd5-TGF-β3轉染BMSCs 24～96 h，熒光顯微鏡下均可觀察到熒光表達，且隨時間延長熒光表達明顯增加（圖 6）。流式細胞儀檢測示，轉染后24、48、72、96 h實驗組細胞轉染效率分別為28.15%、77.84%、84.86%、81.57%，轉染72 h時病毒達最佳轉染效果。
2.3.2 免疫熒光染色及Western
blot檢測TGF-β3蛋白表達 rAd5-TGF-β3 轉染BMSCs 72 h免疫熒光染色示，細胞質內有明顯TGF-β3蛋白表達（圖 7）。轉染后7、21 d Western blot檢測示，實驗組在相對分子質量為30 ×103處有TGF-β3陽性條帶，而對照組和空白對照組均呈陰性（圖 8）。
2.3.3 基因轉染后BMSCs成軟骨分化鑒定
實驗組培養7 d時，細胞呈紡錘形或梭形（圖 9 a）；14 d時細胞形態進一步改變，呈漩渦狀排列，一部分不規則形態像軟骨細胞以集落方式生長；21 d時細胞形態猶如軟骨細胞，為多邊形，較圓，呈“鋪路石”樣外觀（圖 9 b）。對照組和空白對照組細胞向軟骨分化不明顯，7 d呈長梭形；14 d大多數細胞沿胞體長軸呈有序排列；21 d細胞呈均勻分布的紡錘形（圖 9 c、d）。培養21 d時Western blot檢測示，在相對分子質量為130 ×103處，實驗組有Ⅱ型膠原陽性條帶，對照組和空白對照組均呈陰性（圖 10）。
圖10
培養21 d各組Western blot檢測Ⅱ型膠原蛋白表達 Mr：相對分子質量 1：空白對照組 2：對照組 3：實驗組
Figure10.
Western blot detection of collagen type Ⅱ in BMSCs at 21 days after culture in each group Mr: Relative molecular mass Lane 1: Blank control group Lane 2: Control group Lane 3: Experimental group
3 討論
BMSCs作為軟骨組織工程的種子細胞來源，其優越性已被多項研究證實[8-9]。滇南小耳豬在解剖學、生理學、疾病發生機制等方面與人相似，逐漸成為生命科學研究的重要實驗動物[10-12]。故本實驗選擇滇南小耳豬BMSCs進行研究。
尋找合適條件促進BMSCs增殖并向軟骨細胞分化，是目前軟骨組織工程學研究的方向之一[13]。在軟骨分化過程中，生長因子起重要作用。TGF-β3能誘導多種細胞合成和分泌細胞外基質，調控干細胞的增殖 和定向分化，尤其是誘導BMSCs向軟骨細胞分化，它參與了BMSCs向軟骨分化過程中的細胞聚集、增殖、分化過程，是觸發BMSCs向軟骨分化的起始因子[14] 。
基因增強組織工程是以MSCs作為靶細胞的基因治療和組織工程相結合的技術，在實際應用中，可通過一定載體將目的基因轉染入靶細胞，內源性誘導其分化[15]。轉基因技術可將多種軟骨生長因子導入細胞，促進軟骨再生，具有廣闊應用前景[16]。本實驗采用軟骨組織工程與基因治療相結合的技術，利用腺病毒載體將TGF-β3基因導入靶細胞，使其在靶細胞內高效表達，誘導BMSCs向軟骨細胞轉化。我們采用更直接的細菌內同源重組方法產生重組腺病毒，將TGF-β3全長基因介導入種子細胞BMSCs，使其自身表達TGF-β3。腺病毒是目前常用的基因轉移載體，其優點在于安全性高、免疫途徑簡便、插入外源基因容量大[17]，攜帶的基因是以附加體形式存在于宿主細胞核內，不整合至宿主細胞基因組，故不引起插入突變，且介導的基因表達持續穩定[18]。本實驗選擇的rAd5含有外源基因，被插入E1區，可被HEK293細胞基因整合，從而持續得到E1區蛋白。
本研究采用EGFP作為報告基因，EGFP是一種能發出綠色熒光的報告分子，常用于插入載體中與目的基因一起表達融合蛋白，通過檢測熒光的位置及強度來了解目的基因的表達及定位[19]；EGFP作為報告分子，具有無需加任何底物、熒光性質穩定、相對分子質量小、對細胞無毒性、作為熒光靶使用簡便及可直接用于活體測定等優點[20]。由于我們將載體進行了改建，使載體上帶有EGFP，因此只要出現熒光則表示有TGF-β3蛋白形成。本研究結果表明，BMSCs表達綠色熒光，提示有TGF-β3蛋白表達。
轉染72 h免疫熒光染色檢測示干細胞中有強綠色熒光表達，說明成功轉染并表達TGF-β3目的基因。實驗觀察各組培養細胞形態變化，實驗組向軟骨細胞分化明顯，對照組和空白對照組不明顯，表明rAd5-TGF-β3可促使BMSCs向成軟骨細胞分化。分別于7、21 d取細胞行Western blot檢測示，實驗組在相對分子質量為30 ×103處有陽性條帶，說明rAd5-TGF-β3轉染滇南小耳豬BMSCs后TGF-β3有表達。21 d取細胞行Western blot檢測示實驗組在相對分子質量為130 ×103處有陽性條帶，進一步表明rAd5-TGF-β3轉染滇南小耳豬BMSCs能誘導其向軟骨方向分化，有望成為軟骨組織工程種子細胞。
綜上述，本實驗成功構建豬TGF-β3基因表達腺病毒載體，并成功轉染BMSCs，提示TGF-β3蛋白可在BMSCs中較長時間穩定表達，促進BMSCs向軟骨細胞方向分化，有望為構建組織工程軟骨提供持續、高效表達TGF-β3的種子細胞。
