引用本文： 崔爽爽, 趙文君, 于順祿, 邢國勝, 趙鳳儀. 干細胞微環境力學刺激調節干細胞分化的研究現狀. 中國修復重建外科雜志, 2014, 28(1): 100-104. doi: 10.7507/1002-1892.20140022 復制
近年，對干細胞體外分化影響因素的研究已從化學和生物方面開始聚焦于力學刺激對干細胞分化的作用[1]。越來越多研究表明，干細胞的體外微環境及干細胞相互作用的力學刺激對調節干細胞生長、增殖和分化均具有非常重要的作用[2-3]。如在斑馬魚的原腸胚形成期，干細胞分化受到黏附力的影響[4]；使用原子力顯微鏡檢測相鄰細胞間的黏附力發現不同胚層內有不同黏附力，外胚層中的相鄰細胞結合比中胚層和內胚層中更松散[4]，表明胚胎干細胞（embryonic stem cells，ESCs）能感應外部機械力，并表現出相應的分化差異。除了ESCs，成體干細胞也可對外部機械力作出反應，如MSCs在1 Hz頻率、15%應變幅度的單向循環拉力下，無需添加生長因子即可向平滑肌細胞（smooth muscle cells，SMCs）分化，并表現出較高的增殖速率[5]。干細胞微環境中力學刺激對調節干細胞形態、內部結構和分化均具有重要作用。本文主要從機械載荷、細胞培養基質硬度、培養基質納米形貌以及細胞形狀4個方面綜述力學刺激對干細胞分化的影響。
1 機械載荷對細胞分化的影響
近年，關于機械載荷調控干細胞行為的研究越來越多。通過測量不同來源的機械載荷，包括周期性張應力、循環靜水壓力、層流剪應力及靜態對照對MSCs分化產生的影響發現，來源不同或同一來源不同參數的機械刺激均能改變MSCs的形狀、大小、排列及分化狀態[6]。
1.1 剪應力效應
剪應力在許多生物學過程中發揮重要作用，目前這方面研究非常廣泛，主要集中于觀察其誘導干細胞分化，特別是向血管細胞分化的能力。在三維仿生血管中生長的大鼠ESCs（mouse ESCs，mESCs）在剪應力作用下進一步向內皮細胞和SMCs分化，貼附于管腔面的細胞轉化為內皮細胞，而管壁縫隙處和暴露于圓周拉伸力之下的細胞轉化成SMCs[7]。此外，在三維工程血管環境下，搏動的液流使MSCs的血管內皮黏附蛋白和CD34表達水平上調，α平滑肌肌動蛋白和鈣結合蛋白的蛋白水平降低，而α平滑肌肌動蛋白、平滑肌肌纖維重鏈和鈣結合蛋白的mRNA水平無明顯改變[8]。同樣，對生長于平行板流動小室內的mESCs施加穩定的流體剪應力，會明顯影響細胞的形態和排列，細胞形態由成纖維細胞樣變為紡錘形，細胞由隨機排列變為與流體方向平行排列，增加了內皮細胞表面標志物CD31的表達[9]。這些研究表明，流體剪應力對干細胞的功能和分化方向有著非常重要的影響。
剪應力同樣影響ESCs的早期分化。將mESCs接種于包被了膠原蛋白的玻片上，靜力條件下培養2 d后施加15 dyne/cm2的剪切力繼續培養2 d，觀察細胞分化標記物的表達情況，結果發現與靜力對照組細胞相比，細胞在剪切力作用下，Flk1（中胚層）、Tie2（內皮層）和Runx1（造血細胞）這3種早期分化標記物的表達量分別增加了2.6、1.5和1.5倍[10]。
1.2 機械牽張力
機械牽張力在ESCs分化，尤其在原腸胚時期發揮關鍵作用，但體外測定機械牽張力對ESCs分化影響的研究較少。對單個ESCs施加0.3 Hz頻率、17.5 Pa的局部牽張力，24 h后OCT3/4的表達減少35%，72 h后減少50%，而未施加牽張力的細胞仍保持在未分化狀態，表明即使很小的力作用于細胞上也能促進其分化[11]。由于細胞柔軟程度不同，對外力反應的敏感程度也有所不同，未分化細胞比已分化的同類細胞柔軟7 倍，因此對局部應力反應比較敏感，對于較小的應力，未分化細胞反應更加敏銳[11]。
機械牽張力除影響ESCs分化外，在MSCs的分化及成體組織（血管和骨骼）的正常修復中也發揮著重要作用。將人MSCs（human MSCs，hMSCs）接種于Ⅰ 型膠原基質上，在0.5 Hz頻率、3%～5%應變幅度的周期性張應力作用下，其成骨標志物表達增加，周圍基質的生物物理性能呈成骨樣改變，而成軟骨、成脂、成神經細胞標志物表達降低[12]。將磁珠和hMSCs置于磁場中孵育，施加1 Hz頻率的應力于細胞上，結果在機械應力作用下，細胞形狀無明顯改變，成骨、成血管和成軟骨分化標志物Ⅰ型膠原、VEGF和轉錄因子SOX-9的表達增加[13]。接種于硅膜上的MSCs在1 Hz頻率、15%應變幅度的單向循環拉力下，無需添加生長因子即可向SMCs分化，且細胞排列方向與拉力方向垂直，并表現出較高的增殖速率[5]。有研究報道，將MSCs培養于有伸縮性能的膠原蛋白三維環境中，通過生物反應器對三維培養基進行周期性拉伸，在1 Hz頻率、10%應變幅度的持續周期性拉伸力中作用7 d，糖胺聚糖表達增加，細胞出現軟骨分化傾向[14]。
1.3 壓應力
壓應力是指抵抗物體有壓縮趨勢的應力。研究表明在體內、外對hMSCs施加周期性壓應力，能夠刺激破骨細胞的分化和骨形成[15-17]。盡管也有大量研究表明周期性壓縮性載荷可促使hMSCs分化出成軟骨細胞的表型[18-19]，但壓應力開啟了怎樣的機械信號傳導過程仍不清楚。
上述研究可見，力學載荷對干細胞分化有非常重要的作用，研究者可通過施加不同力學載荷，模擬干細胞在自然條件下的生活狀態，了解疾病的病理生理過程。當對干細胞施加剪應力時，干細胞往往傾向于表達內皮細胞表面標記物，細胞呈與剪應力平行的方向排列，并最終向血管細胞分化；而當對干細胞施加周期性拉伸力時，ESCs的干性降低，分化趨勢明顯[11]，干細胞可能會向骨、軟骨及肌細胞等不同方向分化。
2 細胞培養基質硬度對干細胞分化的影響
2.1 對干細胞譜系分化的影響
未分化的干細胞十分柔軟，因此其對培養基質的硬度非常敏感。近年來，研究者利用多種彈性基質培養干細胞，探討基質硬度對干細胞分化行為的影響及其機制。結果發現，基質硬度可影響干細胞的譜系分化。硬度為13～17 kPa時，干細胞向肌原細胞方向分化；硬度為45～49 kPa時，則向成骨細胞方向分化[20]。Engler等[21]分別在硬度類似腦組織、肌肉和骨骼的不同彈性二維基質上培養MSCs，MSCs分別向神經細胞、肌細胞或骨細胞方向分化。TGF-β是促進MSCs向軟骨或肌細胞分化的因子，它在軟基質和硬基質上對細胞分化的影響有所不同，在硬基質上易表達SMCs標志物，而在軟基質上會上調軟骨細胞標志物表達水平，下調成脂標志物表達水平[22]。另有研究表明，在有硬度梯度的基質上培養MSCs時，MSCs會向硬度較大的地方遷移，并伴隨出現肌細胞和神經細胞標志物的表達[23]。在軟凝膠上誘導培養成體神經干細胞，其分化為神經元細胞，在硬基質上則促進其分化為神經膠質細胞[24]。近期有研究者用聚丙烯酰胺（polyacrylamide，PA）凝膠培養臍帶干細胞，將其接種于1.46 kPa和26.12 kPa兩種硬度的PA凝膠上，Runx2和骨鈣素基因在較硬的PA凝膠基質上表達量較高；骨形成早期標記物Ⅰ型膠原在生長于3種硬度基質（包括玻璃蓋玻片對照基質）上的細胞中表達量無明顯區別，但細胞形成的鈣結節數量與培養基質的硬度成正相關，表明力學信號在干細胞分化的早期和晚期作用不同[25]。接種于不同彈性的聚二甲硅氧烷（polydimethylsiloxane，PDMS）二維基質上的ESCs，基質硬度從41 kPa增加至2.7 MPa時，中胚層基因的表達明顯升高；而相較于軟基質，在硬基質上ESCs的成骨分化基因Runx2和Spp1表達量較高[26]。hMSCs在硬度為281 Pa的三維水凝膠上用不加任何額外生化因子的普通培養基培養時，成神經細胞的標志物表達量增高，細胞增殖速率也提高[27]。有研究用不同流變學系數的三維水凝膠培養干細胞觀察細胞的分化，在硬度分別為7、25和75 Pa的三維水凝膠中，MSCs分別向成神經細胞、成肌細胞和成骨細胞方向分化[28]。
2.2 對干細胞表面標記物表達的影響
由于干細胞特性的改變與表面標記物的改變有關，因此有學者[29]通過免疫組織化學染色法測定不同彈性基質表面上羊水干細胞MSCs典型標記物CD44、CD90、CD105和N-鈣黏蛋白的表達，來研究基質硬度對干細胞特性的影響。結果發現，CD44、CD105、CD90在2 kPa和5 kPa基質上的表達顯著強于其他基質，15 kPa和50 kPa基質上的表達較弱，在組織培養板（tissue culture plate，TCP）上的表達最弱；N-鈣黏蛋白在2、5、15 kPa基質上表達最強，50 kPa基質和TCP上表達明顯變弱。表明基質硬度影響干細胞表面標記物的表達，可能會影響干細胞的性能與行為；而在較低彈性模量上，細胞與基質有更充分的交互作用。
3 細胞培養基質納米形貌對干細胞分化的影響
3.1 納米形貌促進多種干細胞向特定細胞系分化
天然細胞外基質具有豐富的納米形貌，單個細胞外基質分子也在納米尺度，如膠原大小約為300.0 nm × 1.5 nm（長×寬）。這些細胞外基質分子可形成直徑為260～410 nm、長達幾十微米纖維絲狀的結構。在影響細胞分化的各種因素中，細胞培養基質的納米形貌也起重要作用。應用納米纖維制備的各種不同硬度、表面有不同微結構的支架可用于此方面的研究。如在不含成骨誘導因子的培養基中，交聯有二氧化鈦納米管（直徑為70 nm和100 nm）的鈦表面能夠促進hMSCs的成骨分化[30]。除了hMSCs成骨分化研究外，也有報道培養基質納米形貌在促進干細胞向其他細胞系分化過程中作用的研究，如納米結構被用來使MSCs和mESCs優先向神經細胞系分化[31]。此外，納米纖維的直徑可影響鼠神經前體細胞的分化，與在TCP表面相比，在直徑為238 nm的纖維上少突細胞的分化增加40%，在直徑749 nm的纖維上神經細胞的分化增加20%[32]。這些研究表明，精確尺寸的納米形貌可用來促使多種干細胞向某種特定細胞分化，但這些過程的內在分子機制尚不清楚。
3.2 納米形貌調節基底硬度
不同的納米形貌可通過調節基底硬度來調控干細胞的分化行為[33]。Fu等 [34]通過光刻和深反應離子蝕刻技術在PDMS基底上制備了直徑為1.83 μm、間距為4 μm的均勻微米小柱，通過改變柱高（0.97～14.7 μm）來調節基底硬度，小柱越高，基底越軟，從而構建硬度范圍為1.31～1 556 nN/μm的基底；將hMSCs接種于不同長度的微米小柱上，在成骨成脂混合培養基中誘導2周后，對誘導后細胞同時行ALP染色和油紅O染色，結果發現細胞在較低的小柱上表達較高的ALP，而在較高的小柱上分泌較多脂滴。說明在較硬的基底上，hMSCs傾向于成骨分化，在較軟的基底上則傾向于成脂分化。Nam等[35]將間充質前體細胞培養接種于較軟的納米纖維蝕刻表面上，成軟骨細胞標志物表達量升高，而在較硬表面上成骨細胞標志物表達量升高。
目前，有關培養基質納米形貌對干細胞分化的作用也有截然不同的研究結果。Migliorini等[36]通過比較平面硬基質、納米結構硬基質和納米結構軟基質上細胞的分化情況，發現培養基質納米形貌作為一個獨立因素對神經前體細胞的分化并無影響，但其可介導基質的硬度發生變化，從而對細胞分化產生影響。
3.3 納米纖維的排列影響干細胞分化方向
整齊排列的納米纖維不僅可促進細胞骨架的重組，還可促進hMSCs細胞及細胞核的伸長，而這有利于細胞向肌細胞方向分化[37]；若分別在規則排列和隨機排列膠原簇上培養MSCs，前者培養細胞的肌腱特異表達標記物如Scleraxis、腱調蛋白、肌腱蛋白C和膠原蛋白Ⅲ的表達量顯著高于后者培養的細胞。另外，規則排列膠原簇上細胞成骨標記物骨鈣素的表達受到了抑制[38]。
4 細胞形狀對干細胞分化的影響
細胞在分化中傾向于改變自身的形狀和形態特征，已有不少研究表明細胞的大小和形狀在細胞的生存、發展和分化過程中發揮了重要作用[39]。McBeath等[40]率先測量干細胞形態對其分化的影響，他們通過控制硬基質上黏附島的大小，比較了兩種細胞的反應，黏附區域較小的hMSCs保持三維形態，黏附區域較大（104 μm2）的細胞形狀則比較平坦。他們還發現細胞在成骨成脂混合培養時，黏附區域較小的細胞傾向于成脂分化，而黏附區域較大的細胞則傾向于成骨分化。改變細胞接種密度也得到了相同結果：細胞在低密度培養時形態伸展較大，易于成骨分化；而在高密度培養時，細胞伸展區域受限，細胞表達成脂標志物。Zhang等[41]用電子束蒸鍍法在干凈玻璃蓋玻片上制成含有面積為1 000 μm2環形微刻圖案的培養表面，當細胞接種于有微刻圖案的培養基底上時處于靜息狀態；而在其表面上培養24 h后，經免疫組織化學染色發現微刻圖案內的細胞Stro-1和內皮糖蛋白（MSCs特異標記物）表達量高于光滑對照組細胞。表明微刻圖案限定了細胞形狀，繼而限制了干細胞的分化，細胞形狀在一定程度上影響了其分化。
細胞形狀可作為不同細胞命運相互轉換的開關。Gao等[42]將hMSCs分別接種于有微刻圖案并包被纖連蛋白的小“島”（1 024 μm2）、大“島”（10 000 μm2）及無“島”并包被有纖連蛋白的光滑基質上，生長于大“島”和光滑基質上的細胞黏附較強、伸展較大，而小“島”上的細胞則被限制伸展，保持圓形；在TGF-β3作用下培養7 d后，生長于大“島”和光滑基質上的細胞有40%表達了SMCs的標記物鈣調蛋白，而生長于小“島”上的細胞有40%表達了軟骨細胞標記物Ⅱ型膠原；經TGF-β3誘導1 d后，大“島”和光滑基質上伸展較大的細胞SMCs基因表達量快速升高，而小“島”上的圓形細胞成軟骨基因表達量快速升高。上述結果表明細胞形狀確實可影響hMSCs的譜系分化。
5 總結與展望
干細胞在再生醫學和組織損傷與修復方面的應用前景非常廣闊，通過合適、精確的培養條件將干細胞分化為某種特定組織是臨床應用的基礎。對干細胞分化力學影響因素的研究拓寬了人們對干細胞功能的控制及其人工可操作性方面的認識，并為更深入地研究干細胞分化機制奠定了基礎。干細胞分化的人工操作及相關實驗的設計和對照的選擇必須考慮細胞環境的生化特性和機械學特性。充分了解干細胞對機械刺激的反應能夠幫助我們設計控制細胞分化的策略，擴大干細胞的治療潛能。
近年，對干細胞體外分化影響因素的研究已從化學和生物方面開始聚焦于力學刺激對干細胞分化的作用[1]。越來越多研究表明，干細胞的體外微環境及干細胞相互作用的力學刺激對調節干細胞生長、增殖和分化均具有非常重要的作用[2-3]。如在斑馬魚的原腸胚形成期，干細胞分化受到黏附力的影響[4]；使用原子力顯微鏡檢測相鄰細胞間的黏附力發現不同胚層內有不同黏附力，外胚層中的相鄰細胞結合比中胚層和內胚層中更松散[4]，表明胚胎干細胞（embryonic stem cells，ESCs）能感應外部機械力，并表現出相應的分化差異。除了ESCs，成體干細胞也可對外部機械力作出反應，如MSCs在1 Hz頻率、15%應變幅度的單向循環拉力下，無需添加生長因子即可向平滑肌細胞（smooth muscle cells，SMCs）分化，并表現出較高的增殖速率[5]。干細胞微環境中力學刺激對調節干細胞形態、內部結構和分化均具有重要作用。本文主要從機械載荷、細胞培養基質硬度、培養基質納米形貌以及細胞形狀4個方面綜述力學刺激對干細胞分化的影響。
1 機械載荷對細胞分化的影響
近年，關于機械載荷調控干細胞行為的研究越來越多。通過測量不同來源的機械載荷，包括周期性張應力、循環靜水壓力、層流剪應力及靜態對照對MSCs分化產生的影響發現，來源不同或同一來源不同參數的機械刺激均能改變MSCs的形狀、大小、排列及分化狀態[6]。
1.1 剪應力效應
剪應力在許多生物學過程中發揮重要作用，目前這方面研究非常廣泛，主要集中于觀察其誘導干細胞分化，特別是向血管細胞分化的能力。在三維仿生血管中生長的大鼠ESCs（mouse ESCs，mESCs）在剪應力作用下進一步向內皮細胞和SMCs分化，貼附于管腔面的細胞轉化為內皮細胞，而管壁縫隙處和暴露于圓周拉伸力之下的細胞轉化成SMCs[7]。此外，在三維工程血管環境下，搏動的液流使MSCs的血管內皮黏附蛋白和CD34表達水平上調，α平滑肌肌動蛋白和鈣結合蛋白的蛋白水平降低，而α平滑肌肌動蛋白、平滑肌肌纖維重鏈和鈣結合蛋白的mRNA水平無明顯改變[8]。同樣，對生長于平行板流動小室內的mESCs施加穩定的流體剪應力，會明顯影響細胞的形態和排列，細胞形態由成纖維細胞樣變為紡錘形，細胞由隨機排列變為與流體方向平行排列，增加了內皮細胞表面標志物CD31的表達[9]。這些研究表明，流體剪應力對干細胞的功能和分化方向有著非常重要的影響。
剪應力同樣影響ESCs的早期分化。將mESCs接種于包被了膠原蛋白的玻片上，靜力條件下培養2 d后施加15 dyne/cm2的剪切力繼續培養2 d，觀察細胞分化標記物的表達情況，結果發現與靜力對照組細胞相比，細胞在剪切力作用下，Flk1（中胚層）、Tie2（內皮層）和Runx1（造血細胞）這3種早期分化標記物的表達量分別增加了2.6、1.5和1.5倍[10]。
1.2 機械牽張力
機械牽張力在ESCs分化，尤其在原腸胚時期發揮關鍵作用，但體外測定機械牽張力對ESCs分化影響的研究較少。對單個ESCs施加0.3 Hz頻率、17.5 Pa的局部牽張力，24 h后OCT3/4的表達減少35%，72 h后減少50%，而未施加牽張力的細胞仍保持在未分化狀態，表明即使很小的力作用于細胞上也能促進其分化[11]。由于細胞柔軟程度不同，對外力反應的敏感程度也有所不同，未分化細胞比已分化的同類細胞柔軟7 倍，因此對局部應力反應比較敏感，對于較小的應力，未分化細胞反應更加敏銳[11]。
機械牽張力除影響ESCs分化外，在MSCs的分化及成體組織（血管和骨骼）的正常修復中也發揮著重要作用。將人MSCs（human MSCs，hMSCs）接種于Ⅰ 型膠原基質上，在0.5 Hz頻率、3%～5%應變幅度的周期性張應力作用下，其成骨標志物表達增加，周圍基質的生物物理性能呈成骨樣改變，而成軟骨、成脂、成神經細胞標志物表達降低[12]。將磁珠和hMSCs置于磁場中孵育，施加1 Hz頻率的應力于細胞上，結果在機械應力作用下，細胞形狀無明顯改變，成骨、成血管和成軟骨分化標志物Ⅰ型膠原、VEGF和轉錄因子SOX-9的表達增加[13]。接種于硅膜上的MSCs在1 Hz頻率、15%應變幅度的單向循環拉力下，無需添加生長因子即可向SMCs分化，且細胞排列方向與拉力方向垂直，并表現出較高的增殖速率[5]。有研究報道，將MSCs培養于有伸縮性能的膠原蛋白三維環境中，通過生物反應器對三維培養基進行周期性拉伸，在1 Hz頻率、10%應變幅度的持續周期性拉伸力中作用7 d，糖胺聚糖表達增加，細胞出現軟骨分化傾向[14]。
1.3 壓應力
壓應力是指抵抗物體有壓縮趨勢的應力。研究表明在體內、外對hMSCs施加周期性壓應力，能夠刺激破骨細胞的分化和骨形成[15-17]。盡管也有大量研究表明周期性壓縮性載荷可促使hMSCs分化出成軟骨細胞的表型[18-19]，但壓應力開啟了怎樣的機械信號傳導過程仍不清楚。
上述研究可見，力學載荷對干細胞分化有非常重要的作用，研究者可通過施加不同力學載荷，模擬干細胞在自然條件下的生活狀態，了解疾病的病理生理過程。當對干細胞施加剪應力時，干細胞往往傾向于表達內皮細胞表面標記物，細胞呈與剪應力平行的方向排列，并最終向血管細胞分化；而當對干細胞施加周期性拉伸力時，ESCs的干性降低，分化趨勢明顯[11]，干細胞可能會向骨、軟骨及肌細胞等不同方向分化。
2 細胞培養基質硬度對干細胞分化的影響
2.1 對干細胞譜系分化的影響
未分化的干細胞十分柔軟，因此其對培養基質的硬度非常敏感。近年來，研究者利用多種彈性基質培養干細胞，探討基質硬度對干細胞分化行為的影響及其機制。結果發現，基質硬度可影響干細胞的譜系分化。硬度為13～17 kPa時，干細胞向肌原細胞方向分化；硬度為45～49 kPa時，則向成骨細胞方向分化[20]。Engler等[21]分別在硬度類似腦組織、肌肉和骨骼的不同彈性二維基質上培養MSCs，MSCs分別向神經細胞、肌細胞或骨細胞方向分化。TGF-β是促進MSCs向軟骨或肌細胞分化的因子，它在軟基質和硬基質上對細胞分化的影響有所不同，在硬基質上易表達SMCs標志物，而在軟基質上會上調軟骨細胞標志物表達水平，下調成脂標志物表達水平[22]。另有研究表明，在有硬度梯度的基質上培養MSCs時，MSCs會向硬度較大的地方遷移，并伴隨出現肌細胞和神經細胞標志物的表達[23]。在軟凝膠上誘導培養成體神經干細胞，其分化為神經元細胞，在硬基質上則促進其分化為神經膠質細胞[24]。近期有研究者用聚丙烯酰胺（polyacrylamide，PA）凝膠培養臍帶干細胞，將其接種于1.46 kPa和26.12 kPa兩種硬度的PA凝膠上，Runx2和骨鈣素基因在較硬的PA凝膠基質上表達量較高；骨形成早期標記物Ⅰ型膠原在生長于3種硬度基質（包括玻璃蓋玻片對照基質）上的細胞中表達量無明顯區別，但細胞形成的鈣結節數量與培養基質的硬度成正相關，表明力學信號在干細胞分化的早期和晚期作用不同[25]。接種于不同彈性的聚二甲硅氧烷（polydimethylsiloxane，PDMS）二維基質上的ESCs，基質硬度從41 kPa增加至2.7 MPa時，中胚層基因的表達明顯升高；而相較于軟基質，在硬基質上ESCs的成骨分化基因Runx2和Spp1表達量較高[26]。hMSCs在硬度為281 Pa的三維水凝膠上用不加任何額外生化因子的普通培養基培養時，成神經細胞的標志物表達量增高，細胞增殖速率也提高[27]。有研究用不同流變學系數的三維水凝膠培養干細胞觀察細胞的分化，在硬度分別為7、25和75 Pa的三維水凝膠中，MSCs分別向成神經細胞、成肌細胞和成骨細胞方向分化[28]。
2.2 對干細胞表面標記物表達的影響
由于干細胞特性的改變與表面標記物的改變有關，因此有學者[29]通過免疫組織化學染色法測定不同彈性基質表面上羊水干細胞MSCs典型標記物CD44、CD90、CD105和N-鈣黏蛋白的表達，來研究基質硬度對干細胞特性的影響。結果發現，CD44、CD105、CD90在2 kPa和5 kPa基質上的表達顯著強于其他基質，15 kPa和50 kPa基質上的表達較弱，在組織培養板（tissue culture plate，TCP）上的表達最弱；N-鈣黏蛋白在2、5、15 kPa基質上表達最強，50 kPa基質和TCP上表達明顯變弱。表明基質硬度影響干細胞表面標記物的表達，可能會影響干細胞的性能與行為；而在較低彈性模量上，細胞與基質有更充分的交互作用。
3 細胞培養基質納米形貌對干細胞分化的影響
3.1 納米形貌促進多種干細胞向特定細胞系分化
天然細胞外基質具有豐富的納米形貌，單個細胞外基質分子也在納米尺度，如膠原大小約為300.0 nm × 1.5 nm（長×寬）。這些細胞外基質分子可形成直徑為260～410 nm、長達幾十微米纖維絲狀的結構。在影響細胞分化的各種因素中，細胞培養基質的納米形貌也起重要作用。應用納米纖維制備的各種不同硬度、表面有不同微結構的支架可用于此方面的研究。如在不含成骨誘導因子的培養基中，交聯有二氧化鈦納米管（直徑為70 nm和100 nm）的鈦表面能夠促進hMSCs的成骨分化[30]。除了hMSCs成骨分化研究外，也有報道培養基質納米形貌在促進干細胞向其他細胞系分化過程中作用的研究，如納米結構被用來使MSCs和mESCs優先向神經細胞系分化[31]。此外，納米纖維的直徑可影響鼠神經前體細胞的分化，與在TCP表面相比，在直徑為238 nm的纖維上少突細胞的分化增加40%，在直徑749 nm的纖維上神經細胞的分化增加20%[32]。這些研究表明，精確尺寸的納米形貌可用來促使多種干細胞向某種特定細胞分化，但這些過程的內在分子機制尚不清楚。
3.2 納米形貌調節基底硬度
不同的納米形貌可通過調節基底硬度來調控干細胞的分化行為[33]。Fu等 [34]通過光刻和深反應離子蝕刻技術在PDMS基底上制備了直徑為1.83 μm、間距為4 μm的均勻微米小柱，通過改變柱高（0.97～14.7 μm）來調節基底硬度，小柱越高，基底越軟，從而構建硬度范圍為1.31～1 556 nN/μm的基底；將hMSCs接種于不同長度的微米小柱上，在成骨成脂混合培養基中誘導2周后，對誘導后細胞同時行ALP染色和油紅O染色，結果發現細胞在較低的小柱上表達較高的ALP，而在較高的小柱上分泌較多脂滴。說明在較硬的基底上，hMSCs傾向于成骨分化，在較軟的基底上則傾向于成脂分化。Nam等[35]將間充質前體細胞培養接種于較軟的納米纖維蝕刻表面上，成軟骨細胞標志物表達量升高，而在較硬表面上成骨細胞標志物表達量升高。
目前，有關培養基質納米形貌對干細胞分化的作用也有截然不同的研究結果。Migliorini等[36]通過比較平面硬基質、納米結構硬基質和納米結構軟基質上細胞的分化情況，發現培養基質納米形貌作為一個獨立因素對神經前體細胞的分化并無影響，但其可介導基質的硬度發生變化，從而對細胞分化產生影響。
3.3 納米纖維的排列影響干細胞分化方向
整齊排列的納米纖維不僅可促進細胞骨架的重組，還可促進hMSCs細胞及細胞核的伸長，而這有利于細胞向肌細胞方向分化[37]；若分別在規則排列和隨機排列膠原簇上培養MSCs，前者培養細胞的肌腱特異表達標記物如Scleraxis、腱調蛋白、肌腱蛋白C和膠原蛋白Ⅲ的表達量顯著高于后者培養的細胞。另外，規則排列膠原簇上細胞成骨標記物骨鈣素的表達受到了抑制[38]。
4 細胞形狀對干細胞分化的影響
細胞在分化中傾向于改變自身的形狀和形態特征，已有不少研究表明細胞的大小和形狀在細胞的生存、發展和分化過程中發揮了重要作用[39]。McBeath等[40]率先測量干細胞形態對其分化的影響，他們通過控制硬基質上黏附島的大小，比較了兩種細胞的反應，黏附區域較小的hMSCs保持三維形態，黏附區域較大（104 μm2）的細胞形狀則比較平坦。他們還發現細胞在成骨成脂混合培養時，黏附區域較小的細胞傾向于成脂分化，而黏附區域較大的細胞則傾向于成骨分化。改變細胞接種密度也得到了相同結果：細胞在低密度培養時形態伸展較大，易于成骨分化；而在高密度培養時，細胞伸展區域受限，細胞表達成脂標志物。Zhang等[41]用電子束蒸鍍法在干凈玻璃蓋玻片上制成含有面積為1 000 μm2環形微刻圖案的培養表面，當細胞接種于有微刻圖案的培養基底上時處于靜息狀態；而在其表面上培養24 h后，經免疫組織化學染色發現微刻圖案內的細胞Stro-1和內皮糖蛋白（MSCs特異標記物）表達量高于光滑對照組細胞。表明微刻圖案限定了細胞形狀，繼而限制了干細胞的分化，細胞形狀在一定程度上影響了其分化。
細胞形狀可作為不同細胞命運相互轉換的開關。Gao等[42]將hMSCs分別接種于有微刻圖案并包被纖連蛋白的小“島”（1 024 μm2）、大“島”（10 000 μm2）及無“島”并包被有纖連蛋白的光滑基質上，生長于大“島”和光滑基質上的細胞黏附較強、伸展較大，而小“島”上的細胞則被限制伸展，保持圓形；在TGF-β3作用下培養7 d后，生長于大“島”和光滑基質上的細胞有40%表達了SMCs的標記物鈣調蛋白，而生長于小“島”上的細胞有40%表達了軟骨細胞標記物Ⅱ型膠原；經TGF-β3誘導1 d后，大“島”和光滑基質上伸展較大的細胞SMCs基因表達量快速升高，而小“島”上的圓形細胞成軟骨基因表達量快速升高。上述結果表明細胞形狀確實可影響hMSCs的譜系分化。
5 總結與展望
干細胞在再生醫學和組織損傷與修復方面的應用前景非常廣闊，通過合適、精確的培養條件將干細胞分化為某種特定組織是臨床應用的基礎。對干細胞分化力學影響因素的研究拓寬了人們對干細胞功能的控制及其人工可操作性方面的認識，并為更深入地研究干細胞分化機制奠定了基礎。干細胞分化的人工操作及相關實驗的設計和對照的選擇必須考慮細胞環境的生化特性和機械學特性。充分了解干細胞對機械刺激的反應能夠幫助我們設計控制細胞分化的策略，擴大干細胞的治療潛能。