引用本文： 仲偉俍, 張衛國. 軟骨細胞微環境及微流控芯片技術在構建軟骨細胞微環境中的應用. 中國修復重建外科雜志, 2014, 28(1): 105-108. doi: 10.7507/1002-1892.20140023 復制
近年來，通過探討關節軟骨內細胞與細胞、細胞與細胞外基質、細胞與周圍物理和化學信號之間的相互作用，從而構建軟骨細胞再生微環境已成為研究熱點[1]。因此，系統深入地認識關節軟骨及軟骨細胞生理條件下的微環境和微結構，從而在體外盡可能地模擬軟骨細胞生存微環境，對于關節軟骨的修復和再生具有重要意義。利用微流控技術可對細胞微環境進行操控和研究，特別是在軟骨修復和再生等方面的優勢已引起學者們廣泛關注。基于上述背景，本文對軟骨細胞生存的微環境以及微流控芯片技術在構建該微環境中的應用作一綜述。
1 軟骨細胞生存的微環境
1.1 細胞外基質微環境
軟骨細胞外基質主要由固相和液相兩部分組成，主要成分為70%～80%水、10%～20%Ⅱ型膠原及5%～10%蛋白多糖[2]。軟骨細胞外基質除對細胞具有支持作用外，當有外力作用時還可影響細胞形態，調節正常細胞的代謝、增殖、遷移和分化以及細胞之間的信號傳遞，為軟骨細胞提供一種特殊的微環境[3]。軟骨細胞外基質內的Ⅱ型膠原蛋白是一種大分子物質，它由3條相似的多肽鏈螺旋排列而成，能使膠原分子承受較大張力。蛋白多糖亞單位由1個核心蛋白和共價連接其上的糖胺多糖組成，稱為蛋白多糖單體；單體再與透明質酸以非共價鍵結合，形成相對分子質量較大的蛋白多糖聚合體。蛋白多糖分布于基質內膠原網之間，可以控制細胞外基質含水量，使關節軟骨具有良好的抗壓能力；同時，蛋白多糖與膠原連接并相互作用，為維持軟骨功能提供有利條件。當細胞外基質的生物化學成分和組織結構發生改變時，關節軟骨的生物力學性能也隨之發生變化。
1.2 機械微環境
在生理條件下，關節軟骨受到的機械負荷主要為壓力，且該負荷為間歇性壓力，由動態壓力和靜態壓力交替完成。關節水平的壓力負荷會造成細胞水平的物理、電離子、生化等多方面改變，包括形變、液體流動、液體靜水壓、流動電勢、滲透壓、營養和離子的濃度梯度以及pH值等[4-5]。此外，相關的力學刺激還有剪切應力、張力和液體靜水壓力等。這些相關的力學刺激會導致細胞外基質內的細胞及細胞核發生相應改變，從而影響軟骨細胞的代謝和功能。
1.2.1 靜態壓力
由于關節軟骨最直接的功能是支持壓力負載，因而靜態壓力主要出現在靜息負重狀態下。軟骨在靜態壓力刺激下處于長時間形變，體外研究表明，軟骨細胞受到長時間靜態壓力刺激后，無論用何種培養方式，均會導致其合成代謝下降，表現為較低增殖率和細胞外基質合成下降[6-8]，并且隨靜態壓力強度增加，其生物合成代謝進一步下降[9]。有學者認為這一過程可能是由細胞和細胞外基質相互作用介導的，例如激活了細胞膜的某種受體[10]。此外，持續形變的細胞外基質會導致組織含水量下降，使軟骨細胞可用性營養成分供給減少。
1.2.2 動態壓力
動態壓力負荷刺激發生于機體日常活動中。相關研究表明，動態壓力負荷刺激（3%～6.8%形變振幅、0.01～0.1 Hz 頻率、作用4～48 h）會促進細胞外基質的合成與沉積[6, 11]。動態壓力對于軟骨細胞的刺激作用具有頻率依賴性，其能促進細胞增殖，但不一定促進細胞外基質合成，這可能與不同的機械信號傳遞機制有關。進一步研究發現，在細胞外基質合成方面，間歇性動態壓力刺激優于持續性動態壓力刺激[12-13]。
1.2.3 剪切應力
剪切應力常出現于關節活動的表面區域，因此也被認為是關節軟骨的一種重要力學刺激。有研究表明，體外動態剪切應力刺激（1%～3%切應變振幅、0.01～1 Hz 頻率，作用24 h）會促進細胞外基質合成[14]，其中促進膠原基質的合成優于促進蛋白多糖的合成。
1.2.4 液體靜水壓力
當軟骨處于負載狀態時，有一初始阻力對抗液體的分散流動，從而導致組織內部液體靜水壓力的產生。液體靜水壓力對于軟骨細胞代謝的調控作用不盡相同。有研究表明，5 MPa的液體靜水壓力刺激能夠提高膠原和蛋白多糖的合成，但也有研究采用相似的液體靜水壓力刺激發現蛋白多糖的合成被抑制[15-16]。
1.2.5 組織間隙液流動微環境
對于健康關節軟骨，大部分組成成分為水，軟骨細胞的代謝和營養傳遞主要通過關節軟骨動態壓縮產生的組織間隙液流動來調控[17]。因此，液體流動效應對于軟骨代謝具有重要影響。關節軟骨的組織間隙液主要由水和電解質組成，其不僅對軟骨細胞和基質具有營養傳遞作用，也會相應產生微小的機械信號刺激。正常生理微環境下，軟骨組織間隙液流動主要存在于關節軟骨淺表層和移行帶，并呈從淺表層至深層液體流動逐漸減少的趨勢。關節軟骨的淺表層受到的液體流動刺激較大，移行層較小，而中間層和深層幾乎無液體流動[18-19]。淺表層對于機械物理信號的刺激最敏感，產生的基質形變也最大，因而其組織間隙液流動也最明顯。
1.3 電場微環境
隨著液相的陽離子流經帶負電荷的蛋白多糖網絡，組織間隙液流動會產生流動電位和電流[20]。這些電場效應也會直接影響軟骨細胞的代謝和分化。有研究表明[21]，電場效應可促進軟骨移植物蛋白合成。也有研究表明，體外單層培養的軟骨細胞經過脈沖電場刺激會促進Ⅱ型膠原和蛋白多糖合成[22]。此外，由于蛋白多糖含有硫酸角質素和硫酸軟骨素糖胺多糖鏈，因此其富含帶負電荷的羧基及硫酸基團。這些負電荷之間產生相互排斥效應，從而使軟骨組織內部保持一種伸展狀態。因此即使軟骨基質未受外部作用力，膠原纖維也處于緊張狀態，以抑制蛋白多糖向外伸展的 力。
1.4 低氧微環境
在微觀結構上關節軟骨細胞內部的線粒體較少，細胞主要靠無氧糖酵解方式來獲取能量，這是它對其所存在低氧環境的一種適應。軟骨基質氧分壓從淺表層至深層逐漸降低，由＜ 10%降至＜ 1%[23]。這種濃度梯度分布在關節發生疾病時會被打亂，軟骨表層的氧分壓也降低，導致軟骨基質受到破壞。有研究發現軟骨細胞在低氧分壓條件下，表現為基質金屬蛋白酶抑制因子1、整合素連接激酶和缺氧誘導因子等轉錄因子的高表達[23]。
2 微流控芯片技術在構建軟骨細胞微環境中的應用
微流控芯片又稱芯片實驗室，是指將生物和化學等領域中所涉及的樣品制備、反應、分離、檢測及細胞培養、分選、裂解等基本操作單元集成或基本集成至1 塊幾平方厘米（甚至更小）的芯片上，由微通道形成網絡，其中可控的流體貫穿整個網絡系統，用以取代常規生物或化學實驗室各種功能的一種技術[24]。它是微納米技術的重要組成部分，也是系統生物學研究的主要技術平臺之一[25]。微流控芯片因具有同細胞大小匹配的微米尺寸構件、同生理環境接近的封閉環境、傳質傳熱快和通量高等特點，已成為細胞生物學研究的理想平臺，也為構建細胞自組裝體系和功能化研究提供了一種全新平臺和技術[25]。基于微流控系統對細胞微環境進行探討已成為研究熱點。目前，對于細胞微環境的研究主要涉及生物化學刺激、機械性刺激、基質表面形態刺激、細胞與細胞間的相互作用、電場刺激、磁場和溫度等刺激作用[26]。其中，基于微流控芯片技術對于軟骨細胞及成軟骨分化的研究主要集中于生物化學刺激、機械性刺激及制備仿生材料方面。
2.1 生物化學刺激
生物化學刺激主要包括外部生長因子或其他大分子物質等。Li等[27]設計并制作了一種集成的、濃度梯度可控的微流控芯片平臺，初步探討了IGF-1和bFGF單獨或聯合作用于三維基質培養的兔軟骨細胞增殖的最佳濃度，證實了微流控芯片裝置可作為一種有效的軟骨組織工程研究微平臺。Chao等[28]利用微流控技術在軟骨細胞外產生動態滲透壓變化，用以研究細胞的代謝和內環境穩態。此外，Shi等[29]利用生物微流控技術在1塊水凝膠板上同時引導干細胞特異性向成軟骨細胞和成骨細胞分化，從而模擬骨軟骨界面的梯度變化，該研究表明這種梯度生成微流控裝置在干細胞培養和分化方面具有突出優勢。
2.2 機械性刺激
生理條件下，軟骨細胞所受到的機械性信號刺激主要包括間歇性動態壓應力和組織間隙液流動刺激。應用微流控芯片技術可較容易構建軟骨細胞外的各種機械微環境。Moraes等[30]應用可變的微加工裝置成功構建一種基于三維基質材料的多參數微陣列，并通過微操控技術來實現多條件的壓應力微環境，該微裝置可對軟骨細胞及干細胞成軟骨分化提供良好的機械微環境。Wu等[31]利用微通道下的氣動形變，通過微柱對培養的軟骨細胞施加壓應力，并通過調節氣動微泵閥的強度和頻率形成不同的壓力刺激方式。該研究發現，動態壓力刺激（51.3%應力負荷、1 Hz頻率）可促進軟骨細胞的代謝和糖胺聚糖合成。Zhong等[32-33]利用微流控技術構建了大范圍不同剪切流刺激的微流控裝置，研究表明組織間隙液的流動刺激有利于軟骨細胞外基質的產生，但過強的流動刺激不利于軟骨細胞的生長代謝。Nève等[34]利用微流控和微操控技術不通過直接物理接觸，觀察機械性刺激對于單個懸浮軟骨細胞代謝的影響，結果表明局部或全部的非接觸性刺激可提高軟骨細胞的生存能力，而過度刺激則使細胞失去活性。
2.3 制備仿生材料
利用微流控技術制備更仿生的、適于軟骨生存的支架材料一直受到廣泛關注。Mendes等[35]采用自組裝肽聚糖構成的微流控芯片三維細胞培養裝置，研究軟骨細胞的活力和增殖情況，在體外培養21 d后，發現細胞活力和增殖能力均優于傳統培養條件下的細胞，表明該裝置用于軟骨細胞培養有利于細胞增殖和分化，細胞長期穩定性良好。Lin等[36]制備了一種微流控裝置，該裝置可產生藻酸鹽微珠用以包裹軟骨細胞，并于芯片中灌注培養；通過微流控的操控組裝以及包裹的軟骨細胞密度不同，可形成一緊湊的片狀細胞來模擬軟骨細胞在體內關節軟骨中的分布。Park等[37]也利用微流控裝置產生均一的海藻酸鹽微球，可以很好地包裹軟骨細胞，并在一定程度上使去分化的軟骨細胞重新分化。另外，有研究利用微流控技術生成三維蜂巢樣結構的海藻酸鈉支架，該支架提供了一種利于軟骨細胞生存的微環境，內部的軟骨細胞能夠很好地生存并維持自身表型，并在免疫缺陷鼠體內生成軟骨[38]。
3 展望
微流控芯片目前已成為生物醫學領域研究的前沿和熱點，它從根本上改變了細胞微環境調控的分析方式和效率，在再生醫學領域具有廣闊的應用前景和價值。以微流控芯片為核心的微全分析系統將為軟骨的發育和再生提供諸多優勢和參考信息，有助于構建更接近生理功能的組織工程軟骨，為臨床治療關節軟骨損傷和抑制骨關節炎的發展帶來新希望。
近年來，通過探討關節軟骨內細胞與細胞、細胞與細胞外基質、細胞與周圍物理和化學信號之間的相互作用，從而構建軟骨細胞再生微環境已成為研究熱點[1]。因此，系統深入地認識關節軟骨及軟骨細胞生理條件下的微環境和微結構，從而在體外盡可能地模擬軟骨細胞生存微環境，對于關節軟骨的修復和再生具有重要意義。利用微流控技術可對細胞微環境進行操控和研究，特別是在軟骨修復和再生等方面的優勢已引起學者們廣泛關注。基于上述背景，本文對軟骨細胞生存的微環境以及微流控芯片技術在構建該微環境中的應用作一綜述。
1 軟骨細胞生存的微環境
1.1 細胞外基質微環境
軟骨細胞外基質主要由固相和液相兩部分組成，主要成分為70%～80%水、10%～20%Ⅱ型膠原及5%～10%蛋白多糖[2]。軟骨細胞外基質除對細胞具有支持作用外，當有外力作用時還可影響細胞形態，調節正常細胞的代謝、增殖、遷移和分化以及細胞之間的信號傳遞，為軟骨細胞提供一種特殊的微環境[3]。軟骨細胞外基質內的Ⅱ型膠原蛋白是一種大分子物質，它由3條相似的多肽鏈螺旋排列而成，能使膠原分子承受較大張力。蛋白多糖亞單位由1個核心蛋白和共價連接其上的糖胺多糖組成，稱為蛋白多糖單體；單體再與透明質酸以非共價鍵結合，形成相對分子質量較大的蛋白多糖聚合體。蛋白多糖分布于基質內膠原網之間，可以控制細胞外基質含水量，使關節軟骨具有良好的抗壓能力；同時，蛋白多糖與膠原連接并相互作用，為維持軟骨功能提供有利條件。當細胞外基質的生物化學成分和組織結構發生改變時，關節軟骨的生物力學性能也隨之發生變化。
1.2 機械微環境
在生理條件下，關節軟骨受到的機械負荷主要為壓力，且該負荷為間歇性壓力，由動態壓力和靜態壓力交替完成。關節水平的壓力負荷會造成細胞水平的物理、電離子、生化等多方面改變，包括形變、液體流動、液體靜水壓、流動電勢、滲透壓、營養和離子的濃度梯度以及pH值等[4-5]。此外，相關的力學刺激還有剪切應力、張力和液體靜水壓力等。這些相關的力學刺激會導致細胞外基質內的細胞及細胞核發生相應改變，從而影響軟骨細胞的代謝和功能。
1.2.1 靜態壓力
由于關節軟骨最直接的功能是支持壓力負載，因而靜態壓力主要出現在靜息負重狀態下。軟骨在靜態壓力刺激下處于長時間形變，體外研究表明，軟骨細胞受到長時間靜態壓力刺激后，無論用何種培養方式，均會導致其合成代謝下降，表現為較低增殖率和細胞外基質合成下降[6-8]，并且隨靜態壓力強度增加，其生物合成代謝進一步下降[9]。有學者認為這一過程可能是由細胞和細胞外基質相互作用介導的，例如激活了細胞膜的某種受體[10]。此外，持續形變的細胞外基質會導致組織含水量下降，使軟骨細胞可用性營養成分供給減少。
1.2.2 動態壓力
動態壓力負荷刺激發生于機體日常活動中。相關研究表明，動態壓力負荷刺激（3%～6.8%形變振幅、0.01～0.1 Hz 頻率、作用4～48 h）會促進細胞外基質的合成與沉積[6, 11]。動態壓力對于軟骨細胞的刺激作用具有頻率依賴性，其能促進細胞增殖，但不一定促進細胞外基質合成，這可能與不同的機械信號傳遞機制有關。進一步研究發現，在細胞外基質合成方面，間歇性動態壓力刺激優于持續性動態壓力刺激[12-13]。
1.2.3 剪切應力
剪切應力常出現于關節活動的表面區域，因此也被認為是關節軟骨的一種重要力學刺激。有研究表明，體外動態剪切應力刺激（1%～3%切應變振幅、0.01～1 Hz 頻率，作用24 h）會促進細胞外基質合成[14]，其中促進膠原基質的合成優于促進蛋白多糖的合成。
1.2.4 液體靜水壓力
當軟骨處于負載狀態時，有一初始阻力對抗液體的分散流動，從而導致組織內部液體靜水壓力的產生。液體靜水壓力對于軟骨細胞代謝的調控作用不盡相同。有研究表明，5 MPa的液體靜水壓力刺激能夠提高膠原和蛋白多糖的合成，但也有研究采用相似的液體靜水壓力刺激發現蛋白多糖的合成被抑制[15-16]。
1.2.5 組織間隙液流動微環境
對于健康關節軟骨，大部分組成成分為水，軟骨細胞的代謝和營養傳遞主要通過關節軟骨動態壓縮產生的組織間隙液流動來調控[17]。因此，液體流動效應對于軟骨代謝具有重要影響。關節軟骨的組織間隙液主要由水和電解質組成，其不僅對軟骨細胞和基質具有營養傳遞作用，也會相應產生微小的機械信號刺激。正常生理微環境下，軟骨組織間隙液流動主要存在于關節軟骨淺表層和移行帶，并呈從淺表層至深層液體流動逐漸減少的趨勢。關節軟骨的淺表層受到的液體流動刺激較大，移行層較小，而中間層和深層幾乎無液體流動[18-19]。淺表層對于機械物理信號的刺激最敏感，產生的基質形變也最大，因而其組織間隙液流動也最明顯。
1.3 電場微環境
隨著液相的陽離子流經帶負電荷的蛋白多糖網絡，組織間隙液流動會產生流動電位和電流[20]。這些電場效應也會直接影響軟骨細胞的代謝和分化。有研究表明[21]，電場效應可促進軟骨移植物蛋白合成。也有研究表明，體外單層培養的軟骨細胞經過脈沖電場刺激會促進Ⅱ型膠原和蛋白多糖合成[22]。此外，由于蛋白多糖含有硫酸角質素和硫酸軟骨素糖胺多糖鏈，因此其富含帶負電荷的羧基及硫酸基團。這些負電荷之間產生相互排斥效應，從而使軟骨組織內部保持一種伸展狀態。因此即使軟骨基質未受外部作用力，膠原纖維也處于緊張狀態，以抑制蛋白多糖向外伸展的 力。
1.4 低氧微環境
在微觀結構上關節軟骨細胞內部的線粒體較少，細胞主要靠無氧糖酵解方式來獲取能量，這是它對其所存在低氧環境的一種適應。軟骨基質氧分壓從淺表層至深層逐漸降低，由＜ 10%降至＜ 1%[23]。這種濃度梯度分布在關節發生疾病時會被打亂，軟骨表層的氧分壓也降低，導致軟骨基質受到破壞。有研究發現軟骨細胞在低氧分壓條件下，表現為基質金屬蛋白酶抑制因子1、整合素連接激酶和缺氧誘導因子等轉錄因子的高表達[23]。
2 微流控芯片技術在構建軟骨細胞微環境中的應用
微流控芯片又稱芯片實驗室，是指將生物和化學等領域中所涉及的樣品制備、反應、分離、檢測及細胞培養、分選、裂解等基本操作單元集成或基本集成至1 塊幾平方厘米（甚至更小）的芯片上，由微通道形成網絡，其中可控的流體貫穿整個網絡系統，用以取代常規生物或化學實驗室各種功能的一種技術[24]。它是微納米技術的重要組成部分，也是系統生物學研究的主要技術平臺之一[25]。微流控芯片因具有同細胞大小匹配的微米尺寸構件、同生理環境接近的封閉環境、傳質傳熱快和通量高等特點，已成為細胞生物學研究的理想平臺，也為構建細胞自組裝體系和功能化研究提供了一種全新平臺和技術[25]。基于微流控系統對細胞微環境進行探討已成為研究熱點。目前，對于細胞微環境的研究主要涉及生物化學刺激、機械性刺激、基質表面形態刺激、細胞與細胞間的相互作用、電場刺激、磁場和溫度等刺激作用[26]。其中，基于微流控芯片技術對于軟骨細胞及成軟骨分化的研究主要集中于生物化學刺激、機械性刺激及制備仿生材料方面。
2.1 生物化學刺激
生物化學刺激主要包括外部生長因子或其他大分子物質等。Li等[27]設計并制作了一種集成的、濃度梯度可控的微流控芯片平臺，初步探討了IGF-1和bFGF單獨或聯合作用于三維基質培養的兔軟骨細胞增殖的最佳濃度，證實了微流控芯片裝置可作為一種有效的軟骨組織工程研究微平臺。Chao等[28]利用微流控技術在軟骨細胞外產生動態滲透壓變化，用以研究細胞的代謝和內環境穩態。此外，Shi等[29]利用生物微流控技術在1塊水凝膠板上同時引導干細胞特異性向成軟骨細胞和成骨細胞分化，從而模擬骨軟骨界面的梯度變化，該研究表明這種梯度生成微流控裝置在干細胞培養和分化方面具有突出優勢。
2.2 機械性刺激
生理條件下，軟骨細胞所受到的機械性信號刺激主要包括間歇性動態壓應力和組織間隙液流動刺激。應用微流控芯片技術可較容易構建軟骨細胞外的各種機械微環境。Moraes等[30]應用可變的微加工裝置成功構建一種基于三維基質材料的多參數微陣列，并通過微操控技術來實現多條件的壓應力微環境，該微裝置可對軟骨細胞及干細胞成軟骨分化提供良好的機械微環境。Wu等[31]利用微通道下的氣動形變，通過微柱對培養的軟骨細胞施加壓應力，并通過調節氣動微泵閥的強度和頻率形成不同的壓力刺激方式。該研究發現，動態壓力刺激（51.3%應力負荷、1 Hz頻率）可促進軟骨細胞的代謝和糖胺聚糖合成。Zhong等[32-33]利用微流控技術構建了大范圍不同剪切流刺激的微流控裝置，研究表明組織間隙液的流動刺激有利于軟骨細胞外基質的產生，但過強的流動刺激不利于軟骨細胞的生長代謝。Nève等[34]利用微流控和微操控技術不通過直接物理接觸，觀察機械性刺激對于單個懸浮軟骨細胞代謝的影響，結果表明局部或全部的非接觸性刺激可提高軟骨細胞的生存能力，而過度刺激則使細胞失去活性。
2.3 制備仿生材料
利用微流控技術制備更仿生的、適于軟骨生存的支架材料一直受到廣泛關注。Mendes等[35]采用自組裝肽聚糖構成的微流控芯片三維細胞培養裝置，研究軟骨細胞的活力和增殖情況，在體外培養21 d后，發現細胞活力和增殖能力均優于傳統培養條件下的細胞，表明該裝置用于軟骨細胞培養有利于細胞增殖和分化，細胞長期穩定性良好。Lin等[36]制備了一種微流控裝置，該裝置可產生藻酸鹽微珠用以包裹軟骨細胞，并于芯片中灌注培養；通過微流控的操控組裝以及包裹的軟骨細胞密度不同，可形成一緊湊的片狀細胞來模擬軟骨細胞在體內關節軟骨中的分布。Park等[37]也利用微流控裝置產生均一的海藻酸鹽微球，可以很好地包裹軟骨細胞，并在一定程度上使去分化的軟骨細胞重新分化。另外，有研究利用微流控技術生成三維蜂巢樣結構的海藻酸鈉支架，該支架提供了一種利于軟骨細胞生存的微環境，內部的軟骨細胞能夠很好地生存并維持自身表型，并在免疫缺陷鼠體內生成軟骨[38]。
3 展望
微流控芯片目前已成為生物醫學領域研究的前沿和熱點，它從根本上改變了細胞微環境調控的分析方式和效率，在再生醫學領域具有廣闊的應用前景和價值。以微流控芯片為核心的微全分析系統將為軟骨的發育和再生提供諸多優勢和參考信息，有助于構建更接近生理功能的組織工程軟骨，為臨床治療關節軟骨損傷和抑制骨關節炎的發展帶來新希望。