引用本文： 武沙, 周海琪, 凌慧賢, 雒紫寓, 孫雨嫣, NgoThai Nam Anh, 張長杰, 孔瑛. 低強度脈沖超聲通過初級纖毛調控軟骨細胞. 華西醫學, 2023, 38(6): 835-842. doi: 10.7507/1002-0179.202304182 復制
骨關節炎（osteoarthritis, OA）是一種常見的關節疾病，也是老年人殘疾的主要原因，影響著全球超過 5 億人，從 1990 年到 2019 年，全球受 OA 影響的人數增加了 48%，其中超過 2.6 億人患有膝關節 OA（knee OA, KOA）[1]。KOA 的發生是受遺傳、代謝、生化和生物力學等多種因素影響的[2-4]。以上綜合因素導致膝關節代謝異常，軟骨細胞外基質合成及降解失衡，進而引起關節軟骨變性及負重處關節軟骨面消失，軟骨下骨變性，關節纖維增生，關節邊緣骨贅形成，滑膜非特異性炎癥[5-6]。隨著病程的變化，KOA 可由無癥狀逐漸演變至疼痛，影響患者活動。因此，如何有效延緩其進程是大家研究的熱點。目前對 KOA 的治療主要包括藥物治療、物理治療和手術治療。低強度脈沖超聲（low-intensity pulsed ultrasound, LIPUS）是一種經皮傳遞的非侵入性機械能，因具有機械效應、空化作用、熱效應、化學效應，可在生物器官內產生高頻壓力波，被廣泛應用于臨床。已有研究證實，LIPUS 對力學敏感性較高的骨與軟骨組織的再生有顯著的促進作用[7-9]。然而，LIPUS 作為機械應力波，軟骨細胞是如何感知，而機械應力波又是如何對軟骨細胞的增殖及凋亡產生調控作用，其詳細機制并不是很清楚。有學者發現，初級纖毛存在于大多數哺乳動物細胞類型[10]，是一個以微管作為軸絲，突出于細胞表面的特化細胞結構，具有介導機械、化學信號的作用。軟骨細胞中存在初級纖毛的表達[11-14]。Chang 等[11]將小鼠的纖毛內轉運蛋白（intraflagellar transport, IFT）88 條件性敲除后發現軟骨細胞中初級纖毛缺失，同時關節軟骨 KOA 標志物包括基質金屬蛋白酶 13、血小板反應蛋白解整合素金屬肽酶 5、X 型膠原和 Runt 相關轉錄因子 2 的表達增加，軟骨的硬度也明顯降低，這些都揭示了初級纖毛在軟骨生理學和病理學中的重要性[15-19]。因此，本研究將針對初級纖毛對軟骨細胞的調控作用及 LIPUS 對軟骨基質的合成、軟骨細胞的凋亡產生的調控作用進行研究，嘗試證實軟骨細胞的初級纖毛參與了此調控過程，為臨床 OA 治療靶點提供可能的新思路。
1 材料與方法
1.1 實驗動物與材料
1.1.1 實驗動物
無特定病原體級 C57BL/6J 小鼠，1 周齡，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司。動物許可證號：SYXK（湘）2017-0002。本實驗中應用的所有實驗動物均在中南大學湘雅二醫院實驗動物中心屏障系統內飼養和實驗，本實驗經中南大學湘雅二醫院動物倫理委員會批準（批準編號：2020186），動物研究實驗符合動物倫理和福利指南。
1.1.2 藥物及試劑
抗生素為湖南霈景公司產品；沉默 IFT88 的慢病毒、感染增強劑為加拿大 Applied Biological Materials Inc 公司產品；Ⅱ型膠原（collagen Ⅱ, COLⅡ）酶為美國 Gibco 公司產品；抗乙酰化微管蛋白抗體為美國 Sigma 公司產品；白細胞介素（interleukin, IL）-1β 為美國 Peprotech 公司產品；封閉用羊血清為中國北京中杉金橋生物技術有限公司產品；抗 COLⅡ抗體為中國上海 Abways 公司產品；抗蛋白聚糖（aggrecan, ACAN）抗體、偶聯 Alexa FluorTM 二抗、逆轉錄試劑盒為美國 ThermoFisher 公司產品；實時定量聚合酶鏈反應（quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR）試劑盒為湖南艾科瑞公司產品；細胞凋亡試劑盒為杭州聯科公司產品。
1.1.3 儀器設備
生物安全柜、二氧化碳培養箱、梯度基因擴增儀為美國 Thermo 公司產品；超聲波治療儀為美國梅特勒公司產品；倒置熒光顯微鏡為德國蔡司公司產品；實時熒光定量聚合酶鏈反應儀為美國 BIO-RAD 公司產品。
1.2 研究方法
1.2.1 原代軟骨細胞體外分離與培養
取 1 周齡 C57BL/6J 幼鼠，脫頸處死，取關節軟骨，將軟骨充分剪碎，加入 COLⅡ酶，置于 37℃恒溫搖箱中振蕩消化 4 h 后，終止消化，離心棄上清液，加入 20% 的完全培養基（400 mL Dulbecco 改良 Eagle 培養基+100 mL 胎牛血清+1 mL 抗生素），用無菌巴士管吹打混勻。接種于 75 cm2 培養瓶，置于溫度為 37℃、二氧化碳濃度為 5% 的飽和濕度培養箱內。2 d 后用倒置顯微鏡觀察，更換培養液。
1.2.2 細胞轉染
IFT88 作為初級纖毛合成過程中的必需蛋白，在纖毛的組裝和維護過程中攜帶纖毛構建模塊沿著微管運動。采用攜帶 IFT88 短發卡 RNA 的慢病毒轉染軟骨細胞以沉默 IFT88 基因表達，構建初級纖毛缺失的細胞模型。通過初步感染測試確定目標細胞的有效感染復數，加入合適體積的病毒及感染增強劑來感染目標細胞，在 5% 二氧化碳和 37℃的條件下隔夜溫育。接下來，根據細胞的生長速度，將細胞按 1∶3 的比例傳代，以備使用。
1.2.3 細胞分組及干預
本實驗選用 P3 代軟骨細胞作為實驗對象，將軟骨細胞接種于 12 孔板中 24 h，后加入 IL-1β（10 ng/mL）干預 24 h，給予 LIPUS 刺激。LIPUS 干預劑量均為前期研究獲得的最佳劑量：占空比 20%，頻率為 3 MHz，強度為 20 mW/cm2，20 min/次，1 次/d。實驗分組：正常軟骨細胞組（N 組）、IL-1β 干預軟骨細胞組（OA 組）、IL-1β 干預軟骨細胞+LIPUS 組（OA+U 組）、慢病毒沉默 IFT88+IL-1β 干預軟骨細胞組（KO+OA 組）、慢病毒沉默 IFT88+LIPUS+IL-1β 處理軟骨細胞組（KO+OA+U 組）。
1.2.4 qRT-PCR 檢測 mRNA 表達水平
TRIzol 法提取細胞 RNA，逆轉錄試劑盒將 RNA 逆轉成互補 DNA，按照 qRT-PCR 試劑盒說明書使用逆轉錄后的互補 DNA 樣品進行實驗。引物序列見表1。
表1
引物序列
1.2.5 細胞免疫熒光實驗檢測蛋白表達水平
體外研究中常通過測定 ACAN 和 COLⅡ 的表達水平來評價軟骨細胞外基質的狀態和軟骨質量水平。以組成纖毛軸絲的乙酰化 α-微管蛋白作為纖毛標志物。軟骨細胞用 4% 多聚甲醛固定 10 min。用含 0.5% Triton X-100 及 5% 山羊血清的磷酸鹽緩沖液室溫孵育 1 h 進行透膜及封閉。取乙酰化 α 管一抗（1∶400 稀釋）、COLⅡ一抗（1∶200 稀釋）、ACAN 一抗（1∶200 稀釋）單獨覆蓋各組細胞，在 4℃冰箱孵育過夜。重復洗滌后，樣品與 Alexa Fluor 偶聯的二抗在室溫下孵育 1 h。隨后用抗熒光淬滅劑封片。將樣品置于倒置熒光顯微鏡下觀察，調至對應波長的濾光片，采集圖像。
1.2.6 初級纖毛分析
使用蔡司 Axio Observer 7+Apotome 3 熒光顯微鏡，20 倍物鏡對樣品進行成像。運用 Z-Stack 模式，采集整個細胞深度的圖像，間隔為 0.5 μm。使用 ZEN 軟件生成在 z 軸上的最大強度投影圖像。使用 Image J 統計纖毛發生率。同時用 IFT88 基因表達水平間接反映初級纖毛的表達水平。
1.2.7 流式細胞術檢測細胞凋亡百分率
收集各組細胞于離心管中，離心，磷酸鹽緩沖液重懸細胞并計數；取重懸細胞至流式管中，離心棄上清液；用結合緩沖液重懸細胞，再分別加入異硫氰酸熒光素標記磷脂結合蛋白 Annexin V 和碘化丙啶，室溫下避光孵育 15 min 后上流式細胞儀檢測（BD FACSCanto II），數據由 BD FACSDiva 軟件分析。結果判定：左下象限為正常活細胞，右下象限為早期凋亡細胞，右上象限為中晚期凋亡細胞和壞死細胞。
1.3 統計學方法
采用 GraphPad Prism 9.5 軟件統計作圖。實驗數據以均數±標準差表示，其中兩組間比較采用 t 檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用 Tukey 法。雙側檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 LIPUS 改變 IL-1β 誘導的小鼠軟骨細胞合成基質代謝水平
qRT-PCR 結果顯示：OA 組較 N 組 COL2α1、ACAN 基因的表達水平均顯著下降，而 OA+U 組 COL2α1、ACAN 基因的表達水平較 OA 組有所上升，差異有統計學意義（P<0.05）。見表2。
表2
3 組細胞 COL2α1、ACAN、IFT88 基因相對表達水平及初級纖毛發生率比較（n=3，
）
隨后，用免疫熒光實驗檢測各組軟骨細胞內合成代謝相關蛋白 COLⅡ、ACAN，結果顯示：OA 組較 N 組 COLⅡ、ACAN 的蛋白水平均顯著下降，而 OA+U 組 COLⅡ、ACAN 的蛋白水平較 OA 組有所上升，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖1。
圖1
免疫熒光實驗檢測 3 組軟骨細胞的 COLⅡ、ACAN 蛋白表達水平
COLⅡ：Ⅱ型膠原；ACAN：蛋白聚糖；N 組：正常軟骨細胞組；OA 組：白細胞介素（IL）-1β 干預軟骨細胞組；OA+U 組：低強度脈沖超聲干預+IL-1β 干預軟骨細胞組；紅色熒光標記為 COLⅡ，綠色熒光標記為 ACAN，各組均用藍色熒光標記細胞核；*與 N 組比較，
2.2 LIPUS 改變小鼠 IL-1β 誘導的軟骨細胞凋亡率
運用流式細胞術上機檢測軟骨細胞凋亡率，結果顯示：軟骨細胞經過 IL-1β 干預后，OA 組的凋亡率較 N 組顯著增加，LIPUS 干預后，OA+U 組的凋亡率呈減少趨勢。見圖2。
圖2
流式細胞術檢測 3 組軟骨細胞的凋亡水平
N 組：正常軟骨細胞組；OA 組：白細胞介素（IL）-1β 干預軟骨細胞組；OA+U 組：低強度脈沖超聲干預+IL-1β 干預軟骨細胞組；結果判定：左下象限為正常活細胞，右下象限為早期凋亡細胞，右上象限為中晚期凋亡細胞和壞死細胞
2.3 LIPUS 參與調控 IL-1β 誘導的小鼠軟骨細胞的初級纖毛表達
免疫熒光實驗結果顯示：OA 組初級纖毛發生率較 N 組下降，OA+U 組初級纖毛發生率較 OA 組有所上升，差異有統計學意義（P<0.05）。見表2。
qRT-PCR 檢測各組纖毛組裝必需的 IFT88 基因的表達水平，結果顯示：OA 組較 N 組 IFT88 的基因表達水平顯著下降（P<0.05）；LIPUS 干預后，OA+U 組 IFT88 的基因表達水平較 OA 組差異無統計學意義（P>0.05）。見表2。
2.4 構建 IFT88 短發卡 RNA 致 IFT88 基因沉默模型
用 qRT-PCR 檢測用攜帶 IFT88 短發卡 RNA 的慢病毒轉染后 IFT88 的表達，用免疫熒光實驗檢測初級纖毛發生率，結果顯示，N 組 IFT88 相對表達水平為 0.74±0.05，慢病毒轉染小鼠軟骨細胞后，KO+N 組相對表達水平為 0.20±0.10，較 N 組顯著下降（P<0.05，各組 n=3）；N 組初級纖毛發生率為 0.76±0.02，KO+N 組初級纖毛發生率為 0.19±0.00，較 N 組顯著下降，差異有統計學意義（P<0.05，各組 n=3），表明慢病毒轉染成功敲低 IFT88 表達，得到初級纖毛缺失模型。
2.5 初級纖毛參與 LIPUS 對軟骨細胞合成基質的調控過程
免疫熒光實驗結果顯示：LIPUS 干預后，KO+OA+U 組較 OA+U 組 COLⅡ、ACAN 蛋白水平均下降，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖3。
圖3
免疫熒光實驗檢測 4 組軟骨細胞 COLⅡ、ACAN 蛋白表達水平
COLⅡ：Ⅱ型膠原；ACAN：蛋白聚糖；OA 組：白細胞介素（IL）-1β 干預軟骨細胞組；OA+U 組：低強度脈沖超聲（LIPUS）干預+IL-1β 干預軟骨細胞組；KO+OA 組：慢病毒沉默
qRT-PCR 結果顯示：LIPUS 干預后，KO+OA+U 組較 OA+U 組 COL2α1、ACAN 基因的表達水平均顯著下降，差異有統計學意義（P<0.05）。見表3。
表3
4 組軟骨細胞 COL2α1、ACAN mRNA 相對表達水平（n=3，
）
2.6 初級纖毛參與 LIPUS 對軟骨細胞凋亡的調控過程
運用流式細胞術上機檢測軟骨細胞凋亡率，結果顯示：LIPUS 干預后，KO+OA+U 組較 OA+U 組凋亡率上升。見圖4。
圖4
流式細胞術檢測 4 組軟骨細胞的凋亡水平
OA 組：白細胞介素（IL）-1β 干預軟骨細胞組；OA+U 組：低強度脈沖超聲（LIPUS）干預+IL-1β 干預軟骨細胞組；KO+OA 組：慢病毒沉默
3 討論
OA 是一種由關節組織修復和破壞之間的不平衡引起的主動動態改變，而不是通常描述的被動退行性疾病或所謂的磨損疾病。關節軟骨是一種機械敏感組織，在不恰當的負荷等多種病理刺激下，細胞外基質逐漸降解，隨之引起軟骨組織的受力不均衡，進而引起軟骨細胞凋亡。軟骨細胞作為軟骨組織中唯一存在的細胞，可感受外界刺激，并作出相應的反應，是維持細胞內外環境穩定的關鍵因素。軟骨細胞的形態、數量對細胞外基質分泌及合成具有重要的作用，軟骨細胞凋亡最終將導致 OA 的發生[20]。本研究僅探討 IL-1β 誘導的炎癥反應引發或模擬的 OA[21-22]。LIPUS 是一種經皮傳遞的非侵入性治療方法，以較低的能量強度以及脈沖波形式輸出為特點，可在生物器官內產生熱效應、空化效應及機械效應，通過調控基因表達、細胞信號轉導、影響酶活性、細胞增殖和分化、細胞因子分泌、血管生成和干細胞分化等途徑發揮抗炎、止痛等作用[23]。超聲波的振幅決定了 LIPUS 信號的強度[24-27]。低強度下應用 LIPUS 不會引起生理應激，作用 10 min 后，溫度僅升高 0.5℃[28-29]。LIPUS 治療作用主要依賴于其非熱效應，具有無創、廉價、便攜、療效明顯等優點，目前在臨床中被廣泛應用。LIPUS 最早用于臨床診斷，包括重要臟器、胎兒發育以及骨折愈合過程中骨痂生長情況的評估，后來其被發現對力學敏感性較高的骨與軟骨組織的再生有顯著的促進作用，進而逐漸應用于骨與軟骨的治療[30-31]。研究認為其主要通過空化、聲流和納米尺度的微運動以流體剪切應力和機械刺激的形式傳遞到細胞和組織[23]。LIPUS 促進 ACAN 合成[7]，改善大鼠和兔 OA 模型體內受損關節軟骨的形態學和組織學外觀[8-9]。Sang 等[32]研究顯示 LIPUS 通過調節局灶性黏附激酶 FAK 信號通路促進軟骨細胞增殖和分化。在本研究中，我們同樣觀察到 LIPUS 可以調控軟骨細胞外基質蛋白的合成，如 COLⅡ和 ACAN。
LIPUS 是如何被軟骨細胞感知的，并參與軟骨細胞及細胞外基質的調控的？我們考慮初級纖毛參與其中。初級纖毛是以中心體作為基體并突出于細胞膜表面的一種特化的細胞結構，存在于絕大多數休眠期以及已分化的哺乳動物細胞，能感受微環境中各種理化刺激，參與多種信號通路轉導，使細胞對外界變化作出適應性反應。而軟骨細胞初級纖毛是機械敏感的，在感知流體剪切應力和機械刺激中起著重要作用[33-34]。纖毛的組裝主要依賴于 IFT 復合物，IFT88 作為初級纖毛合成過程中的必需蛋白，在纖毛的組裝和維護過程中攜帶纖毛構建模塊沿著微管運動。此外，IFT88 的條件性缺失被用于研究細胞或組織特異性的初級纖毛功能[35]。本研究運用 qRT-PCR 檢測了 IFT88 的基因表達水平，運用細胞免疫熒光實驗檢測了初級纖毛的發生率，發現 LIPUS 干預使 IL-1β 干預后的軟骨細胞初級纖毛表達升高，初級纖毛長度縮短，說明 LIPUS 可以調控軟骨細胞初級纖毛的表達。與本研究結果類似的是，Matsumoto 等[34]發現 LIPUS 增加了骨折部位原發性纖毛的數量，刺激了成骨細胞樣細胞系 MC3T3-E1 細胞中初級纖毛的數量和長度，還刺激了纖毛蛋白、IFT88 mRNA 的水平。Huang 等[36]使用 LIPUS 刺激 3 h 顯著降低了培養神經元纖毛的發生率和長度，增加 LIPUS 刺激的持續時間和強度也會降低纖毛的發生率和長度。Subramanian 等[37]研究表明，初級纖毛在低強度超聲作用下被拉長、彎曲，且這些變化是可逆的。Oh 等[38]研究高強度聚焦超聲發現，其降低了脂肪源性干細胞中纖毛解體相關因子（AurA 和 HDAC9）的表達，增加了皮下脂肪組織中纖毛組裝相關因子（KIF3A 和 IFT88）的表達。綜上，軟骨細胞、成骨細胞、神經元及干細胞等的初級纖毛表達受到 LIPUS 等機械刺激的調控。
由此，我們推測超聲波是通過初級纖毛對軟骨細胞的合成基質及凋亡產生調控作用的。為了進一步驗證這一推測，將軟骨細胞 IFT88 沉默后，觀察 LIPUS 對軟骨細胞合成基質水平及細胞凋亡的調控是否會改變，結果顯示：經過 IL-1β 誘導的小鼠軟骨細胞，LIPUS 干預引起的增高合成代謝基質表達、降低凋亡的作用被慢病毒沉默 IFT88 抑制，說明 IFT88 可能參與 LIPUS 對 IL-1β 誘導的小鼠軟骨細胞保護作用的調控過程。這樣的結果表明初級纖毛在 LIPUS 的軟骨保護作用中有著至關重要的作用。與我們的結果類似的是，Xiao 等[30]的研究表明 LIPUS 是主要通過促進初級纖毛的表達來增強 Prrx1+細胞（骨膜中骨軟骨祖細胞的主要群體）的成骨分化。機械負荷通過 HDAC6 和 IFT 依賴機制調節初生纖毛伸長，抑制軟骨炎癥信號[39]。LIPUS 促進股骨缺損再生，增強 Prrx1+細胞成骨分化。然而，當 Prrx1+細胞的初級纖毛被敲除時，這些作用顯著減弱[30, 40]。敲除纖毛組裝相關因子 KIF3A，引起初級纖毛的破壞，顯著減少了在機械刺激下形成的骨數量[41]。LIPUS 或其他機械刺激發揮促進軟骨合成及成骨作用，而當初級纖毛被敲除時，這些作用顯著減弱，說明這些作用都離不開初級纖毛這一中間環節。
然而，本研究也有一些局限性。首先，本研究主要為體外實驗，僅從細胞層面證實 LIPUS 是通過初級纖毛來實現治療 OA 的作用。但應該注意的是，在體外含水環境中，超聲的聲空化和流動效應可能占主導地位，并且預計不會有大量的加熱，但當在體內進行治療時，LIPUS 的治療機制和在體外含水環境中的作用機制可能并不相同[42]。因此，需要我們進一步研究體內和體外實驗的治療機制是否相同。其次，雖然本研究顯示 LIPUS 可以通過影響初級纖毛的功能來治療 OA，但初級纖毛是如何將細胞外刺激轉化為細胞內信號，進而調節軟骨細胞外基質的合成代謝，這其中具體的細胞分子機制仍缺乏相關驗證，需要我們進一步的探索。
綜上所述，LIPUS 作為一種非侵入性療法，具有治療 OA 的作用，并且可能是通過影響初級纖毛的結構和功能來調控軟骨基質合成蛋白的表達，如促進 COLⅡ和 ACAN 的表達。后續我們應該進一步在動物模型上進行驗證并探索 LIPUS 具體的治療機制，以期為 OA 的干預提供一個潛在的治療靶點。
利益沖突：所有作者聲明不存在利益沖突。
骨關節炎（osteoarthritis, OA）是一種常見的關節疾病，也是老年人殘疾的主要原因，影響著全球超過 5 億人，從 1990 年到 2019 年，全球受 OA 影響的人數增加了 48%，其中超過 2.6 億人患有膝關節 OA（knee OA, KOA）[1]。KOA 的發生是受遺傳、代謝、生化和生物力學等多種因素影響的[2-4]。以上綜合因素導致膝關節代謝異常，軟骨細胞外基質合成及降解失衡，進而引起關節軟骨變性及負重處關節軟骨面消失，軟骨下骨變性，關節纖維增生，關節邊緣骨贅形成，滑膜非特異性炎癥[5-6]。隨著病程的變化，KOA 可由無癥狀逐漸演變至疼痛，影響患者活動。因此，如何有效延緩其進程是大家研究的熱點。目前對 KOA 的治療主要包括藥物治療、物理治療和手術治療。低強度脈沖超聲（low-intensity pulsed ultrasound, LIPUS）是一種經皮傳遞的非侵入性機械能，因具有機械效應、空化作用、熱效應、化學效應，可在生物器官內產生高頻壓力波，被廣泛應用于臨床。已有研究證實，LIPUS 對力學敏感性較高的骨與軟骨組織的再生有顯著的促進作用[7-9]。然而，LIPUS 作為機械應力波，軟骨細胞是如何感知，而機械應力波又是如何對軟骨細胞的增殖及凋亡產生調控作用，其詳細機制并不是很清楚。有學者發現，初級纖毛存在于大多數哺乳動物細胞類型[10]，是一個以微管作為軸絲，突出于細胞表面的特化細胞結構，具有介導機械、化學信號的作用。軟骨細胞中存在初級纖毛的表達[11-14]。Chang 等[11]將小鼠的纖毛內轉運蛋白（intraflagellar transport, IFT）88 條件性敲除后發現軟骨細胞中初級纖毛缺失，同時關節軟骨 KOA 標志物包括基質金屬蛋白酶 13、血小板反應蛋白解整合素金屬肽酶 5、X 型膠原和 Runt 相關轉錄因子 2 的表達增加，軟骨的硬度也明顯降低，這些都揭示了初級纖毛在軟骨生理學和病理學中的重要性[15-19]。因此，本研究將針對初級纖毛對軟骨細胞的調控作用及 LIPUS 對軟骨基質的合成、軟骨細胞的凋亡產生的調控作用進行研究，嘗試證實軟骨細胞的初級纖毛參與了此調控過程，為臨床 OA 治療靶點提供可能的新思路。
1 材料與方法
1.1 實驗動物與材料
1.1.1 實驗動物
無特定病原體級 C57BL/6J 小鼠，1 周齡，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司。動物許可證號：SYXK（湘）2017-0002。本實驗中應用的所有實驗動物均在中南大學湘雅二醫院實驗動物中心屏障系統內飼養和實驗，本實驗經中南大學湘雅二醫院動物倫理委員會批準（批準編號：2020186），動物研究實驗符合動物倫理和福利指南。
1.1.2 藥物及試劑
抗生素為湖南霈景公司產品；沉默 IFT88 的慢病毒、感染增強劑為加拿大 Applied Biological Materials Inc 公司產品；Ⅱ型膠原（collagen Ⅱ, COLⅡ）酶為美國 Gibco 公司產品；抗乙酰化微管蛋白抗體為美國 Sigma 公司產品；白細胞介素（interleukin, IL）-1β 為美國 Peprotech 公司產品；封閉用羊血清為中國北京中杉金橋生物技術有限公司產品；抗 COLⅡ抗體為中國上海 Abways 公司產品；抗蛋白聚糖（aggrecan, ACAN）抗體、偶聯 Alexa FluorTM 二抗、逆轉錄試劑盒為美國 ThermoFisher 公司產品；實時定量聚合酶鏈反應（quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR）試劑盒為湖南艾科瑞公司產品；細胞凋亡試劑盒為杭州聯科公司產品。
1.1.3 儀器設備
生物安全柜、二氧化碳培養箱、梯度基因擴增儀為美國 Thermo 公司產品；超聲波治療儀為美國梅特勒公司產品；倒置熒光顯微鏡為德國蔡司公司產品；實時熒光定量聚合酶鏈反應儀為美國 BIO-RAD 公司產品。
1.2 研究方法
1.2.1 原代軟骨細胞體外分離與培養
取 1 周齡 C57BL/6J 幼鼠，脫頸處死，取關節軟骨，將軟骨充分剪碎，加入 COLⅡ酶，置于 37℃恒溫搖箱中振蕩消化 4 h 后，終止消化，離心棄上清液，加入 20% 的完全培養基（400 mL Dulbecco 改良 Eagle 培養基+100 mL 胎牛血清+1 mL 抗生素），用無菌巴士管吹打混勻。接種于 75 cm2 培養瓶，置于溫度為 37℃、二氧化碳濃度為 5% 的飽和濕度培養箱內。2 d 后用倒置顯微鏡觀察，更換培養液。
1.2.2 細胞轉染
IFT88 作為初級纖毛合成過程中的必需蛋白，在纖毛的組裝和維護過程中攜帶纖毛構建模塊沿著微管運動。采用攜帶 IFT88 短發卡 RNA 的慢病毒轉染軟骨細胞以沉默 IFT88 基因表達，構建初級纖毛缺失的細胞模型。通過初步感染測試確定目標細胞的有效感染復數，加入合適體積的病毒及感染增強劑來感染目標細胞，在 5% 二氧化碳和 37℃的條件下隔夜溫育。接下來，根據細胞的生長速度，將細胞按 1∶3 的比例傳代，以備使用。
1.2.3 細胞分組及干預
本實驗選用 P3 代軟骨細胞作為實驗對象，將軟骨細胞接種于 12 孔板中 24 h，后加入 IL-1β（10 ng/mL）干預 24 h，給予 LIPUS 刺激。LIPUS 干預劑量均為前期研究獲得的最佳劑量：占空比 20%，頻率為 3 MHz，強度為 20 mW/cm2，20 min/次，1 次/d。實驗分組：正常軟骨細胞組（N 組）、IL-1β 干預軟骨細胞組（OA 組）、IL-1β 干預軟骨細胞+LIPUS 組（OA+U 組）、慢病毒沉默 IFT88+IL-1β 干預軟骨細胞組（KO+OA 組）、慢病毒沉默 IFT88+LIPUS+IL-1β 處理軟骨細胞組（KO+OA+U 組）。
1.2.4 qRT-PCR 檢測 mRNA 表達水平
TRIzol 法提取細胞 RNA，逆轉錄試劑盒將 RNA 逆轉成互補 DNA，按照 qRT-PCR 試劑盒說明書使用逆轉錄后的互補 DNA 樣品進行實驗。引物序列見表1。
表1
引物序列
1.2.5 細胞免疫熒光實驗檢測蛋白表達水平
體外研究中常通過測定 ACAN 和 COLⅡ 的表達水平來評價軟骨細胞外基質的狀態和軟骨質量水平。以組成纖毛軸絲的乙酰化 α-微管蛋白作為纖毛標志物。軟骨細胞用 4% 多聚甲醛固定 10 min。用含 0.5% Triton X-100 及 5% 山羊血清的磷酸鹽緩沖液室溫孵育 1 h 進行透膜及封閉。取乙酰化 α 管一抗（1∶400 稀釋）、COLⅡ一抗（1∶200 稀釋）、ACAN 一抗（1∶200 稀釋）單獨覆蓋各組細胞，在 4℃冰箱孵育過夜。重復洗滌后，樣品與 Alexa Fluor 偶聯的二抗在室溫下孵育 1 h。隨后用抗熒光淬滅劑封片。將樣品置于倒置熒光顯微鏡下觀察，調至對應波長的濾光片，采集圖像。
1.2.6 初級纖毛分析
使用蔡司 Axio Observer 7+Apotome 3 熒光顯微鏡，20 倍物鏡對樣品進行成像。運用 Z-Stack 模式，采集整個細胞深度的圖像，間隔為 0.5 μm。使用 ZEN 軟件生成在 z 軸上的最大強度投影圖像。使用 Image J 統計纖毛發生率。同時用 IFT88 基因表達水平間接反映初級纖毛的表達水平。
1.2.7 流式細胞術檢測細胞凋亡百分率
收集各組細胞于離心管中，離心，磷酸鹽緩沖液重懸細胞并計數；取重懸細胞至流式管中，離心棄上清液；用結合緩沖液重懸細胞，再分別加入異硫氰酸熒光素標記磷脂結合蛋白 Annexin V 和碘化丙啶，室溫下避光孵育 15 min 后上流式細胞儀檢測（BD FACSCanto II），數據由 BD FACSDiva 軟件分析。結果判定：左下象限為正常活細胞，右下象限為早期凋亡細胞，右上象限為中晚期凋亡細胞和壞死細胞。
1.3 統計學方法
采用 GraphPad Prism 9.5 軟件統計作圖。實驗數據以均數±標準差表示，其中兩組間比較采用 t 檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用 Tukey 法。雙側檢驗水準 α=0.05。
2 結果
2.1 LIPUS 改變 IL-1β 誘導的小鼠軟骨細胞合成基質代謝水平
qRT-PCR 結果顯示：OA 組較 N 組 COL2α1、ACAN 基因的表達水平均顯著下降，而 OA+U 組 COL2α1、ACAN 基因的表達水平較 OA 組有所上升，差異有統計學意義（P<0.05）。見表2。
表2
3 組細胞 COL2α1、ACAN、IFT88 基因相對表達水平及初級纖毛發生率比較（n=3，）
隨后，用免疫熒光實驗檢測各組軟骨細胞內合成代謝相關蛋白 COLⅡ、ACAN，結果顯示：OA 組較 N 組 COLⅡ、ACAN 的蛋白水平均顯著下降，而 OA+U 組 COLⅡ、ACAN 的蛋白水平較 OA 組有所上升，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖1。
圖1
免疫熒光實驗檢測 3 組軟骨細胞的 COLⅡ、ACAN 蛋白表達水平
COLⅡ：Ⅱ型膠原；ACAN：蛋白聚糖；N 組：正常軟骨細胞組；OA 組：白細胞介素（IL）-1β 干預軟骨細胞組；OA+U 組：低強度脈沖超聲干預+IL-1β 干預軟骨細胞組；紅色熒光標記為 COLⅡ，綠色熒光標記為 ACAN，各組均用藍色熒光標記細胞核；*與 N 組比較，
2.2 LIPUS 改變小鼠 IL-1β 誘導的軟骨細胞凋亡率
運用流式細胞術上機檢測軟骨細胞凋亡率，結果顯示：軟骨細胞經過 IL-1β 干預后，OA 組的凋亡率較 N 組顯著增加，LIPUS 干預后，OA+U 組的凋亡率呈減少趨勢。見圖2。
圖2
流式細胞術檢測 3 組軟骨細胞的凋亡水平
N 組：正常軟骨細胞組；OA 組：白細胞介素（IL）-1β 干預軟骨細胞組；OA+U 組：低強度脈沖超聲干預+IL-1β 干預軟骨細胞組；結果判定：左下象限為正常活細胞，右下象限為早期凋亡細胞，右上象限為中晚期凋亡細胞和壞死細胞
2.3 LIPUS 參與調控 IL-1β 誘導的小鼠軟骨細胞的初級纖毛表達
免疫熒光實驗結果顯示：OA 組初級纖毛發生率較 N 組下降，OA+U 組初級纖毛發生率較 OA 組有所上升，差異有統計學意義（P<0.05）。見表2。
qRT-PCR 檢測各組纖毛組裝必需的 IFT88 基因的表達水平，結果顯示：OA 組較 N 組 IFT88 的基因表達水平顯著下降（P<0.05）；LIPUS 干預后，OA+U 組 IFT88 的基因表達水平較 OA 組差異無統計學意義（P>0.05）。見表2。
2.4 構建 IFT88 短發卡 RNA 致 IFT88 基因沉默模型
用 qRT-PCR 檢測用攜帶 IFT88 短發卡 RNA 的慢病毒轉染后 IFT88 的表達，用免疫熒光實驗檢測初級纖毛發生率，結果顯示，N 組 IFT88 相對表達水平為 0.74±0.05，慢病毒轉染小鼠軟骨細胞后，KO+N 組相對表達水平為 0.20±0.10，較 N 組顯著下降（P<0.05，各組 n=3）；N 組初級纖毛發生率為 0.76±0.02，KO+N 組初級纖毛發生率為 0.19±0.00，較 N 組顯著下降，差異有統計學意義（P<0.05，各組 n=3），表明慢病毒轉染成功敲低 IFT88 表達，得到初級纖毛缺失模型。
2.5 初級纖毛參與 LIPUS 對軟骨細胞合成基質的調控過程
免疫熒光實驗結果顯示：LIPUS 干預后，KO+OA+U 組較 OA+U 組 COLⅡ、ACAN 蛋白水平均下降，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖3。
圖3
免疫熒光實驗檢測 4 組軟骨細胞 COLⅡ、ACAN 蛋白表達水平
COLⅡ：Ⅱ型膠原；ACAN：蛋白聚糖；OA 組：白細胞介素（IL）-1β 干預軟骨細胞組；OA+U 組：低強度脈沖超聲（LIPUS）干預+IL-1β 干預軟骨細胞組；KO+OA 組：慢病毒沉默
qRT-PCR 結果顯示：LIPUS 干預后，KO+OA+U 組較 OA+U 組 COL2α1、ACAN 基因的表達水平均顯著下降，差異有統計學意義（P<0.05）。見表3。
表3
4 組軟骨細胞 COL2α1、ACAN mRNA 相對表達水平（n=3，）
2.6 初級纖毛參與 LIPUS 對軟骨細胞凋亡的調控過程
運用流式細胞術上機檢測軟骨細胞凋亡率，結果顯示：LIPUS 干預后，KO+OA+U 組較 OA+U 組凋亡率上升。見圖4。
圖4
流式細胞術檢測 4 組軟骨細胞的凋亡水平
OA 組：白細胞介素（IL）-1β 干預軟骨細胞組；OA+U 組：低強度脈沖超聲（LIPUS）干預+IL-1β 干預軟骨細胞組；KO+OA 組：慢病毒沉默
3 討論
OA 是一種由關節組織修復和破壞之間的不平衡引起的主動動態改變，而不是通常描述的被動退行性疾病或所謂的磨損疾病。關節軟骨是一種機械敏感組織，在不恰當的負荷等多種病理刺激下，細胞外基質逐漸降解，隨之引起軟骨組織的受力不均衡，進而引起軟骨細胞凋亡。軟骨細胞作為軟骨組織中唯一存在的細胞，可感受外界刺激，并作出相應的反應，是維持細胞內外環境穩定的關鍵因素。軟骨細胞的形態、數量對細胞外基質分泌及合成具有重要的作用，軟骨細胞凋亡最終將導致 OA 的發生[20]。本研究僅探討 IL-1β 誘導的炎癥反應引發或模擬的 OA[21-22]。LIPUS 是一種經皮傳遞的非侵入性治療方法，以較低的能量強度以及脈沖波形式輸出為特點，可在生物器官內產生熱效應、空化效應及機械效應，通過調控基因表達、細胞信號轉導、影響酶活性、細胞增殖和分化、細胞因子分泌、血管生成和干細胞分化等途徑發揮抗炎、止痛等作用[23]。超聲波的振幅決定了 LIPUS 信號的強度[24-27]。低強度下應用 LIPUS 不會引起生理應激，作用 10 min 后，溫度僅升高 0.5℃[28-29]。LIPUS 治療作用主要依賴于其非熱效應，具有無創、廉價、便攜、療效明顯等優點，目前在臨床中被廣泛應用。LIPUS 最早用于臨床診斷，包括重要臟器、胎兒發育以及骨折愈合過程中骨痂生長情況的評估，后來其被發現對力學敏感性較高的骨與軟骨組織的再生有顯著的促進作用，進而逐漸應用于骨與軟骨的治療[30-31]。研究認為其主要通過空化、聲流和納米尺度的微運動以流體剪切應力和機械刺激的形式傳遞到細胞和組織[23]。LIPUS 促進 ACAN 合成[7]，改善大鼠和兔 OA 模型體內受損關節軟骨的形態學和組織學外觀[8-9]。Sang 等[32]研究顯示 LIPUS 通過調節局灶性黏附激酶 FAK 信號通路促進軟骨細胞增殖和分化。在本研究中，我們同樣觀察到 LIPUS 可以調控軟骨細胞外基質蛋白的合成，如 COLⅡ和 ACAN。
LIPUS 是如何被軟骨細胞感知的，并參與軟骨細胞及細胞外基質的調控的？我們考慮初級纖毛參與其中。初級纖毛是以中心體作為基體并突出于細胞膜表面的一種特化的細胞結構，存在于絕大多數休眠期以及已分化的哺乳動物細胞，能感受微環境中各種理化刺激，參與多種信號通路轉導，使細胞對外界變化作出適應性反應。而軟骨細胞初級纖毛是機械敏感的，在感知流體剪切應力和機械刺激中起著重要作用[33-34]。纖毛的組裝主要依賴于 IFT 復合物，IFT88 作為初級纖毛合成過程中的必需蛋白，在纖毛的組裝和維護過程中攜帶纖毛構建模塊沿著微管運動。此外，IFT88 的條件性缺失被用于研究細胞或組織特異性的初級纖毛功能[35]。本研究運用 qRT-PCR 檢測了 IFT88 的基因表達水平，運用細胞免疫熒光實驗檢測了初級纖毛的發生率，發現 LIPUS 干預使 IL-1β 干預后的軟骨細胞初級纖毛表達升高，初級纖毛長度縮短，說明 LIPUS 可以調控軟骨細胞初級纖毛的表達。與本研究結果類似的是，Matsumoto 等[34]發現 LIPUS 增加了骨折部位原發性纖毛的數量，刺激了成骨細胞樣細胞系 MC3T3-E1 細胞中初級纖毛的數量和長度，還刺激了纖毛蛋白、IFT88 mRNA 的水平。Huang 等[36]使用 LIPUS 刺激 3 h 顯著降低了培養神經元纖毛的發生率和長度，增加 LIPUS 刺激的持續時間和強度也會降低纖毛的發生率和長度。Subramanian 等[37]研究表明，初級纖毛在低強度超聲作用下被拉長、彎曲，且這些變化是可逆的。Oh 等[38]研究高強度聚焦超聲發現，其降低了脂肪源性干細胞中纖毛解體相關因子（AurA 和 HDAC9）的表達，增加了皮下脂肪組織中纖毛組裝相關因子（KIF3A 和 IFT88）的表達。綜上，軟骨細胞、成骨細胞、神經元及干細胞等的初級纖毛表達受到 LIPUS 等機械刺激的調控。
由此，我們推測超聲波是通過初級纖毛對軟骨細胞的合成基質及凋亡產生調控作用的。為了進一步驗證這一推測，將軟骨細胞 IFT88 沉默后，觀察 LIPUS 對軟骨細胞合成基質水平及細胞凋亡的調控是否會改變，結果顯示：經過 IL-1β 誘導的小鼠軟骨細胞，LIPUS 干預引起的增高合成代謝基質表達、降低凋亡的作用被慢病毒沉默 IFT88 抑制，說明 IFT88 可能參與 LIPUS 對 IL-1β 誘導的小鼠軟骨細胞保護作用的調控過程。這樣的結果表明初級纖毛在 LIPUS 的軟骨保護作用中有著至關重要的作用。與我們的結果類似的是，Xiao 等[30]的研究表明 LIPUS 是主要通過促進初級纖毛的表達來增強 Prrx1+細胞（骨膜中骨軟骨祖細胞的主要群體）的成骨分化。機械負荷通過 HDAC6 和 IFT 依賴機制調節初生纖毛伸長，抑制軟骨炎癥信號[39]。LIPUS 促進股骨缺損再生，增強 Prrx1+細胞成骨分化。然而，當 Prrx1+細胞的初級纖毛被敲除時，這些作用顯著減弱[30, 40]。敲除纖毛組裝相關因子 KIF3A，引起初級纖毛的破壞，顯著減少了在機械刺激下形成的骨數量[41]。LIPUS 或其他機械刺激發揮促進軟骨合成及成骨作用，而當初級纖毛被敲除時，這些作用顯著減弱，說明這些作用都離不開初級纖毛這一中間環節。
然而，本研究也有一些局限性。首先，本研究主要為體外實驗，僅從細胞層面證實 LIPUS 是通過初級纖毛來實現治療 OA 的作用。但應該注意的是，在體外含水環境中，超聲的聲空化和流動效應可能占主導地位，并且預計不會有大量的加熱，但當在體內進行治療時，LIPUS 的治療機制和在體外含水環境中的作用機制可能并不相同[42]。因此，需要我們進一步研究體內和體外實驗的治療機制是否相同。其次，雖然本研究顯示 LIPUS 可以通過影響初級纖毛的功能來治療 OA，但初級纖毛是如何將細胞外刺激轉化為細胞內信號，進而調節軟骨細胞外基質的合成代謝，這其中具體的細胞分子機制仍缺乏相關驗證，需要我們進一步的探索。
綜上所述，LIPUS 作為一種非侵入性療法，具有治療 OA 的作用，并且可能是通過影響初級纖毛的結構和功能來調控軟骨基質合成蛋白的表達，如促進 COLⅡ和 ACAN 的表達。后續我們應該進一步在動物模型上進行驗證并探索 LIPUS 具體的治療機制，以期為 OA 的干預提供一個潛在的治療靶點。
利益沖突：所有作者聲明不存在利益沖突。
